Trucizny znajdujące się w materiale biologicznym występują w niewielkich ilościach, w dużym rozproszeniu i pod postacią różnorodnych, bardziej lub mniej trwałych połączeń z innymi substancjami. Aby efektywnie zidentyfikować toksynę musi być ona wyodrębniona z materiału biologicznego w postaci czystej i możliwie zagęszczonej. Specyficzną grupę trucizn stanowią metale ciężkie, które z białkami zwierzęcymi i roślinnymi tworzą trwałe, złożone kompleksy typu albuminatów. Wyodrębnienie metali z takich połączeń możliwe jest przy przeprowadzeniu mineralizacji. Mineralizacja polega na zniszczeniu substancji organicznych, w celu przeprowadzenia poszukiwanych metali w postać jonową, co umożliwia ich identyfikację.

Mineralizację zazwyczaj przeprowadza się:

Na sucho - spalanie w piecu elektrycznym w temp. 400 - 500°C

Na mokro - przy użyciu silnych kwasów nieorganicznych (HNO3, H2SO4,

HCIO3) i substancji utleniających (H₂0₂)

Obydwa te sposoby są jednak czasochłonne i długotrwałe - czas mineralizacji w zależności od materiału biologicznego waha się od kilu do kilkunastu godzin.

Obecnie w mineralizacji na makro stosowane są urządzenia mikrofalowe (działanie podobne jak kuchenek mikrofalowych), które skracają czas mineralizacji do kilkunastu minut. Otrzymany po mineralizacji roztwór (mineralizat) poddaje się ilościowemu i jakościowemu oznaczeniu. W tym celu wykorzystuje się metody analityczne oparte na spektroskopii atomowej - dziedzinie nauki zajmującej się badaniem widm występujących przy oddziaływaniu promieniowania elektromagnetycznego z materią. Obejmują one trzy różne techniki analityczne: emisję atomową, absorpcję atomową i fluorescencję atomową.

ASA - ATOMOWA SPEKTROMETRIA ABSORPCYJNA

Aby zrozumieć sens najbardziej specyficznej z technik spektroskopowych niezbędna jest znajomość podstawowych zagadnień związanych z budową atomu oraz zjawisk w nim zachodzących.

Każdy atom składa się z jądra o dodatnim ładunku elektrycznym i z elektronów. Każdy pierwiastek charakteryzuje się określoną wielkością ładunku jądra i odpowiadającą temu liczbą elektronów umieszczonych na orbitach. Elektrony zajmują poszczególne poziomy energetyczne w ściśle określony i uporządkowany sposób. Stan charakteryzujący się najmniejszą energią - stan podstawowy odpowiada charakterystycznej dla danego atomu podstawowej konfiguracji elektronów. Przejście atomu ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego może nastąpić tylko w przypadku dostarczenia mu energii o odpowiedniej wartości. W wyniku procesu wzbudzenia walencyjny elektron przenoszony jest do poziomu o wyższej energii - stanu wzbudzonego. Atom może znajdować się w stanie podstawowym przez czas nieograniczony. Wszystkie pozostałe stany mają wyższą energię i są stanami wzbudzonymi o określonym, skończonym czasie życia. Stan wzbudzony atomu jest stanem niestabilnym. Atom spontanicznie powraca do konfiguracji stanu podstawowego. W tym procesie elektron powraca na orbital wyjściowy, a utracona przez atom energia, równa energii zaabsorbowanej w procesie wzbudzenia, przechodzi całkowicie w formę energii promienistej. Zjawisko to zostało przedstawione schematycznie na rysunku 1. Należy zauważyć, że etap 1 - wzbudzenie - jest związany z dostarczeniem energii z zewnątrz. Natomiast emisja promieniowania, przedstawiona w etapie 2, zachodzi spontanicznie. Długość fali emitowanego promieniowania jest związana z odpowiednim przejściem elektronu z poziomu wzbudzonego na poziom o niższej energii. Jak wspomniano wcześniej, atom danego pierwiastka charakteryzuje się określoną strukturą elektronową, dlatego też emitowane przez atom promieniowanie o danej długości fali stanowi własność charakterystyczną każdego pierwiastka.

Dla dużych atomów struktura elektronowa jest coraz bardziej skomplikowana i stąd dla wielu możliwych przejść elektronowych występuje wiele odpowiadających im długości fal emitowanego promieniowania.

Zjawiska zachodzące przy wzbudzaniu atomu i przy powrocie elektronu do stanu podstawowego są podstawą wymienionych wcześniej technik spektroskopii atomowej. Do celów analitycznych wykorzystuje się zarówno pomiar energii zaabsorbowanej w czasie procesu wzbudzenia, jak i energii wyemitowanej. W metodach emisyjnych do próbki dostarczana jest wysoka energia, najczęściej w postaci termicznej, pozwalająca na efektywne wzbudzenie obecnych atomów, które w następstwie emitują odpowiednie promieniowanie. Źródłem energii może być łuk elektryczny, płomień lub szeroko wykorzystywana obecnie plazma. Widmo emisyjne tak wzbudzonego pierwiastka ma charakter liniowy i składa się z wielu oddzielnych linii emisyjnych. Otrzymane widmo emisyjne może być wykorzystywane do identyfikacji obecności pierwiastka w próbce. Metody emisyjne mogą być również wykorzystywane do określania ilości pierwiastka w próbce.

Jeżeli wiązka promieniowania o długości fali charakterystycznej dla danego pierwiastka zostanie skierowana na atomy w stanie podstawowym, to atomy mogą zaabsorbować część promieniowania. Przejście atomów do stanu wzbudzonego, w wyniku absorpcji promieniowania, nazywamy absorpcja atomowa. Promieniowanie jest jedną z form energii, która powoduje wzbudzenie atomu. Zdolność atomu do absorpcji promieniowania o ściśle określonej długości jest wykorzystywana w atomowej spektrometrii absorpcyjnej.

ZASADY ABSORPCJI ATOMOWEJ

W metodzie absorpcji atomowej mierzy się ilość światła zaabsorbowanego przy danej długości fali w czasie przejścia promieniowania przez chmurę atomów. W miarę wzrostu ilości atomów obecnych na drodze promieniowania, wzrasta w określony sposób ilość zaabsorbowanego światła. Na podstawie pomiarów ilości zaabsorbowanego promieniowania, można prowadzić ilościowe oznaczanie obecnego w próbce analitu. Użycie odpowiedniego źródła światła oraz prawidłowy wybór długości fali pozwala na selektywne oznaczanie zawartości danego pierwiastka w obecności innych atomów.

Chmura wolnych atomów analitu, przez którą przechodzi wiązka świetlna, jest otrzymywana w wyniku dostarczenia do próbki odpowiedniej ilości energii termicznej. Obecne w próbce cząsteczki ulegają dysocjacji, w wyniku której powstają wolne atomy zdolne do absorpcji przepuszczanego promieniowania.

OGÓLNA BUDOWA SPEKTROMETRU ABSORPCJI ATOMOWEJ

Aparatura pomiarowa składa się z trzech podstawowych elementów. Są to mianowicie: źródło światła, atomizer, układ pomiarowy( min. monochromator, detektor).

W metodzie absorpcji atomowej niezbędne jest źródło promieniowania emitujące wąskie linie atomowe oznaczanego pierwiastka. Do najczęściej stosowanych obecnie źródeł należą lampy o konstrukcji pozwalającej na emisję promieniowania o określonej długości fali. Wykorzystanie źródeł światła o takich właściwościach nie tylko pozwala na uzyskiwanie dużej czułości, ale również powoduje, że absorpcja atomowa jest specyficzną metodą analityczną. Do najczęściej stosowanych w tej metodzie źródeł światła zaliczamy lampy z katodą wnękową i bezelektronowe lampy wyładowcze.

Specjalne wymagania są stawiane budowie atomizera, czyli elementu służącego do otrzymywania wolnych atomów oznaczanego pierwiastka. Chmura atomów powinna znajdować się na drodze wiązki emitowanej ze źródła światła. Atomizacja może zachodzić w płomieniu lub elektrycznie ogrzewanym piecu, umieszczonych na drodze optycznej spektrometru. W atomizerze zachodzą dwa procesy: dysocjacja termiczna, czyli wytworzenie chmury wolnych atomów oraz absorpcja atomowa.

Do pomiaru natężenia promieniowania służy odpowiedni układ pomiarowy składający się najczęściej z wielu elementów. Monochromator - służy do wyodrębniania wybranego wąskiego pasma o odpowiedniej długości fali z wiązki światła emitowanej ze źródła. Możliwość wyboru specyficznego źródła światła oraz pomiaru przy konkretnej długości fali, pozwala na selektywne oznaczanie wybranego pierwiastka w obecności innych składników. Promieniowanie o wydzielonej przez monochromator długości fali dociera do detektora, nazywanego „okiem" przyrządu. W stosowanych do tego celu fotopowielaczach mierzy się sygnał elektryczny proporcjonalny do intensywności promieniowania padającego na fotoczułą powierzchnię. Otrzymany sygnał przeliczany jest tak, aby bezpośrednio odpowiadał stężeniu oznaczanego składnika w próbce.

POMIARY ILOŚCIOWE W ABSORPCJI ATOMOWEJ

Absorbancja

Wielkość opisująca ilość zaabsorbowanego promieniowania, związana jest z występowaniem liniowej zależności między absorbancją a stężeniem. Zależność ta opisana jest prawem Beera A = a b c

gdzie: A - Absorbancja, a - współczynnik absorpcji opisujący własności danej substancji,; b - długość drogi optycznej czyli grubość warstwy absorbującej, c -stężenie analitu.

Równanie Beera pokazuje, że w danych warunkach pomiarowych absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia analitu. Zależność ta obserwowana jest w metodzie absorpcji atomowej.

Pomiar absorbancji dla roztworów wzorcowych zawierających znane stężenia analitu pozwala na wykreślenie krzywej kalibracji opisującej zależność A od c. W zakresie spełniającym prawo Beera krzywa kalibracji jest linią prostą. Wyznaczanie zależności A od c pozwala na pomiar absorbancji roztworu o nieznanej zawartości analitu i obliczenie jego stężenia na podstawie krzywej kalibrowania.

ZASTOSOWANIE PIECA GRAFITOWEGO

Metoda absorpcji atomowej z atomizacją w piecu grafitowym ze względu na dużą czułość jest szczególnie przydatna w analizie śladowej metali. Możliwość rutynowych oznaczeń większości pierwiastków na poziomie u.g/L jest szczególnie istotna w przypadku próbek naturalnych.

Nowoczesne przyrządy pozwalają na analizę próbek o bardzo złożonym składzie, a mianowicie materiałów biologicznych i geologicznych. Możliwość prowadzenia oznaczeń w próbkach o mikrolitrowych objętościach jest dodatkową zaletą. Dotyczy to szczególnie tych przypadków, gdy dostępne są ograniczone ilości materiału, jak ma to miejsce w przypadku analizy klinicznej.

ZATRUCIE MOCZNIKIEM

LD₅₀> 10.000 mg/kg (mało szkodliwy)

Źródła zatruć

• stosowany jako nawóz sztuczny na użytki (wypicie wody z pobliskich zbiorników wodnych lub spasanie na świeżo nawożonym pastwisku)

• dodatek paszowy Mieszanka B 2% mocznik (niedokładne wymieszanie lub zbrylenie nawozu w paszy)

• pasze zawierające nadmierną ilość mocznika

• równoczesne żywienie paszami wysoko białkowymi lub śrutą sojową

• niedokładne wymieszanie z innymi komponentami mieszanki pasz treściwych

Zatrucie mają charakter przypadkowy o przebiegu ostrym.

Zatrucia mocznikiem stanowią problem u przeżuwaczy (bydła i owiec).

Toksyczność mocznika zależy:

• sposobu podania

• wysokości dawki

• jakościowego składu zadawanej paszy

• indywidualnej wrażliwości

• choroby wątroby np.; motylica wątrobowa

• nagłej zmiany paszy

Mechanizm toksyczności

Mocznik pod wpływem ureazy, enzymu wytwarzanego przez drobnoustroje w żwaczu, ulega rozkładowi do C0₂ i NH3 NH3 w pewnej części jest wykorzystywany przez mikroorganizmy żwacza do budowy własnego białka a część jest resorbowana do krwi i w wątrobie zostaje związana w cyklach biochemicznych.

W przypadku zatrucia rozkład jest szybki i gwałtowny; nadmiar NH3 ulega wchłonięciu do krwi i działa toksycznie na enzymy oddychania wewnętrznego układu nerwowego. Doprowadza to do zasadowicy krwi przechodzącej z czasem w kwasicę.

Dawkowanie: LD₅₀(NH₃)-10mg/kg

♦ dawki letalne:

- bydło, owce- l-l,5g/kg m.c. - koń- 4g/kg m.c. - świnia- 4,4g/kg m.c.

♦ dawki toksyczne: 0,3-0.,5g/kg m.c.
- owce 0,5 g/kg mc

Dzienna dawka dla bydła 50-150g mocznika podawana w 2 porcjach na dzień lnie stanowi zagrożenia.

\ Dawka 0,15-0,3 g/kg m.c. dla owcy powoduje wzrost NH3 w płynnej treści I żwacza do 50 a czasami do 90-120 mg%. Po 5-7 godzin poziom NH3 wraca do normy.

Dawka 2,4g/kg m.c. podnosi poziom NH3 w płynnej treści żwacza do 350-560 > mg/lOOg i prowadzi zwykle do śmierci. Dawka l,2g/kg m.c po kilkurazowym podaniu z karmą doprowadza do śmierci.

Poziom mocznika do 2,8% w paszy nie powoduje zmian (sub-)klinicznych.

Poziom 4,3% może doprowadzić do śmierci zwierząt skarmianych paszą z

mocznikiem.

Kinetyka i metabolizm

Uwalniany w żwaczu NH3 wchłania się w ścianie żwacza do krwi. Żyłą wrotną dostaje się do wątroby i tu ulega biotransformacji w cyklu ornitynowym i kwasu cytrynowego. Powstaje mocznik jako związek nie toksyczny i inne związki np. węglan amonowy i karbaminiany. Nie związany nadmiar NH₄ i mocznik z krwią rozmieszczają się po całym organizmie. W nerkach wydalane z moczem; w śliniankach wydzielane do śliny (krążenie mocznikowe).

Objawy kliniczne:

♦ Postać nadostra

Szybka śmierć w ciągu kilku minut bez wyraźnych objawów:

♦ Postać ostra

Objawy nerwowe występują w ciągu 15-60 minut:

• pobudliwość, bojaźliwość, agresja

• nadmierna ruchliwość, skurcze, drgawki, zgrzytanie zębami

• pozycja „kozła do cięcia drewna, śmierć Zakwaszenie krwi i działanie jonu NH4

♦ Postać podostra

Występują objawy z układu pokarmowego:

• wzdęcia, niestrawność, biegunki gnilne

• ślinotok, pienisty wypływ z nozdrzy

• parcie na kał i mocz (poliuria i oliguria)

Zaburzenia w oddychaniu: duszność, przyspieszenie oddychania.

• Postać przewlekła

Występują zaburzania przewodu pokarmowego:

• wychudzenie, niestrawność, depresja

• zwiększone wydalanie moczu !!!!! (czasami jedyny objaw)

• zmniejszona produkcyjność (mleka, mięsa)

Zmiany anatomicznopatologiczne:

• Przewód pokarmowy
żwacz - zapach NH3

ściana żwacza w miejscu przejścia w przełyk galaretowata Błona śluzowa przedżołądków, trawieńca i dwunasynicy przekrwiona.

• Wątroba

• żółtawoczerwona

• silnie przekrwiona

• ogniska zwyrodnienia

• Układ oddechowy płuca - rozedma i obrzęk klatka piersiowa - płyn

• Serce, tkanka tłuszczowa, mięśnie szkieletowe - wybrocznyn

Rozpoznanie

• Wywiad

• Objawy kliniczne

• Diagnostyka laboratoryjna: Próbki:

• treść żwacza NH4

• pasze i komponenty, którymi były żywione zwierzęta - mocznik

• krew ( oznaczanie NH₄) Cel:

- stwierdzenie wysokiej zawartości NH₃w treści żwacza i trawiencu
oznaczanie ilości mocznika w paszy (4,2% zatrucie śmiertelne)

Poziom NH3

- 2mg% we krwi - zatrucie śmiertelne

- 0,6-1,4 mg%- zatrucie z pomyślnym rokowaniem
Poziom NH4 w treści żwacza:

• do 80mg% - fizjologicznie

• 140-240mg%- zatrucie z pomyślnym rokowaniem powyżej 240 mg%- zatrucie śmiertelne

Rokowanie: OSTROŻNE

Leczenie:

W początkowym stadium

1-2 1 - 2% zimnego roztworu kwasu octowego p.o Wystąpienie objawów nerwowych (drgawki)- barbiturany. W/w roztwór jest już nieskuteczny.

• kwas orotowy - 10g/ dzień przez 5 dni

• serwatka 0,5l/dzień przez 4 dni Wlewy Lv. - glukonianu wapnia Podawanie płynów PWE z Mg, Ca, glukoza

Zapobieganie:

• stopniowe przyzwyczajanie zwierząt do żywienia paszami mocznikowymi:

• dokładne dawkowanie;

r- równomierne wymieszanie mocznika z paszą treściową;

• zwracać uwagę w przypadku podawania mocznika w roztworze, z paszami wysokobiałkowymi i z śrutą sojową (zawiera ureaze)

• nie wypasać zwierząt na terenach świeżo nawożonych mocznikiem

• nie podawać:

• cielętom poniżej 4 miesiąca

• jagniętom

• ciężarnym krowom

innym gatunkom zwierząt oprócz przeżuwacz

---