Bakterie przetrwalnikujące

• tlenowe

• beztlenowe

Przetrwalniki (endospory) są formami przetrwalnikowymi laseczek Clostridium i Bacillus, powstają wewnątrz komórek i są najodporniejszymi formami przetrwanymi, mogą w takiej formie trwać nawet ponad 500 lat

• centralne

• subterminalne

• terminalne

W sytuacjach stresowych indukowany jest sygnał sporulacji.

Dojrzała spora jest odporna na działanie UV, silnie utleniacze jak kwasu i zasady, suszę a także wysoką temepreaturę.

• Kiełkowanie endospor następuje po trafieniu na dogodniejsze warunki

Do rodziny Bacillaceae zalicza się laseczki, na ogół gram dodatnie zdolne do wytwarzania przetrwalników o wysokiej oporności na działanie czynników chemicznych i fizycznych

Należą tutaj dwa rodzaje

• tlenowe Bacillus (subtilis, cereus, anthracis)

• beztlenowe Clostridium (botulinum, tetani, perfringens)

BACILLUS

Bacillus cereus

• duża, G+ tlenowa ruchliwa, tworzy przetrwalniki

• zatrucia pokarmowe spowodowane B. cereus zdarzają się niezależnie od pory roku i miesiąca

• występuje w glebie, na rośłinach, w zbiornikach wodnych, wodzie wodociągowej, kurzu – stąd mogą przedostawać się do żywności. Skrobia sprzyja rozwojowi B. cereus (potrawy mączne, budynie, zupy, warzywa, mięsa, przyprawy, wyroby garmażeryjne)

• 10^7 żywych komóek / g produktu powoduje zatrucie, 10^5(dzieci)

Formy zakażenia B. Cereus

1. Forma wymiotna – związana jest z działaniem jednej z toksyn bakterii – ciepłostabilnej i odpornej na niskie pH oraz niektóre enzymy układu pokarmowego – toksyny wymiotnej in. emetrycznej (emetic toxin ETE)

- choroba trwa krótko, ok 9 godzin i charakteryzuje się nudnościami i wymiotami oraz krótkim czasem inkubacji – 0,5 do 6 godzin (może zostać pomylona z zatruciem pokarmowym gronkowcowym). Występuje bardzo często po spożyciu zakażonego ryżu, ugotowanego w którym nie zostały zniszczone przetrwalniki. Pod wpływem przetrzymania potrawy w temp. Pokojowej przetrwalniki kiełkują, po czym bakterie wytwarzają toksynę, której nie daje się unieszkodliwić nawet przez następujące podgrzanie jedzenia (makaron, ciastka kluski)

Intoksykacja – wprowadzenie gotowej toksyny do organizmu, bakterii nie ma na żywności bo obumarła Toksykoinfekcja – żywa bakteria dostaje się do organizmu, tam się namnaża i wytwarza toksynę

2. Forma biegunkowa – trwa ok doby i wystęuje od 8 do 16 godzin po spożyciu zakażonego pokarmu, który jest najczęściej jest mieso lub warzywa (przypomina zatrucie pokarmowe spowodowane przez Clostridium perfringens). Biegunce (wodnistej) często towarzyszą bóle brzucha, nudnosci, wymioty są sporadyczne!. Za objawy odpowiada tutaj inna toksyna/toksyny B. cereus – ciepłolabilne i wrażliwe na środowisko kwaśne hemolizyna (BL (HBL) i enterotoksyna niehemolityczna (NBL)

• dawka infekcyjna 10^3 – 10^7 CFU

Obie formy zatrucia pokarmowego są nieleczone!

Bacillus subtilis (laseczka sienna)

• endospory są kuliste, powstają w centrum macierzystej komórki, są one wyjątkowi odporne na niekorzystne warunki zewnętrzne

• endospory są odporne na wysoką temperaturę – we wrzącej wodzie sukcesywnie giną, ale 10% wytrzymuje w niej godzinę, a 1% dwie godziny

• w próżni kosmicznej zachowują żywotność przez dobę

• odpowiedzialna za jedną z wad pieczywa – jego śluzowacenie. Bakterie te, rozwijając się w pieczywie powodują, że staje się ono szare, maziste, ciągnące i ma nieprzyjemny zapach.

Bacillus anthracis

• tendencja do tworzenia łańcuszków (łodygi bambusa)

• chorobotwórczość wąglika pozostaje w ścisłym związku ze zdolnością do wytwarzania otoczki oraz toksyny składającej się z trzech współpracujących ze sobą białek

  • antygenu ochronnego – PA (protective antigen 83 kDa)

  • czynnika śmiertelnego – LF (lethal factor 87 kDa)

  • czynnika obrzęku – EF (oedema factor 89 kDa)

• rodzaje wąglika

  • skórny (tzw. czarna krosta - karbunkuł) związana z uszkodzeniem i zakażeniem skóry

  • przewodu pokarmowego, powstający wskutek spożycia zakażonej żywności lub wody

  • płucny (choroba gałganiarzy), który powstaje w wyniku wdychania przetrwalników ze skażonym powietrzem

• postać jelitowa charakteryzuje się silnym bólem brzucha, gorączką, biegunką, lub czasem zaparciami. Stolec może zawierać świeżą krew, często ma smolistą barwę. Mogą wystąpić wymioty, niekiedy zawierające krew. Postępująca choroba może prowadzić do wodobrzusza lub perforacji jelita

• w tej postaci wąglik występuje najrzadziej. Notuje się go w liczbie <1% wszystkichg przypadków zachorowań na wąglika u ludzi. Zmiany rozwijają się w śluzówce po spożyciu endospor B antrhaci z zakażoną wodą lub żywnością. W typowym przebiegu choroby okres wylęgania trwa od 2 do 5 dni. W ciężkich przypadkach wystąpienie objawów chorobowych jest nagłe, po kilku godzinach następuje wstrząs, zapaść i śmierć.

• źródła zakażenia – surowe mięso albo mleko zwierząt chorych

CLOSTRIDIUM

Clostridium – G+, beztlenowe, tworzą przetrwalniki, przeważnie mezofile (C. botulinum typ E jest psychrofilny)

• rodzaj ten obejmuje ok 60 gatunków, powszechnie występujących przede wszystkim w glebie oraz przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt, narządach rodnych kobiet a także w wodzie i ściekach. Bakterie te cechują się możliwością wiązania azotu atmosferycznego oraz redukcji siarczanów (IV). Większość bakterii z tego rodzaju to saprofity, przeprowadzające procesy fermentacyjne oraz rozkładające celulozę i pektyny. Niektóre gatunki mają właściwości chorobotwórcze, uwarunkowane wytwarzaniem silnych egzotoksyn (intoksykacje), inne są drobnoustrojami oportunistycznymi.

Clostridium botulinum

• laseczka jadu kiełbasianego – jest G+ beztlenową laseczką, wytwarza przetrwalniki (ułożone centralnie lub subcentralnie), szeroko rozpowszechnione w naturze – przede wszystkim w glebie i osadach zbiorników wodnych. Ich rezerwuar stanowi również przewód pokarmowy zwierząt, a także rozkładające się rośliny i resztki pokarmowe.

• wzrasta w temperaturach 24 – 33 stopni przy lekko zasadowym pH. W środowisku kwasowym drobnoustrój traci zdolność wytwarzania przetrwalników

• w preparatach z hodowli komórki bakteryjne występują pojedynczo, parami lub tworzą krótkie łańcuszki. Przetrwalniki są oporne na oddziaływanie ultrafioletu i alkoholi, inaktywują je natomiast ogrzewanie w 121 stopni przez 20 minut, mocne kwasy, formaldehyd, chlor, silne zasady oraz tlenki etylenu i propylenu.

• do zatrucia zachodzi drogą pokarmową (spożycie pokarmów zawierających toksynę), a w wyjątkowych przypadkach także w przebiegu zakażenia bakteryjnego rany (botulizm przyranny)

• najczęściej źródłem zatruć są konserwy, często mięsne, ale również jarzynowe czy rybne. Bywają to często przetwory wytwarzane w warunkach domowych lub przeterminowania

• spożycie występującej naturalnie np. w miodzie C. botulinum może w bardzo rzadkich przypadkach spowodować u niemowląt poniżej pierwszego roku życia chorobę zwaną botulizmem dziecięcym, dlatego nie należy podawać miodu dzieciom poniżej 12 miesiąca życia. W tym przypadku choroba rozwija się nie na skutek toksyny botulinowej, ale z powodu namnażania bakterii w ustroju

• w przebiegu zatrucia występują dwie grupy objawów

  • objawy ze strony przewodu pokarmowego

    • nudności

    • wymioty

    • zaparcia

    • bóle brzucha

• objawy działania toksyny botulinowej

  • osłabienie, bądź porażenie różnych grup mięśni

  • charakterystyczne i łatwo zauważalne jest opadanie powiek, nadające twarzy senny wyraz

  • podwójne widzenie

• w trakcie wzrostu wytwarza siedem serotypów toksyn (BoNT) oznaczanych literami od A do G. Wszystkie te serotypy działają identycznie – jeden szczep – jeden serotyp. Może zdażyć się tak, że więcej serotypów będzie produkowanych przez jeden szczep, ale wtedy zawsze jeden będzie dominujący

• są syntetyzowane w postaci pojedynczego łańcucha polipeptydowego, składającego się z trzech domen

  • domena wiążąca – odpowiada za przyłączenie toksyny do receptorra błony presynaptycznej komórki, złożona z dwóch poddomen, NH2-terminalnej i C-terminalnej

  • domena translokacyjna – umożliwiająca transport toksyny przez błonę presynaptyczną (Hn)

  • N – Końcowa domena katalityczna o aktywności cynko-zależnej endopeptydazy (łańcuch lekki L)

• syntetyzowane toksyny gromadzone są w cytozolu komórki bakteryjnej skąd wskutek autolizy ulegają uwolnieniu w postaci kompleksów zwanych protoksynami, w skład których wchodzą obok właściwej cząsteczki nietoksyczne białka , tzn NAPS (neurotoxin – associated proteins).

• zakażenie przebiega najczęściej jako intoksykacja, sama bakteria jest mało zakaźna

• spożyta wraz z pokarmem toksyna jest adsorbowana do krwiobiegu już w żołądku. Czas inkubacji oraz przebieg kliniczny – rodzaj intensywności objawów – zależą od ilości pochłoniętej toksyny. Pierwsze symptomy zatrucia pojawiają się po 12 – 36 godzinach, jednak mogą wystąpić znacznie wcześniej bo już w ciągu 4 godzin z opóźnieniem – nawet po 8 dniach.

• Częstość występowania botulinizmu u ludzi jest niewielka, jednak śmiertelność w wyniku zachorowania jest bardzo wysoka i sięga 70% (w przypadku niepodjęcia natychmiastowego i właściwego leczenia) – to dlatego, że neurotoksyny botulinowe ze względu na mechanizm i szybkość działania są jednymi z najbardziej niebezpiecznych związków dla człowieka – szacuje się zę doustne podanie 70 ug czystej toksyny może wywoływać skutek śmiertelny. U osób, któe przeżyły zatrucie botuliną utrzymują się stałe zaburzenia neurologiczne.

Clostridium perfringens

1.Zatrucie pokarmowe

• nagle pojawia się kolka i biegunka

• wymioty (rzadko)

• okres wylęgania 8 – 22 godziny

• przebieg choroby łagodny i krótki (1 dzień)

• przyczyną są głównie potrawy mięsne lub wywary z miesa, które pozostawione w temperaturze pokojowej mają dobre warunki do rozmnożenia się postaci opornych na działania wysokiej temperatury

• rezerwuarem jest przewód pokarmowy człowieka i zwierząt hodowlanych (bydło, świnie) oraz gleba

WYKRYWANIE BAKTERII PRZETRWALNIKUJĄCYH W MIĘSIE I PRZETWORACH MIĘSNYCH

Bakterie beztlenowe przetrwalnikujące redukujące siarczany - Clostridium

Wykrywanie obecności Clostridium

• w zależności od limitu wykrywalności posiać określoną ilość próbki lub jej rozcieńczeń do dwóch pożywek Wrzoska (1g w przypadku produktów stałych lub 1 m w przypadku produktów płynnych i rozcieńczeń dziesięciokrotnych)

• po wykonaniu posiewów jedna z dwóch równolegle posianych probówek ogrzewać w łaźni wodnej w temperaturze 80 stopni przez 10 minut, po ogrzewaniu schłodzić do 30 stopni

• posiewy w probówkach pasteryzowanych i niepasteryzowanych inkubować w cieplarce w temperaturze 37 stopni przez 48 godzin, w przypadku wyniku ujemnego inkubować kolejne 24 godziny

• stwierdzenie zmętnienia pożywki i /lub wydzielenie się pęcherzyków gazu w pożywce lub na powierzchni parafiny lub jego obecności w rurce Durhama wskazuje na wzrost bakterii beztlenowych, szczególnie w posiewach pasteryzowanych

• w przypadku stwierdzenia wzrostu, pobrać pipetą materiał z dna probówki i wykonać preparat bakterioskopowy barwiony metodą Grama

• jeżeli w preparacie wykaże się obecność laseczek G+, a w hodowlach starszych niż 48 godzin laseczek G-, z ewentualnie obecnymi przetrwalnikami – należy przeprowadzić dalsze przesiewy

Posiew na pożywkę Wilson – Blaira

• z probówek zakwalifikowanych do przesiewów pobrać z dna materiał i przenieść 2 – 3 krople na płytkę Petriego i zalać15 ml pożywki W – B

• po zestaleniu pożywki zalać 1 cm warstwą agaru wodnego

• inkubować w temperaturze 37 stopni przez 24 – 48 godzin

• stwierdzenie wzrostu czarnych kolonii lub zaczenienie całej pożywki świadczy o wzroście beztlenowych bakterii przetrwalnikujących

Posiew na pożywkę Willis – Hobbs

• równolegle z przesiewem na pożywkę Wilson – Blaira wykonać posiew na dwie płytki z pożywką agarową Willis – Hobbs

• z dna próbówki z pożywką Wrzoska pobrać 2 – 3 krople materiały i przenieść na dwie płytki z pożywką Willis – Hobbs, wykonać posiew rysowy aby otrzymać pojedyncze kolonie

• jedną z posianych płytek inkubować w warunkach tlenowych, druga w beztlenowych w temperaturze 37 stopni przez 24 – 48 godzin

Wstępna identyfikacja na pożywce Willis – Hobbsa

1. właściwości proteolityczne – strefa przejaśnienia dookoła kolonii

2. fermentacja laktozy – odczyt po 48 godzinach inkubacji i pozostawieniu płytki na 3 – 4 godziny w atmosferze tlenowej, po tym czasie kolonie bakterii fermentujących laktozę zabarwią się na kolor różowoczerwony

3. wytwarzanie lecytynazy – żółta strefa zmętnienia dookoła kolonii

4. wytwarzanie lipazy – warstwa perłowa na powierzchni kolonii

Identyfikacja biochemiczna na pożywce Willis – Hobbsa

• Selekcja kolonii do identyfikacji – przesiać charakterystyczną kolonię na pożywkę W – H metodą sektorkową, tak aby uzyskać pojedyncze kolonie. Po uzyskaniu czystej kultury posiać ją na płynne podłoże Wrzoska – otrzymane czyste hodowle na pożywce płynnej stanowią materiał do badania cech biochemicznych

• Badanie zdolność fermentowania cukrów – posiewamy do każdej probówki (z glukozą / maltozą / sacharozą) po 1 ml czystej kultury z pożywki płynnej i inkubujemy w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 stopni przez 48 godzin. Po inkubacji dodać po kilka kropli wskaźnika pH (np. 1% roztwór wodny purpury bromokrezolowej). Zmiana zabarwienia pożywki na żółtą do czerwonej wskazuje na reakcję dodatnią, barwa filoetowa wskazuje na reakcję ujemną.

• Próba na indol – 0,5 ml czysteh hodowlu na pożywce Wrzoska

• Badanie właściwości proteolitycznych – 1 ml hodowli na pożywce Wrzoska posiać do pożywki z żelatyną uprzedniu upłynnionej w temp 45 stopni. Posiew inkubujemy w temp 37 stopni przez 48 godzin. Po inkubacji posiwy schłodzić w temp 0 – 4 stopni przez 2 – 3 godziny. Brak zestalenia po schłodzeniu wskazuje na proteolityczne właściwości badanego szczepu.

Wykrywanie obecności toksyny Clostrisium botulinum

Określanie zdolności wytwarzania toksyny przez szczepy C. botulinum – czystą hodowlę w płynnym podłożu Wrzoska szczepu podejrzanego o przynależność do C. botulinum wirujemy 10 min przy 2370 obrotów. Płyn znad osadu podajemy dootrzewnowo myszce.

• Jednocześnie należy wykonać taką samą próbę biologiczną kontrolną, z tym że supernatant należy na godzinę przez podaniem zmieszać z surowicą antybotulinową (0,2 ml surowicy na każdy mililitr supernatantu). W przypadku braku antytoksyny supernatant należy gotować w temperaturze 100 stopni przez 10 minut. Badany szczep określamy jako toksynotwórczy jeżeli zwierzęta z grupy doświadczalnej padną w ciągu 96 godzin przy jednoczesnym przeżyciu zwierząt z grupy kontrolnej

• Próbkę badanej żywności homogenizujemy z rozcieńczalnikiem toksyny (0,4 % roztwór żelatyny) w stosunku 1:1. Po homogenizacji próbkę wstawiamy do lodówki na 2 godziny, następnie wirujemy przez 10 minut przy 3700 obr/min. Przygotowany supernatant służy do przeprowadzenia próby biologicznej jw.

• przy podejrzeniu o spowodowanie zatrucia przez Clostridium botulinum typ E przygotowany supernatant należy poddać trawieniu trypsyną aby przeprowadzić protoksynę w toksynę

Tlenowe bakterie przetrwalnikujące

Metoda oznaczania liczby Bacillus cereus

1. posiew i ikubacja

2. izolowanie (podłoże PEMBA – pożywka agarowa z polimyksyną, pirogronianem, zółtkiemjaja, mannitolem i błękitem bromotymolowym i MYP)

3. liczenie i wybór kolonii

4. badania potwierdzające

   - potwierdzenie mikroskopowe (PEMBA)

MYP – typowe kolonie B. cereus są wielkości od 2 – 5 mm, mają poszarpane brzegi, wykazują różowe zabarwienie, otoczone są strefy precypitacji (reakcja egg - yolk)