ZIARNIAKI GRAM-DODATNIE

Klasyfikacja Gram-dodatnich ziarenkowców:

1. Rodzina: Micrococcaceae

• Rodzaj: Micrococcus, Stomatococcus, Staphylococcus, Planococcus

2. Rodzina: Deinococcaceae (cztery gatunki)

3. Grupa: fakultatywne beztlenowce i mikroaerofile katalazo-ujemne:

• Rodzaj: Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, Aerococcus, Lactococcus, Gemella, Leucomostoc

4. Grupa ścisłych beztlenowców

• Rodzaj: Peptococcus, Coprococcus, Peptostreptococcus, Sarcina, Ruminococcus

Z klinicznego punktu widzenia z drobnoustrojów tlenowych największe znaczenie mają rodzaje: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus.

Rodzaj Staphylococcus

Do rodzaju Staphylococcus należy 31 gatunków i 8 podgatunków, które mogą być podzielone na dwie podstawowe grupy tj.:

• gronkowce koagulazo-dodatnie: S. aureus, S. intermedius (jak dotąd chorobotwórczy tylko dla zwierząt, rzadko spotykany u ludzi) i niektóre szczepy S. hyicus

• gronkowce koagulazo-ujemne

Najważniejszy i najbardziej wirulentny gatunek to S. aureus. Liczne zewnątrzkomórkowe substancje jakie wytwarzają gronkowce złociste hemolizyny, leukocydyna_; koagulaza, stafylokinaza, hialuronidaza, nukleazy, proteazy, lipazy, toksyna epidermolityczna, enterotoksyny, toksyna wstrząsu toksycznego, toksyna pirogenna) oraz szereg składników ich powierzchni (białko A, otoczka, peptydoglikan, kwasy tejchojowe) są czynnikami różnorodnej chorobotwórczości tych bakterii. Gronkowce nie posiadają jednego wyraźnie zdefiniowanego czynnika zjadliwości. Za chorobotwórczość jest odpowiedzialny zespół cech.

Stałą cechą S. aureus jest wytwarzanie koagulazy i ciepłostałej DNAzy, co jest wykorzystane w diagnostyce tych drobnoustrojów.

Gronkowce koagulazo-ujemne (CNS - ang. Coagulase Negative Staphylococci) stanowią komensalną i fizjologiczną florę skóry i błon śluzowych człowieka. Są to drobnoustroje typowo oportunistyczne - mogą być przyczyna zakażeń jeżeli mechanizmy obronne gospodarza ulegną osłabieniu lub gdy dostaną się do tkanek. Gatunkiem najczęściej izolowanym z zakażeń jest S. epidermidis (zakażone zastawki sercowe, różne protezy, cewniki śródnoczyniowe i inne tzw. biomateriały), S. saprophyticus jest przyczyna infekcji dróg moczowych (dominuje u młodych kobiet), S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi mogą wywoływać infekcje zbliżone do infekcji wywoływanych przez S. epidermidis.

Diagnostyka Staphylococcus sp.

Podłoża:

• agar wzbogacony

• bulion wzbogacony

• podłoże agarowe z krwią (agar wzbogacony krwią baranią) - krwinki są hemolizowane przez  i  hemolizyny (obserwacja hemolizy po 24h inkubacji); gronkowce tworzą kolonie białe, szare lub złocistopomarańczowe, gładkie, okrągłe, wilgotne, kopulaste

• podłoże Chapmana z mannitolem i NaCI (wybiórczo-różnicujące); wysokie stężenie NaCI (7,5%) jest czynnikiem wybiórczym, który hamuje wzrost większości Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, oprócz gronkowców mogą na tym podłożu wzrastać bakterie wykazujące tolerancję na NaCI takie jak Bacillus i Corynebacterium, Micrococcus, Enterococcus, grzyby drożdżopodobne;

• różnicująca właściwość tego podłoża jest wynikiem obecności mannitolu, niektóre gatunki gronkowców np. S. aureus fermentują mannitol tworząc żółte kolonie otoczone żółtą obwódką, drobnoustroje nie fermentujące mannitolu np. S epidermidis w większości przypadków są małe i otoczone czerwoną lub purpurową obwódką

• podłoże Baird-Parkera (wybiórczo-różnicujące) służy do namnażania szczepów Staphylococcus aureus szczególnie izolowanych z produktów żywnościowych i leków. Jest bogate w składniki odżywcze: trzy peptony, glicynę i pirogronian sodu, który pobudza wzrost szczepów zmienionych podczas produkcji żywności. Wybiórczość podłoża w stosunku do Staphylococcus aureus zapewnia chlorek litu. Telluryn potasu (czynnik wybiórczy) ulega redukcji, powodując czarne zabarwienie kolonii. Obecność żółtka jaja kurzego pozwala wykryć lipazę wytwarzaną przez niektóre szczepy Staphylococcus aureus, wokół nich pojawia się przejaśnienie a niekiedy drobna precypitacja. Na tym podłożu mogą się rozwijać również drobnoustroje inne niż gronkowce np. Enterococcus, Listeria, proteus, Pseudomonas, grzyby drożdżopodobne, lecz żaden z tych drobnoustrojów nie wytwarza jaśniejszej otoczki

Testy różnicujące gronkowce od innych ziarniaków Gram-dodatnich

• Test na wytwarzanie katalazy - dla odróżnienia od enterokoków, które są katalazo-ujemne.

• w podłożu płynnym do 5ml hodowli bulionowej dodajemy 1ml 3% H₂O₂. Szczepy koagulazo (+) powodują uwolnienie tlenu z H₂O₂ co objawia się burzeniem hodowli. Oznaczanie kontrolne polega na dodaniu H₂O₂ do niezaszczepionego podłoża.

• w podłożu stałym: nakropienie na kolonię 3% H₂O₂. Kontrola - nakropienie samego podłoża (nie wykonuje się na podłożach z krwią).

• Tolerancja tlenu - posiew na podłoża tlenowe i beztlenowe do odróżnienia od mikrokoków, które są wyłącznie tlenowe

• Test na oznaczanie zdolności do wykorzystania cukrów z wytworzeniem kwasu w warunkach tlenowych i beztlenowych - odczyn O-F (oxidatiors-fermentation test). Wykorzystuje się w tym celu zmodyfikowane podłoże Hugh - Leifsona z glukozą [ inne niż przy Gram (-)]. Do dwóch probówek z podłożem posiewamy oczko hodowli aż do dna probówek. Jedną z probówek pokrywamy następnie warstwą jałowej parafiny (w tym przypadku przed posiewem podłoże należy zregenerować). Inkubacja 5 dni, odczyt codziennie. Jeśli cukier jest wykorzystywany z wytworzeniem kwasu - następuje zmiana zabarwienia z ciemno - fioletowego na żółty. Brak zmiany zabarwienia świadczy o niewykorzystaniu cukru Gronkowce cechują się beztlenowym rozkładem glukozy (zmiana zabarwienia podłoża na żółte w otwartej i pokrytej parafiną probówce) w odróżnieniu od mikrokoków, które utleniają glukozę (zmiana zabarwieniapodłoża na żółte w „otwartej" probówce) lub są asacharolityczne (brak zmiany zabarwienia w obu probówkach).

• Oznaczenie wrażliwości na furazolidon - odróżnienie wrażliwych na furazolidon gronkowców od opornych mikrokoków. Test wykonuje się metodą dyfuzyjno-krążkową.. Zawiesinę drobnoustrojów o gęstości 0,5 wg skali MacFarlanda posiewa się wymazówką na podłoże Mueller-Hintona (grubość 3,5 - 4 mm), nakłada się krążek wysycony furazolidonem, preinkubacja w temp. pokojowej 15 min, inkubacja w 35-37°C 18-24h.

• Oznaczanie oksydazy cytochromowej. Oksydaza cytochromowa katalizuje w obecności tlenu utlenianie zredukowanych cytochromów, występuje u drobnoustrojów bezwzględnie tlenowych np. Micrococcus sp. Wykrywanie oksydazy cytochromowej oparte jest na zastosowaniu odczynników, które są bezbarwne lecz po utlenieniu staja się barwne.

• Odczynniki: 1--naftol (1% r-r w C₂H₅OH 96 %), 2 - chlorowodorek p-aminodwumetyloaniliny (1% r-ó w wodzie). Oznaczenie mężna wykonać dodając odczynniki do zawiesiny bakterii w wodzie lub poprzez naniesienie bakterii z hodowli stałej na krążek bibuły wysycony odczynnikami. W obecności oksydazy z dodawanych odczynników powstaje błękit indofenolu, co objawia się wystąpieniem intensywnie niebieskiego zabarwienia w ciągu 30s - 2 min.

Testy różnicujące gronkowce wewnątrzrodzajowo

• Oznaczanie wytwarzania koagulazy - test ten służy do różnicowania S. aureus od innych gronkowców (poza S. aureus koagulazę wytwarza kilka innych gatunków lecz występują one głównie u zwierząt). Koagulaza jest to enzym, który ścina osocze. Występuje ona w dwóch formach. Pierwsza to koagulaza związana dumping factor) - związana ze ścianą komórkową, wykrywana jest testem szkiełkowym. Koagulaza związana działa bezpośrednio na fibrynogen tworząc nierozpuszczalny skrzep fibryny (grudki).
  Druga forma to wolna koagulaza, która jest wydzielana przez komórki i 'wykrywana jest w teście probówkowym. Koagulaza zewnątrzkomórkowa reaguje z „coagulase-reacting factor (CRF) tworząc coagulase-CRF complex, substancje, która jest klinicznie nie do odróżnienia od trombiny. Ten kompleks następnie działa na fibrynogen i powstaje nierozpuszczalny skrzep fibryny.

• Test szkiełkowy. Przeprowadza się z zastosowaniem osocza króliczego (odpowiednio przygotowane z cytrynianem sodu lub preparat gotowy w formie liofilizowanej). Na szkiełku podstawowym umieścić obok siebie dwie krople roztworu soli fizjologicznej, w obu kroplach zawiesić badane bakterie (gęstość homogennej zawiesiny powinna w przybliżeniu odpowiadać wyglądowi mleka - gęsta zawiesina). Do jednej kropli dodać oczko ezy osocza i delikatnie wymieszać: W ciągu kilkunastu sekund powinny pojawić się wyraźne kłaczki - wynik dodatni. Zawiesina bakterii bez dodanego osocza powinna pozostać homogenna. Pojawienie się kłaczków w zawiesinie bez osocza świadczy o autoaglutynacji bakterii i nie może być podstawą do przyjęcia wyniku ani dodatniego ani ujemnego.

• Test probówkowy. Stosuje się osocze królicze (odpowiednio przygotowane z cytrynianem sodu lub preparat gotowy w formie liofilizowanej). Do 0,5 ml zawiesiny badanych gronkowców dodać 0,5 ml osocza. W identyczny sposób przygotować kontrole ze szczepami koagulazo-ujemnym i koagulazo-dodatnim. Inkubować w temp. 37°C. Wynik testu należy odczytywać po 1, 3 , 6, 24 h. Wynik dodatni -wyraźny skrzep.

• Slidex Staph Kit - zestaw do diagnostyki gronkowców in vitro (szybka identyfikacja S. aureus). Test ten jest połączeniem testu lateksowego z testem hemaglutynacji i służy do wykrywania obecności czynnika zlepnego (dumping factor), białka A i innych antygenów swoistych dla S. aureus.

• Odczynniki: R1 - odczynnik przeciw S. aureus (anti S. aureus reagent), krwinki czerwone uczulone fibrynogenem i lateks uczulony IgG (anti-S. aureus, monoklonalna), mertiolat sodu, azydek sodu. Odczynnik R2 - odczynnik kontrolny, nieuczulone krwinki czerwone i nieuczulony lateks, mertiolat sodu, azydek sodu.

• Wymieszać odczynnik testowy R1 i kontrolny R2. Na czyste szkiełko podstawowe nanieść kroplę odczynnika R1 i R2, do każdej kropli dodać po kilka kolonii bakterii, wymieszać każdą kroplę (ok. 10 s), poruszać delikatnie ruchem kolistym (ok. 20 s). Wynik dodatni - aglutynacja w ciągu 30 s wykazująca widoczny zlep uczulonych krwinek czerwonych i/lub lateksu przy ujemnej kontroli (z odczynnikiem R2). Wynik ujemny - jednorodna zawiesina zarówno w kropli z odczynnikiem R1 jak i z R2

• Oznaczenie wrażliwości na nowobiocynę. Badanie wykonuje się identycznie jak oznaczanie wrażliwości na furazolidon.

• Oznaczanie DNAzy.

Mikrotesty - systemy, zestawy

API STAPH jest biochemicznym systemem identyfikacji gronkowców i mikrokoków w oparciu o 19 testów różnicujących (wytwarzanie kwasu z 14 węglowodanów, redukcja azotanów do azotynów, wytwarzanie fosfatazy zasadowej, wytwarzanie acety-metylo-karbinolu, dihydrolaza argininy, ureaza). API STAPH składa się z pasków zawierających odwodnione substraty testowe w pojedynczych probówkach. Substraty rozpuszcza się przez dodanie do każdej mikrobrobówki zawiesiny testowanego szczepu. Następnie inkubuje się 18 h (w niektórych przypadkach 48h) w temperaturze 30-37°C. Odczyt i interpretacja zgodnie z informacjami podanymi przez producenta.

ATB - ID 32 STAPH jest systemem umożliwiającym identyfikację rodzajów Staphylococcus, Micrococcus, Stomatococcus, Aerocoecus składającym się ze standaryzowanych testów biochemicznych. Szereg biochemiczny ID 32 STAPH składa się z 32 zagłębień, z których 26 służy do wykonywania testów, każde zagłębienie zawiera suche substraty. Po 24 h inkubacji zachodzące reakcje odczytuje się w automacie ATB lub wizualnie. Identyfikację przeprowadza się przy pomocy tabeli identyfikacyjnej, Książki Kodów lub odpowiedniego oprogramowania.

Inne: RAPID ATB STAPH, System SCEPTOR G+, Staph-track, Minitek Gram-Positive System, Microscan G+ System, Wek GPI card, Auto Microbic System.

Diagnostyka wybranych ziarniaków Gram (+) katalazo(-): Streptococcus sp. i Enterococcus sp.

Ziarniaki Gram-dodatnie katalazo-ujemne (ZGDKU) występują powszechnie w środowisku naturalnym (gleba, woda, rośliny, powietrze), w produktach żywnościowych pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Mogą kolonizować skórę i/lub błony śluzowe człowieka i uczestniczyć w zakażeniach z różną lokalizacją.

Rosną na podłożach stosowanych w diagnostyce laboratoryjnej. Należą do drobnoustrojów mezofilnych, optymalna temperatura wzrostu - 30 - 44°C. Rosną w obecności tlenu, w warunkach mikroaerofilnych , jak i beztlenowych. Nie wytwarzają przetrwalników, wiele jest opornych na wysychanie i przeżywają w powietrzu, glebie i innych składnikach środowiska. W preparatach barwionych układają się w dwoinki, tetrady, łańcuszki, mogą występować także pojedynczo lub tworzyć nieregularne skupiska.

Do ziarniaków Gram-dodatnich katalazo-ujemnych zaliczamy następujące rodzaje:

• Streptococcus - mikroflora górnych dróg oddechowych; duże znaczenie kliniczne

• Enterococcus - mikroflora przewodu pokarmowego; duże znaczenie kliniczne

• Gemella - mikroflora górnych dróg oddechowych; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

• Aerococcus - środowisko naturalne, produkty zwierzęce; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

• Leuconostoc - środowisko naturalne, znaczenie w przemyśle mleczarskim, przy produkcji marynat, win; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

• Pediococcus - środowisko naturalne, wykorzystywane w przemyśle browarniczym" i spożywczym (piwo, wino, sery, kiełbasy, produkty warzywne); bakterie kwasu mlekowego; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

• Lactococcus - występują w żywności, przewodzie pokarmowym u ludzi, wykorzystywane w przemyśle spożywczym; bakterie kwasu mlekowego; rzadko izolowane z materiałów klinicznych.

ZGDKU charakteryzują się zróżnicowaną wrażliwością na antybiotyki. Wszystkie są naturalnie oporne na amidynopenicyliny, monobaktamy i stare chinolony. Bakterie z rodzaju Streptococcus są naturalnie oporne na aminoglikozydy, z rodzaju Enterococcus są naturalnie oporne na aminoglikozydy, penicyliny, cefalosporyny, polimyksyny, linkozamidy. Pediococcus i Leuconostoc wykazują naturalną oporność wysokiego stopnia na wankomycynę.Naturalna zmniejszona wrażliwość na penicyliny występuje wśród ziarniaków z rodzajów Lactococcus, Leuconostoc i Aerococcus.

W diagnostyce ZGDKU wykorzystuje się następujące cechy:

• zdolność do wytwarzania hemolizy na podłożu agarowym z dodatkiem 5% krwi baraniej; hemoliza beta - całkowita - całkowity rozkład krwinek czerwonych, strefa hemolozy wyraźnie odgraniczona od reszty niezhemolizowanego podłoża, wielkość strefy często przekracza parokrotnie średnicę kolonii, alfa -częściowa - częściowe rozpuszczenie krwinek, zazielenienie podłoża, niewielka przejrzystość, wielkość strefy hemolizy alfa jest zwykle mniejsza niż hemolizy beta, gamma - brak hemolizy

• wzrost w 45°C

• wzrost w bulionie z 6,5% NaCI

• wzrost w bulionie o pH 9,6

• hydroliza L-pirrolidonyl - beta- naftylamidu przez aminopeptydazę pyrplidonylową (PYR) w wyniku czego powstaje naftylamid czerwonego koloru po dodaniu 0,01% odczynnika clnnamaldehydu

• hydroliza eskuliny - w wyniku rozkładu powstaje dekstroza i eskuletina, która reaguje z cytrynianem żelaza dając brązowo-brunatny produkt

• rozpuszczalność w żółci (identyfikacja S. pneumoniae) - sole żółci uczynniają enzymy autolityczne poprzez działanie na powierzchnię komórki w wyniku czego następuje liza komórki

• zdolność wzrostu w obecności żółci

• test CAMP (identyfikacja Streptococcus gr. 6) - czynnik CAMP (Co-cytolizyna B) jest ciepłostałą wydzielaną zewnątrzkomórkowo proteiną, która działa synergistycznie z toksyną beta gronkowców. Po posiewie na podłożu z krwią S. agalactiae i prostopadle do niego S. aureus wytwarzającego beta- hemolizynę wystąpi charakterystyczny trójkąt hemolizy

• wrażliwość na bacytracynę (identyfikacja S. pyogeneś) - krążee" wysycony bacytracyną (substancja o działaniu przeciwdrobnoustrojowym produkowana przez bakterie Gram-dodatnie) w stężeniu 0,04 j

• wrażliwość na optochinę (identyfikacją S. pneumoniae) - krążek wysycony optochiną w stężeniu 5 μg

• obecność antygenu grupowego (wielocukru C) - po ekstrakcji enzymatycznej antygeny polisacharydowe znajdujące się w ścianie komórkowej paciorkowca uwidaczniają się w reakcji aglutynacji cząsteczek lateksu uczulonych swoistymi, grupowymi immunoglobulinami króliczymi

Rodzaj Streptococcus

Rodzaj Streptococcus skupia liczne gatunki charakteryzujące się odmiennymi właściwościami fenotypowymi i

genotypowymi oraz różną chorobotwórczością.

Według ostatniej klasyfikacji dzielony jest na sześć grup filogenetycznych (I-VI) na podstawie różnic w sekwencji podjednostki 16S rRNA.

Na przestrzeni lat wprowadzano różne schematy klasyfikacyjne streptokoków.

1. Podział uwzględniający typy hemolizy na podłożu agarowym z 5% krwią baranią:

• paciorkowce beta-hemolizujące - wytwarzające hemolizyny, które całkowicie rozkładają krwini czerwone

• paciorkowce alfa-hemolizujące - wytwarzające hemolizyny, które częściowo rozkładają krwini czerwone

• paciorkowce niehemolizujące (gamma-hemolizujące) - nie wytwarzające hemolizyn

2. Klasyczny podział na grupy serologiczne wg Rebeki Lancefield (1933)

Podział ten uwzględnia różnice węglowodanów (immunologicznie czynny wielocukier C) wchodzących w skład ściany komórkowej. Grupy serologiczne oznaczone są dużymi literami alfabetu od A do W. Jest szczególnie przydatny dla klasyfikacji paciorkowców beta-hemolizujących.

3. Podział praktyczny

• paciorkowce ropotwórcze

• Grupa A - Streptococcus pyogeneś. Na podłożu z krwią wywołują hemolizę typu beta

• Grupa B - Streptococcus agalactiae. Na podłożu z krwią wywołują hemolizę typu beta, mogą też występować szczepy o typie hemolizy alfa lub gamma

• Grupa C - S. equi; ssp. equi (hemoliza beta;, S. equi ssp zooepidermicus (hemoliza beta), S. equisimilis (hemoliza beta). S. dysgalactiae (hemoliza alfa).

• Streptococcus pneumoniae (hemoliza alfa). Szczepy tego rodzaju nie maja antygenu grupowego (wielocukru C)

• paciorkowce jamy ustnej (do niedawna nazywane „grupa viridans" - zieleniące)

• Grupa S. mutans (hemoliza gamma)

• Grupa S. salivarius (hemoliza gamma)

• Streptococcus bovis (hemoliza gamma; grupa serologiczna D)

• Grupa S. milleriQub S. anginosus); (hemoliza gamma, alfa, beta; grupa serologiczna A, C, F, G)

• Grupa S. sanguis (lub S. oralis); (hemoliza alfa; grupa serologiczna H, W)

• Streptococcus mitis (hemoliza alfa; grupa serologiczna O - biołyp 1 oraz K - biotyp 2)

• inne - S. acidominimus, S. uberis

• paciorkowce wybredne (wymagają do wzrostu witaminy B6 lub innych związków np.: L-cysteiny, glutationu, tioglikolanu) - S. defektivus, S. adjacens

Podłoża

Paciorkowce należą do drobnoustrojów wybrednych. Rosną słabo lub nie rosną na podłożach zwykłych. Rosną dobrze na podłożach wzbogaconych takich jak: podłoże tryptozowo sojowe (TSA), wyciąg mózgowo sercowy (BHI), bulion Todd-Hewitfa, Columbia agar/bulion z dodatkim krwi lub surowicy, agar wzbogacony z dodatkiem krwi, bulion cukrowy. Podłoża wybiórcze:

• agar z krwią i z fioletem krystalicznym; fiolet krystaliczny powoduje zahamowanie wzrostu innych niż paciorkowce drobnoustrojów

• podłoża wybiórcze dla S. pyogenes - z dodatkiem neomycyny, trimetoprimu i sulfametoksazolu (STX), kolistyny - dodanie antybiotyków hamuje wzrost innych niż S. pyogenes drobnoustrojów występujących w górnych drogach oddechowych

Charakterystyka

Paciorkowce to Gram-dodatnie bakterie kształtu kulistego lub owalnego, w preparacie układają się w pary lub tworzą łańcuszki. Nie wytwarzają przetrwalników i poza nielicznymi wyjątkami nie wykazują ruchu. Fermentują glukozę do kwasu mlekowego. Są tlenowcami lub względnymi beztlenowcami. Na podłożu agarowym z krwią tworzą kolonie małe (0,5 - 1 mm), najczęściej wypukłe, gładkie, błyszczące, matowe lub śluzowe, często otoczone strefą hemolizy. Jednakże morfologia kolonii paciorkowców jest różnorodna. S. pyogenes tworzy kolonie małe, przeźroczyste, otoczone relatywnie dużą strefą beta-hemolizy. Kolonie S. agalactiae są większe, bardziej płaskie, kremowe, śluzowe i otoczone mniejszą strefą hemolizy, często możliwą do zaobserwowania po usunięciu kolonii. Kolonie S. pneumoniae są początkowo wypukłe, starsze kolonie mają wklęsły środek powstający na skutek działania enzymów autolitycznych, strefa hemolizy alfa przybiera zabarwienie brązowo-zielone. Paciorkowce grupy „viridans" tworzą kolonie małe, opalizujące, otoczone wyraźną strefą hemolizy alfa o zabarwieniu zielonym.

Diagnostyka paciorkowców oparta jest na ustaleniu typu hemolizy. Identyfikacja paciorkowców beta-hemolizujących polega na przeprowadzeniu testów serologicznych i klasyfikacji do grup A, B, C, D, F, G. Paciorkowce alfa lub gamma-hemolizujące identyfikuje się surowicami anty D i anty B. W celu dalszej identyfikacji przeprowadza się testy fizjologiczne i biochemiczne. Najczęściej wykonywane testy przedstawiono w poniższych tabelach.

W diagnostyce paciorkowców wykorzystywane są również zestawy komercyjne oparte na testach biochemicznych np.: test API 20S (test 24 godzinny), Rapid STR (test 4 godzinny). Do wykazania obecności paciorkowców (ich antygenów) bezpośrednio w materiale badanym wykorzystuje się lateksowe testy aglutynacyjne ( S. pyogenes, S. agalactiae, Grupa C paciorkowców, S. pneumoniae), test koaglutynacji (S. pyogenes) oraz testy immunoenzymatyczne (S. pyogenes, S. agalactiae).

Identyfikacja paciorkowców hemolizujących grup A-G - Slidex Strepto-kit

Po ekstrakcji enzymatycznej antygeny polisacharydowi znajdujące się w ścianie paciorkowca uwidaczniają się w reakcji aglutynacji cząstek lateksu uczulonych swoistymi grupowymi immunoglobulinami króliczymi.

Wykonanie:

2-3 kolonie zawiesić w 0,4 ml enzymu ekstrahującego w temp. 37°C przez 10-15 minut. Po jednej kropli lateksu nanieś na pola dodać 1 kroplę przygotowanej zawiesiny. Wymieszać patyczkiem. Wynik dodatni aglutynacja w ciągu 2 minut.

Antybiogram według wytycznych NCCLS

Test Camp:

Na płytce z podłożem Agar Columbia z 5% krwią baranią posiewamy pionowo S. aureus (musi dawać hemolizę) poziomo posiewamy S. pyogenes. Obserwujemy wzmożoną hemolizę.

Różnicowanie paciorkowców beta-hemolizujących

Drobnoustrój	Wrażliwość na bacytracynę	Wrażliwość naSTX	Antygen grupowy	Test CAMP	PYR
S. pyogenes	wrażliwy	oporny	A	-	-
S. agalactiae	oporny	oporny	B	+	-
Różnicowanie S. pneumoniae i grupy „viridans"
Drobnoustrój		Wrażliwość na optochinę		Rozpuszczalność w żółci
S. pneumoniae		wrażliwy		+
Grupa „viridans"		oporne		-

Rodzaj Enterococcus

Do lat osiemdziesiątych enterokoki zaliczano do grupy D paciorkowców. Inne paciorkowce należące do grupy D określano jako „nonenterococci" (S. bovis, S. equinuś). Przyczyną podziału paciorkowców grupy D na dwie Kategorie była przede wszystkim ich różnica we wrażliwości na antybiotyki betalaktamowe (enterokoki wykazują wyższe wartości MIC). W połowie lat osiemdziesiątych na podstawie badań genetycznych utworzono nowy rodzaj Enterococcus.

Aktualnie do rodzaju Enterococcus należy ponad 20 gatunków, z których u ludzi wykazano co najmniej 10. Najczęściej izolowanym gatunkiem jest E. faecalis (>95% izolatów), drugim co do częstości występowania jest E. faecium. Do rzadko izolowanych od ludzi należą następujące gatunki: E. avium, E. durans, E. gallinarum, E. hirae, E. raffinosus, E. casseliflavus, E. flavescens, E. dispar.

Charakterystyka

Do rodzaju Enterococcus należą ziarniaki Gram-dodatnie, katalazo-ujemne. W preparatach barwionych komórki układają się w pary lub łańcuszki. Są względnymi beztlenowcami. Rosną na podłożach zwykłych. Na podłożu agarowym z krwią powoduję hemolizę alfa, niektóre szczepy mogą wytwarzać hemolizę gamma lub beta. Wywołują one u ludzi zakażenia przewodu moczowego, szczególnie dotyczy to pacjentów hospitalizowanych, zakażenia ran i tkanek miękkich, zakażenia wewnątrzbrzuszne, zakażenia w obrębie miednicy, zapalenie wsierdzia, opon mózgowo-rdzeniowych, zakażenia wszczepów i protez.

Podłoża

Do hodowli drobnoustrojów z rodzaju Enterococcus stosowane są podłoża:

• agar wzbogacony z dodatkiem 5% krwi baraniej

• podłoże tryptozowo sojowe

• wyciąg mózgowo sercowy

• D-Coccosel agar - podłoże wybiórcze dla mikroorganizmów rosnących w obecności żółci (czynnik wybiórczy). Na tym podłożu może rosnąć większość pałeczek Gram-ujemnych, Staphylococcus sp, grupa D Streptococcus i Enterococcus sp. lecz jedynie grupa D Streptococcus i Enterococcus sp hydrolizują eskuiinę (czynnik różnicujący) do eskuletiny, która reaguje z zawartym w podłożu cytrynianem żelazowo-amcnowym dając brązowo-czamy produkt

Identyfikacia enterokokow do rodzaju uwzględnia następujące cechy:

• wygląd kolonii i rodzaj hemolizy na podłożu agarowym z krwią baranią

• wygląd drobnoustrojów w preparacie barwionym metodą Grama

• wytwarzanie katalazy wzrost w bulionie z 6,5% NaCI

• wzrost w podłożu płynnym o pH 9,6

• wzrost w 45°C wzrost na podłożu z żółcią hydroliza eskuliny

• hydroliza L-pyrrolidonyl-beta-naftylamidu (PYR)

• przynależność do grupy serelogicznej D

W celu identyfikacji enterokokow do gatunku wykorzystuje się następujące cechy:

• fermentacja cukrów i alkoholi (mannitol, sorbitol, sorboza, arabinoza, rafinoza, sacharoza, laktoza)

• hydroliza argininy

• tolerancja tellurynu potasu (0,04% w podłożu stałym)

• wykorzystanie pirogronianu

• ruch

• wytwarzanie barwnika

• wzrost w 10°C

Do identyfikacji bakterii z rodzaju Enterococcus stosowane są biochemiczne testy komercyjne wykorzystywane w diagnostyce paciorkowców.

Różnicowanie Enterococcus spp. i paciorkowców grupy D

Testy	Enterococcus spp.	Paciorkowce grupy D
Wzrost w bulionie z 6,5% NaCI	+	-
Wzrost w podłożu płynnym o pH 9,6	+	-
Hydroliza eskuliny	+	+
Wzrost na podłożu z żółcią	+	+
Hydroliza L-pyrrolidonyl-beta-naftylamidu (PYR)	+	-
Antygen grupowy	D	D
Typ hemolizy	alfa, beta, gamma	alfa, gamma

---