WYKRYWANIE

MUTACJI

RFLP

(Restriction

Fragment-

Lenght Polymorphism)

Polimorfizm Długości

Fragmentów Restrykcyjnych

Wykrywanie mutacji

w produktach PCR
pociętych
restryktazami, a
następnie
poddanych
elektroforezie w
żelu agarozowym
lub
poliakrylamidowy
m

SSCP

(single strand

conformation

polimorphism )

Polimorfizm

konformacyjny

jednoniciowego DNA

Metoda służąca do badania

polimorfizmu

konformacyjnego

jednoniciowych

cząsteczek DNA, (różnic

powstałych w wyniku

tworzenia odmiennych

struktur

trójwymiarowych przez

jednoniciowe cząsteczki

DNA, normalne i

zmutowane tego

samego fragmentu

łańcucha

polinukleotydowego)

dzięki wykorzystaniu

elektroforezy.

HET – analiza

heterodupleksów

DGGE

(Denaturing gradient gel

electrophoresis)

Elektroforeza na Żelach

z Gradientem Czynnika

Denaturującego

Metoda polegająca

na wykryciu

mutacji za

pomocą

elektroforezy na

żelu z

wzrastającym

stężeniem

czynnika

denaturującego,

np. formamidu.

Fragmenty DNA

zawierające

mutacje ulegają

denaturacji przy

innym stężeniu

formamidu niż

nić prawidłowa

Metoda Southern`a

Metoda ta służy do wykrywania

dużych zmian w obrębie

genomu. Aby ją wykonać,

należy przeprowadzić

elektroforetyczne rozdzielenie

mieszaniny fragmentów DNA

(np. po cięciu enzymami

restrykcyjnymi), a następnie.

umieścić w alkalicznym

buforze, który wywoła

denaturację DNA. Następnie

całość przenosi się na błonę

nylonową. Po odpowiednim

spreparowaniu błony

nylonowej z DNA wykonuje się

hybrydyzację z sondą, a

następnie przy pomocy

odpowiedniej metody detekcji

uwidacznia się interesujące

nas fragmenty DNA.

ASO

(

Allele Specific

Oligonucleotide

hybridization)

Hybrydyzacja

Oligonukleotydu

Specyficznego względem

Allelu

Metoda, w której

wykorzystuje się

oligonukleotydy, z

których jeden jest

komplementarny do

genu prawidłowego, a

drugi do fragmentu o

znanej mutacji tego

genu. Wykorzystuje

się ją do badań

przesiewowych

anemii

sierpowatokrwinkowej

Sekwencjonowanie

Najbardziej czuła

metoda w

wykrywaniu

zmian w

materiale

genetycznym

umożliwiająca

pełną jego

charakterystykę

.

Enzymatyczna - metoda

Sangera

Na jednoniciowej matrycy

syntetyzuje się in vitro

DNA. Syteza przebiega

od radioaktywnego ,

oligonukleotydowego

startera

komplementarnego do

3` końca matrycy.

Reakcję wykonuje się

równolegle w czterech

probówkach , w których

oprócz kompletu

deoksytrifosforanów

nukleotydów (dATP ,

dCTP , dTTP , dGTP)

dodana jest niewielka

ilość jednego z nich w

postaci

dideoksytrifosforanu

nukleotydu , co

uniemożliwia

kontynuowanie reakcji w

momencie włączenia

takiego nukleotydu w

syntetyzowany łańcuch ,

ponieważ brakuje wtedy

grupy hydroksylowej na

3` końcu.

Chemiczna - metoda

Maxama-Gilberta

Polega na degradacji

wyznakowanych na 5` końcu

cząsteczek DNA związkami

chemicznymi przecinającymi

specyficznie wiązania

fosfodiestrowe za nukleotydem

odpowiadającym określonej

zasadzie azotowej. Wynikiem

reakcji jest zbiór fragmentów

DNA o różnej długości co

spowodowane jest takim

doborem warunków , że w

poszczególnych cząsteczkach

przecinane jest tylko jedno lub

dwa wiązania. Fragmenty z

czterech niezależnych reakcji

rozdziela się elektroforetycznie

po czym poddaje autoradiografii.

Prążki na autoradiogramie

odpowiadają fragmentom DNA

posiadającym na końcu 5`

znakowany fosfor a na końcu 3`

określoną zasadę.

FISH

(fluorescent in situ

hybridization)

Hybrydyzacja

Fluorescencyjna

in situ

Metodę tą wykorzystuje

się do wykrywania

m.in. aberacji

chromosomowych z

wykorzystaniem sond

wyznakowanych

fluorescencyjnie