PODOBIEŃSTWA I RÓŻNICE RYBOSOMÓW BAKTERII I EUKARIONTÓW.

Każdy rybosom składa się z dwóch podjednostek(dużej i małej). Koordynują syntezę białek. Składają się z bialek i RNA(rRNA). W jednej komórce jest ich duża ilość, u bakt 20tys u Euk wiecej. Dodatkowo u Euk wystepują w postaci wolnej(np. w cytoplazmie) oraz połączonej z ER. Różnią się wielkością Euk 60S i 40S, u bak 50S i 30S. Duża podjednostka u Euk zawiera trzy cząsteczki rRNA(28S, 5S i 5,8S), a u bakt tylko dwie(23S i 5S). w obydwu grupach organizmów mała podjednostka zawiera jedną cząsteczkę rRNA: u Euk-18 SrRNA, u bakt0 16sRNA.

SCHEMAT: LEPKIE KOŃCE I TĘPE KOŃCE

-tępe końce

-lepkie końce

MECHANIZM ZAPOBIEGAJĄCY SKRACANIU CHROMOSOMÓW

Mechanizm zapobiegający skracaniu się chromosomów, polega na syntezie sekwencji telomerowych w niezależnym procesie syntezy katalizowanym przez telomeraze(jest to duży nukleoproteid zawierający białko-odwrotna transkryptaze oraz krótką cząsteczkę RNA, której sekwencja jest komplementarna do fragmentu sekwencji w telomerach, dzieki temu telomeraza może zsyntetyzować odpowiedni fragment telomeru(jego długość jest regulowana przez białka wiążące telomerowy DNA-TBP)

BUDOWA NICI CHROMATYNOWEJ 30 NM. Nici chromatynowe 30nm to włókna o średnicy 30 nm(większość chromosomowego DNA in vivo jest upakowana w 30nm). Tworzenie 30nm następuje podczas organizacji nukloesomów, dzieki podwyższaniu stężenia soli nukloeosmy upakowują się we włókna 30nm. Ma w tym także udział histon H1, który zwiększa stopień zorganizowania”sznura koralików”

REGUŁY REPLIKACJI: jest semikonserwatywna, jest sterowana przez duże, wieloenzymatyczne kompleksy, jej jednostką jest replikon, inicjacja replikacji zachodzi w ściśle określonej sekwencji nukleotydów zgromadzonych w specyficznych miejscach chromosomu zwanych origin(ori), replikacja w ramach repliko nu rozpoczyna się od jednego miejsca inicjacji i postępuje zwykle dwukierunkowo do miejsca germinacji, replikacja jest inicjowana przez krótki odcinek RNA służący jako starter dla polimerazy DNA, germinacja replikacji może być zapisana w sekwencji genomu.

TRANSPOZYCJA- to proces polegający na wykorzystaniu rekombinacji prowadzący do przeniesienia fragmentu DNA z jednego miejsca w genomie w inne. Przenoszony fragment nosi nazwę transpozonu. Sekwencja wprowadzona do genu podczas transpozycji najczęściej powoduje jego inaktywację.

TRANSPOZON- to przenoszony fragment w transpozycji(rodzaju rekombinacji), został odkryty przez B.McClintock na podstawie obserwacji pigmentacji nasion kukurydzy. Podczas procesu transpozycji fragment ten jest otoczony przez parę krótkich powtórzeń prostych(ITR- odwrócone powtórzenia końcowe). Rodzaje: 1) przenoszące się replikatywnie- oryginalny transpozon pozostaje na miejscu, a jego nowa kopia pojawia się w innym miejscu w genomie. 2) Przenoszące się konserwatywnie- oryginalny transpozon przemieszcza się na nowe miejsce w procesie wycięcia i wklejenia, 3)retro element- przenoszony za pośrednictwem kopii RNA.

POLIMERAZA RNA U E.COLI- jest holoenzymem. Składa się z 5 podjednostek: 2α, 1β, 1β’, 1ω(tworzą one rdzeń) oraz dodatkowego czynnika σ. Podj α: jest kodowana przez gen rpoA, jest niezbedna do złożenia się rdzenia białkowego, a także uczestniczy w wiązaniu z promotorem(ale nie jest to do końca wyjaśnione) Podj β: stanowi centrum katalityczne polimerazy RNA(jednostka ta wiąże się z antybiotykiem ryfampicyna i streptolidygina), uczestniczy zarówno w transkrypcji i elongacji. Podjβ’: bierze udział w wiązaniu się polimerazy RNA z matryca DNA. Jest kodowana przez rpoC. Wiąże się z nia heparyna. Czynnik sigmaσ: jego przyłączenie zmienia rdzeń polimeraz RNA w holoenzym, pełni role w procesie rozpoznawania promotora, nie jest konieczny do elongacji(najpowszechniejszy σ⁷⁰)

SKŁADANIE MRNASplicing Składanie mRNA to jeden z etapów dojrzewania mRNA z pre-mRNA (nazywany inaczej splicingiemRNA). Polega na wycięciu intronów(sekwencji niekodujących) i połączeniu eksonów(sekw. kodujących). Katalizowane jest przez kompleks białek i RNA zwany spliceosomem. U większości intronów pierwszymi dwoma nukleotydami są 5’-GU-3’ a dwoma ostatnimi 5’-AG-3’. Wycinanie: po stronie 5’ intronu zapoczątkowuje grupa hydroksylowa przyłączona do węgla 2’ nukleotydu adenozynowego w obrębie sekwencji intronu. Intron zwija się w pętlę tworząc strukturę lassa. Po stronie 3’ wolna grupa 3’ OH poprzedzającego eksonu atakuje wiązanie fosfodiestrowe w miejscu 3’ (na początku drugiego eksonu) uwolniony intron ulega degradacji, a eksony łączą się poprzez ligację.

SPLICEOSOM: to kompleks białek i RNA, który bierze udział w splicingu(składaniu pre-mRNA). Spliceosom wycina introny z pre-mRNA, zawiera małe jądrowe nukleoproteiny-snRNP. Znane są dwa rodzaje: klasyczny i alternatywny. Klasyczny spliceosom wycina introny mające sekwencję GU na 5'-końcu i AG na 3'-końcu. Spliceosom alternatywny (typu U12) wycina introny zaczynające się od AU i kończące się AC.

STRUKTURA DRUGORZĘDOWA tRNA ma budowę palczastą i przyjmuje kształt czterolistnej koniczyny w którym można wyróżnić 4 ramiona. Każde z tych ramion pełni inną funkcję: ramię D - struktura pętli z dihydroksyuracylem (nukleotyd nietypowy dla RNA), zawiera informację jaki rodzaj aminokwasu może być przyłączony do danego tRNA, ramię akceptorowe - sparowane zasady końców 3' i 5', oprócz końca CCA-3' niesparowanego, do którego przyłączają się chemicznie aktywowane aminokwasy za pomocą wiązania estrowego, ramię zmienne, ramię Tψc - rybotymidowe, psi to modyfikowana zasada zwana pseudouracylem. Ramię służy do łączenia się z rybosomem i umocowania tRNA na matrycy pętla antykodonowa - odpowiedzialna za rozpoznanie i związanie z kodonem w mRNA. Sekwencja antykodonowa rozpoznaje komplementarny tryplet nukleotydów tworzących kodon, na cząsteczce mRNA (w taki sposób następuje odczyt informacji genetycznej).

Zwana jest strukturą liścia koniczyny. Na końcu 5’ znajduje się monofosforan(powstaje w wyniku działanie hydrolitycznego RNazy P. Występuje ramię akceptorowe, ramie/pętla D, petla antykodonowi, ramię zmienne, ramie/petla T. Pętla D składa się zawiera zazwyczaj modyfikowana zasadę dihydrouracylu,

Hybrydyzacja metodą Southerna (ang. Southern blotting, Southern blot) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca wykrywaniu określonych fragmentów DNA .

Aby ją wykonać, należy przeprowadzić elektroforetyczne rozdzielenie mieszaniny fragmentów DNA (np. po cięciu enzymami restrykcyjnymi), umieścić w alkalicznym buforze, który wywoła denaturację DNA. Następnie całość przenosi się na błonę nylonową. Po odpowiednim spreparowaniu błony nylonowej z DNA wykonuje się hybrydyzację z sondą, a następnie przy pomocy odpowiedniej metody detekcji uwidacznia się interesujące nas fragmenty DNA. M Hybrydyzację Southerna można stosować m.in. po cięciu DNA enzymami restrykcyjnymi, po reakcji PCR z użyciem mało specyficznych starterów (zobacz: reakcja łańcuchowa polimerazy) lub też w celu wykrycia obcego DNA w badanym organizmie (np. DNA wirusa u człowieka).

CECHY MARKERÓW MOLEKULARNYCH: -silny polimorfizm(obecność wielu form allelicznych), - dziedziczenie kodominujące, -wysoka frekwencja i równomierne rozłożenie w genomie, - brak sprzężenia lub związku plejotropowego z genami obniżającymi płodność i przystosowanie do środowiska, -powtarzalność, - prosta i szybka metoda wykrywalności

ENZYMY RESTRYKCYJNE POCHODZENIE I SPOSóB DZIAŁANIA: Enzymy restrykcyjne(nukleazy restrykcyjne)- są to enzymy bakteryjne, które katalizują hydrolizę wiązań fosfodiestrowych w kwasach nukleinowych w miejscach określonych przez krótkie sekwencje nukleotydów (rozpoznawane sekwencje mają charakter palindromowy, a miejsca zerwania łańcuchów DNA są usytuowane symetrycznie-podwójna symetria obrotowa). Pochodzą od bakterii(np. EcoRI- Echerichia coli RY13, BamHI- Bacillus amyloliqueafaciens H) Enzymy restrykcyjne rozcinają cząsteczkę obcego DNA, natomiast komórkowy DNA danego organizmu nie ulega degradacji przez własne enzymy restrykcyjne(miejsca przez nie rozpoznawane są w tym DNA zmetylowane przez enzym modyfikujący- metylazę)

ORF [Otwarta ramka odczytu]- jest każdą sekwencją DNA lub RNA, która potencjalnie może ulec translacji na białko. W genie ORF mieści się pomiędzy kodonem 'START' (lub sekwencją START), a kodonem 'STOP'. Jeśli wiadomo, że konkretna ORF koduje białko, to mówi się o rejonie kodującym. ORF-y odnajduje się zwykle podczas przeczesywania sekwencji DNA przy poszukiwaniu potencjalnych genów. Dla różnych organizmów, z powodu różnorodności sekwencji 'START' istnieją zatem różne ORF-y.

SEKWENCJONOWANIE BIAŁEK: ustalanie sekwencji aminokwasowej białka możliwe jest dzięki powtarzanym seriom reakcji chemicznej, które pozwalają identyfikować aminokwasy po usunięciu go z końca aminowego. Automatyczne sekwencje aminokwasów białka jest możliwe dzięki automatycznym sekwentatorom. Jeśli pepty jest dłuższy niż 50 aminokwasów to bialko przed sekwencjonowaniem rozcina się na mniejsze peptydy(np. bromocyjan zrywa w.peptydowe z metionina, trypsyna tnie po karboksylowej stronie lizyny lub argininy, następnie poddaje się peptyd degradacji Edmana(fenylotiocyjanian reaguje z N-końcem aminokwasu, który uwalnia się jako pochodna PTH fenylotiohydantoina) a na końcu białka jest obecny następny aminokwas. Pochodną PTH identyfikuje się chromatograficznie przez porównanie ze standardami.

RT-PCR

Metoda stosunkowo prosta i powszechnie stosowana do szukania tran skryptów w totalnym RNA. Pierwszy etap polega na syntezie cDNA komplementarnego do mRNA, katalizowany przez odwrotną transkryptazę. Nastepnie na matrycy cDNA powielony jest odcinek DNA, którego końce sa komplementarne do sekwencji starterów. Reakcja przebiega jak w typowym PCR, a jej produkt poddawany jest elektroforezie i wizualizowany w ultrafiolecie.

RAPD

Wykorzystuje ona reakcję PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) do generowania markerów RAPD. Markery te wykazują dominujący charakter dziedziczenia, przez co niemożliwe jest odróżnienie homozygot od heterozygot. Do reakcji PCR używa się startera o długości 9-11 pz. Każdy taki starter zapoczątkowuje amplifikację w wielu rejonach genomu jednocześnie. Produkty reakcji amplifikacji rozdziela się na żelu agarozowym. Detekcja prążków odbywa się z użyciem znaczników fluoroscencyjnych lub srebra. Metoda ta jest szybsza, wydajniejsza i mniej pracochłonna od RFLP. Potrzeba również znacznie mniejszych ilości DNA, ponieważ jest on powielany w kolejnych rundach amplifikacji. DNA ten może pochodzić z surowego ekstraktu.

CHROMOSOM INTERFAZOWY:. W interfazie zachodzi transkrypcja genów na chromosomach i replikacja DNA. chromosomy przyjmuja strukturę bardziej rozproszoną, mimo że pętle chromosomowe pozostaja przyłączone do matriks jadrowej. Chromosomów tych nie można zobaczyć osobno. W chromosomach tych można wyróżnić heterochromatyne(jest nieaktywna transkrypcyjnie) oraz euchromatynę

OCZYSZCZANIE I ROZDZIAŁ BIAŁEK: 1) Wirowanie różnicowe- stopniowo wzrast. szybkość pozwala rozfrakcjonować homogenaty komórkowe na ich składniki w zależności od wielk. i gest.(większe i gęstsze podlegają działaniu większej siły odśrod. i szybciej się poruszająosad, mniejsze zostają w roztworzesupernatancie, 2)Sedymentacja szybkościowa- skład komórk. Po nałożeniu na pow. Rozcieńczonego roztworu soli sedymentują z różną szybkością, zależnie od wielk. W roztworze przygot. Się niewielki ciągły gradient sacharozy(5-20%), której stężenie wzrasta do dna probówki. Sedym. Przez gradient różne składniki komórki rozdzielają się i tworzą odrębne warstwy, które można oddzielnie zebrać., 3) Sedym równowagowa/wirowanie w grad gęstości- ultrawirowanie można wykorzystać do rozdziału sklad. komórki na podstawie ich gęst pławnej.próbę nakłada się na szczyt lub rozprasza w obrębie skokowego gradientu (stęż sacharozy/chlorku cezu) podczas wirowanie każdy skł. Przesuwa się w dół/górę do momentu kiedy gestość otoczenia będzie równa jego własnej i wtedy nieruchomieje. Oraz chromatografia kolumnowa, elektroforeza SDS-PAGE oraz Dwukierunkowa