Zastosowanie

markerów

molekularnych w

ogrodnictwie

Anna Olejnik

Ogrodnictwo II

Kształtowanie Terenów Zieleni

Markery molekularne -

podział

• Markery DNA

to prążki na

żelach lub membranach
odpowiadające odcinkom
DNA o różnej długości,
będące końcowym efektem
reakcji enzymatycznych lub
hybrydyzacji.

• Wzory prążkowe są

specyficzne dla
poszczególnych roślin.
Dziedziczą się zgodnie z
genetyką mendlowską nie
podlegając wpływowi
środowiska

Selekcja przy użyciu markerów

molekularnych



Długotrwały i skomplikowany cykl hodowlany
można znacznie skrócić prowadząc selekcję z
wykorzystaniem markerów DNA,



w tym celu wykorzystuje się istnienie
bliskiego sprzężenia pomiędzy markerem a
locus odpowiedzialnym za dziedziczenie cechy
użytkowej,



metoda ta często jest określana skrótem MAS
(Marker Assisted Selection), gdzie ma
szerokie zastosowanie w hodowli roślin
drzewiastych i hodowli odpornościowej.

Wykorzystanie markerów

molekularnych do selekcji

rodów ziemniaka odpornych na

Globodera rostochiensis

Na zaznaczonych chromosomach

znajdują się geny sprzężone z

opornością ziemniaka na

Globodera rostochiensis

Materiał i metody

• Materiał użyty do badań stanowiły liście

utrwalonych w ciekłym azocie odmian i rodów
ziemniaka, pochodzących z pośród roślin
wysadzonych w kwietniu 2002/2004 na polu
doświadczalnym w RZD - Swojec.

• W pracy wykorzystano metodę izolacji

genomowego DNA, która stanowiła
modyfikację metody izolacji roślinnego DNA
opracowanej przez H. Junghans i M. Metzlaff,
opublikowanej w czasopiśmie Bio Techniques
1990.

ZASTOSOWANE

STARTERY

• Primery BCH (marker kontrolny dla przebiegu

reakcji PCR)

• Primer GT698 (oczekujemy produktu długości 141

bp, który pochodzi z V chromosomu i jest sprzężony z
genem odporności na Globodera rostochiensis R01)

• Primer F,R (oczekujemy produkt wielkośći 800 bp),

który pochodzi z chromosomu V i jest sprzężony z
genem odporności na Globodera rostochiensis R01)

Wyniki

• Pierwszy marker molekularny (800 bp) nie

nadaje się do selekcji genotypów
ziemniaka odpornych na Globodera
rostochiensis.

• Zastosowany marker (141 bp) wydaje się

być odpowiedni do przeprowadzania
selekcji na mątwika ziemniaczanego na
dowolnym etapie hodowli ziemniaka

• Dla badanych rodów ziemniaka należy

dopracować reakcję PCR.

Wykorzystanie markerów

SSR do molekularnej

charakterystyki zasobów

genowych jabłoni

Celem pracy była ocena możliwości

wykorzystania wybranych

markerów SSR w zarządzaniu

kolekcją jabłoni oraz molekularna

charakterystyka zasobów

genowych części kolekcji z Pola

Doświadczalnego SGGW w

Wilanowie

Materiał i metody

• Izolację DNA metodą CTAB z niewielkimi

modyfikacjami przeprowadzono z liści klonu U 211
oraz 44 odmian jabłoni z kolekcji zlokalizowanej na
Polu Doświadczalnym SGGW w Wilanowie.

• Do powielenia DNA wykorzystano osiem par

starterów SSR: NZ28f4, NZ23g4, NZ04h11,
NZ02b1, NZ01a6, CH02D12, CH01C06 i CH01H10.

• Produkty amplifikacji były rozdzielane w 6-

procentowym poliakrylamidowym żelu
denaturującym i barwione azotanem srebra.

• Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu

programu POPGENE 1.32.

Wyniki

• Na podstawie odległości genetycznych, przy użyciu metody UPGMA w

programie POPGENE, sporządzony został dendrogram będący
graficznym przedstawieniem odległości genetycznych pomiędzy 44
badanymi odmianami i klonem U 211.

• W otrzymanym dendrogramie można wyodrębnić kilka wyraźnych

grup. Do pierwszej należą odmiany takie, jak: ‘Freedom’, ‘Ligol’,
‘Šampion’, ‘Gala’ i ‘Elstar’, posiadające w rodowodzie ‘Golden
Delicious’. Kolejną stanowiły te wywodzące się od ‘Cox’s Orange
Pippin’ (‘Alkmene’, ‘Delikates’, ‘James Grieve’, ‘Fiesta’). ‘Fiesta’
pochodzi z krzyżowania ‘Cox’s Orange Pippin’ i ‘Idared’, co może
tłumaczyć obecność odmiany Idared w grupie. Blisko siebie znalazły
się również odmiany spokrewnione z odmianą McIntosh. Dendrogramy

• Przy użyciu markerów mikrosatelitarnych odmiany jabłoni mogą być

jednoznacznie identyfikowane. Na podstawie porównania długości
alleli udało się zidentyfikować odmianę mylnie w kolekcji oznaczoną
jako ‘Kovelit’. W osobniku opisanym jako ‘Kovelit II’ stwierdzono inne
długości alleli w większości analizowanych loci SSR niż w odmianie
Kovelit

Monitorowanie zjawiska

odporności przędziorka

chmielowca na METI-

akarycydy w gospodarstwach

ogrodniczych przy użyciu

markerów SCAR

Celem pracy było opracowanie

markerów molekularnych,

umożliwiające analizę zmienności

genetycznej przędziorka

chmielowca pod kątem wykrywania

mutacji skutkujących

wystąpieniem odporności

szkodnika na akarycydy.

Charakterystyka opracowanych

markerów

• Opracowane markery są sprzężone z genami kodującymi

monoksygenazę cytochromozależną (P450-00830) oraz S-
transferazę glutationu (GSt-O_03900 i GSt-D_00220).
Zmienność genetyczna między rasami obejmowała długość
amplikonów oraz zmiany nukleotydowe w obrębie produktów
PCR.

• Polimorficzne sekwencje SCAR zostały zidentyfikowane w

genomach rasy referencyjnej GSS (rasa wrażliwa na
akarycydy) oraz rasy AKITA (zmutowana rasa odporna),
udostępnionych przez firmę Bayer CropScience. Skuteczność
wykrywania osobników przędziorka odpornych na METI-
akarycydy z użyciem markerów zweryfikowano w populacjach
szkodnika pochodzących z sadów eksperymentalnych i sadów
produkcyjnych, w których stosowano intensywną ochronę.

Próba znalezienia markerów

genetycznych odporności na

mączniaka rzekomego u ogórka

techniką RAPD

Charakterystyka

•

próba znalezienia markerów genetycznych odporności na
mączniaka rzekomego u ogórka techniką RAPD (w doświadczeniu
przy użyciu 6 wyselekcjonowanych starterów uzyskano
amplifikowane fragmenty DNA polimorficzne dla osobników
badanych populacji.

•

Analiza wzorów fragmentów DNA otrzymanych przy użyciu tych
starterów wykazała występowanie produktów PCR
charakterystycznych dla osobników o wysokim stopniu
odporności oraz dla osobników wrażliwych.

•

Aby jednak marker można było uznać za „informatywny”
(sprzężony z cechą), musi on znajdować się w odległości
mniejszej niż 15 cM od genu odpowiedzialnego za daną cechę,
dlatego uzyskane wyniki potraktowano jako badanie wstępne,
którego kontynuacją będzie zidentyfikowanie znalezionych
odcinków DNA jako markerów RAPD oraz ich przyporządkowanie
cesze odporności na mączniaka rzekomego).

Wykorzystanie markera QTL w

hodowli jabłoni odpornej na

mączniaka (Podosphaera

leucotricha (Ellis et Ev.) Salm.)

Celem przeprowadzonych badań było

sprawdzenie możliwości szerokiego

zastosowania markera NZ28f04 w

programach hodowlanych

wykorzystujących jako źródło

odporności na mączniaka klon U 211.

Materiał i metody

• Ekstrakcję DNA z liści 50 drzew z potomstwa Granny Smith × U

211 przeprowadzono przy użyciu metody CTAB z modyfikacjami.
DNA roślin rodzicielskich oraz każdego z osobników z
potomstwa amplifikowano w reakcji PCR przy użyciu starterów i
procedury dla markera NZ28f04.

• Produkty amplifikacji były rozdzielane w 6% poliakrylamidowym

żelu denaturującym i barwione azotanem srebra.

• Równocześnie rośliny były oceniane w latach 2000–2001 w

szkółce, a 22 z nich posadzono w sadzie w 2001 roku i
obserwowano w następnym sezonie wegetacyjnym. Reakcję na
mączniaka jabłoni oceniano w sześciostopniowej skali od 0 do 5
(0 — nieporażone, 5 — bardzo silnie porażone).

• Klon U 211 zaliczany jest do klasy 0, natomiast Granny Smith,

jako odmiana wrażliwa na mączniaka, do klasy 4.

Wyniki i wnioski

• Wynik amplifikacji markera NZ28f04 przy użyciu DNA roślin

rodzicielskich oraz części osobników z potomstwa Granny Smith ×
U 211 przedstawia rysunek 1. Allel związany ze wzrostem
odporności na mączniaka jest obecny u klonu U 211 oraz u części
potomstwa, brak go natomiast u odmiany Granny Smith

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

r→

100 bp →

Rys. 1. Elektroforogram prezentujący produkty amplifikacji markera NZ28f04. M

— marker wielkości, 1 — U 211, 2 — Granny Smith, 3 — 12: osobniki z potomstwa

Granny Smith × U 211, r — allel markera związany ze wzrostem odporności na

mączniaka jabłoni

• Selekcja prowadzona przy użyciu markera mikrosatelitarnego

NZ28f04 pozwoliłaby na usunięcie 8 roślin średnio podatnych
zaliczonych do klasy 3, jeśli wzięto by pod uwagę wyniki oceny
polowej ze szkółki z roku 2000, co stanowi 72% wszystkich roślin w
klasie 3 w tym roku. W roku 2001 do klasy 3 zakwalifikowano 9 roślin,
z których 3, czyli 33% nie wykazało obecności allela NZ28f04
związanego ze wzrostem odporności na mączniaka. W potomstwie
Granny Smith × U 211 w ciągu 2 lat obserwacji w szkółce żadnego z
osobników nie zakwalifikowano do klas 4 i 5.

• Gdyby wzięto pod uwagę wyniki oceny fenotypowej z sadu (rok 2002)

oraz wynik analizy z markerem, wyeliminowane zostałyby 2 rośliny, co
stanowi 100% osobników zaliczonych do klasy 4 oraz 2 rośliny z klasy
3, czyli 66%. Rośliny charakteryzujące się odpornością lub małą
podatnością na mączniaka jabłoni (klasy 0–2) nie wymagają
prowadzenia ochrony w sadzie, tak więc uzasadnione jest
pozostawienie tylko takich roślin do dalszej ich oceny pod względem
innych cech użytkowych.

WNIOSKI

1. Wyniki analizy przeprowadzonej z markerem NZ28f04 na potomstwie

Granny Smith × U 211 potwierdzają stabilność QTL oznaczonego
jako U7, zidentyfikowanego w potomstwie Idared × U 211.

2. Marker NZ28f04 może znaleźć zastosowanie w programach

hodowlanych wykorzystujących jako źródło odporności na mączniaka
klon U 211.

Poszukiwanie markerow

RAPD sprzężonych z

odpornością na nicienie u

pomidora

Charakterystyka

•

Poszukiwano też markerów RAPD sprzężonych z
odpornością na nicienie u pomidora. Jeden z
polimorficznych produktów amplifikacji przekształcono
następnie w marker typu SCAR, różnicujący rośliny
wrażliwe i odporne. Wprawdzie specyficzny starter
powodował namnożenie odcinka DNA we wszystkich
roślinach, ale po trawieniu produktu reakcji enzymem
restrykcyjnym Taq I, wzór prążkowy roślin odpornych
był inny niż roślin wrażliwych.

•

Marker ten okazał się znacznie silniej sprzężony z
odpornością na nicienie niż używany do tej pory
marker izoenzymatyczny.

Inne

• Metody identyfikacji leśnego materiału rozmnożeniowego w oparciu o

markery molekularne DNA (przykłady praktycznych zastosowań
markerów molekularnych w badaniach identyfikacyjnych):

 identyfikacja gatunków dębów w oparciu o wybrane jądrowe markery

mikrosatelitarne

 identyfikacja pochodzenia świerka pospolitego w oparciu o markery

cytoplazmatyczne

 możliwości weryfikacji pochodzenia nasion z drzewostanów dębowych w

oparciu o markery cytoplazmatyczne

 możliwości wykorzystania jądrowych sekwencji mikrosatelitarnych do

weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych
dębów

 wykorzystanie chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych w celu

weryfikacji poprawności zbioru nasion przechowywanych w zasobach LBG,
pozyskanych z drzew matecznych sosny zwyczajnej

 wykorzystanie chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji

przynależności szczepów do poszczególnych klonów na przykładzie klonalnej
plantacji nasiennej sosny zwyczajnej

• Znając marker sprzężony z genem warunkującym purpurową barwę

owoców czereśni, można prowadzić selekcję w tym kierunku, na kilka
lat przed wejściem drzewa w okres owocowania

• Zastosowanie markerów RFLP do opracowania

dendrogramu obrazującego pokrewieństwa między 38
genotypami z rodzaju Brassica:

 Udowodniono między innymi istnienie bliskiego

pokrewieństwa pomiędzy genomami brokuła i kalafiora oraz
kapusty głowiastej i jarmużu. Wykazano, że wraz z ewolucją
rodzaju Brassica, zwiększyła się liczba chromosomów w jego
genomie

• Użycie markerów RFLP generowanych u pomidora do

badań podobieństwa uszeregowania oraz liczby genów u
trzech rodzajów Solanaceae: papryki (Capsicum annuum
L.), ziemniaka (Solanum tuberosum L.) i pomidora:

 We wszystkich trzech gatunkach mapy sprzężeń konstruowano

przy użyciu wielu tych samych markerów. Grupy sprzężeń
pomidora i ziemniaka wykazały wysokie podobieństwo,
dziewięć chromosomów odznaczało się homologią sekwencji.
Genom papryki wyraźnie różnił się od poprzednich znaczną
liczbą przegrupowań interchromosomowych i w konsekwencji
rozmieszczeniem genów markerowych.

Dziękuję za uwagę!