18.03.2013

Wykład 15

Laboratoryjne wskaźniki stresu oksydacyjnego

Stres oksydacyjny - uszkodzenie komórek spowodowane działaniem reaktywnych form tlenu (H₂O₂, rodnikiem ponadtlenkowym, tlenem singletowym). Ter,min medyczny odnoszący się do uszkodzenia komórek roślin lub zwierząt (względnie w następstwie narządów lub tkanek w które wchodzą uszkodzene komórki) spowodowany działaniem RFT (głównie nadtlenkiem wodoru, rodnikiem ponadtlenkowym, tlenem singletowym, peroksyazotanem)

stres oksydacyjny = nierównowaga między prooksydantami i antyoksydantami

Wolne rodniki powstają podczas

• redukcji tlenu oddechowego do H₂O

• metabolizmu kwasów tłuszczowych

• podczas ostrych i przewlekłych odpowiedzi immunologicznych( w celu neutralizacji wirusów i bakterii)

Powstawanie WRT- przy udziale tlenu (akceptor). Donatorami są różne związki chemiczne o charakterze reduktorów. Całkowita redukcja O₂:

O₂ + 4e + 4H⁺ → 2H₂O

• W procesie niepełnej redukcji powstają wzbudzone formy pośrednie, o dużej reaktywności RFT.

• Uszkodzenia przez RFT są kumulowane z wiekiem.

• Są atomami lub cząsteczkami z przynajmniej 1 niesparowanym e

• pod wpływem różnych czynników środowiskowych stężenie ROS/RNS drastycznie wzrasta i w konsekwencji mogą zachodzić znaczące uszkodzenia struktur komórkowych (stres oksydacyjny)

Reaktywne formy tlenu

• tlen singletowy

• tlen tripletowy

• rodnik peroksylowy

• rodnik wodoronadtlenkowi

• rodnik ponadtlenkowy

• rodnik hydroksylowy

• nadtlenek wodoru

• alkoksyrodnik

• wodoronadtlenek

RFA - reaktywne formy azotu

• rodnik tlenku azotu

• rodnik dwutlenku azotu

• rodnik peroksyazotowy

RFT

• należą do naturalnych metabolitów tlenu/azotu, odgrywają rolę w sygnalizacji komórkowej

• „żyją” bardzo krótko (msec), poruszają się bardzo szybko

• małe cząsteczki o dużej reaktywności związanej z niesparowanym e

Wolne rodniki - źródła:

• zanieczyszczenia w glebie i atmosferze (ozon, NO₂)

• herbicydy, niektóre nawozy sztuczne

• leki, używki, narkotyki

• papierosy

• światło słoneczne

• promieniowanie jonizujące.

Nierównowaga między systemem antyoksydacyjnym a działaniem oksydantów.

Antyoksydanty	Prooksydanty
dysmutaza glutationowa peroksydaza katalaza witamina E i C	RFT peroksyazotan (ONOOO^-) utleniony glutation hydroksylowane rodniki utlenione lipidy

Oksydatywna modyfikacja lipidów

• utlenieniu faktycznie ulega białko (np. APO-B100, APO-A1).

• Im większa zawartość apoB tym większe zagrożenie miażdżycą

Małe gęsto LDL (sdLDL)

1. Występuje w podwyższonym stężeniu u ludzi z hipertriglicerydemii (najczęściej związane z VLDL, nie zawsze towarzyszy temu podwyższenie apoB)

2. Łatwiej przenikają przez ścianę tętnicy

3. Większa podatność na oksydację

4. ox-LDL uszkadzają śródbłonek i nasilają procesy zapalne.

Oksydacyjna modyfikacja może zachodzić też na drodze enzymatycznej przy udziale mieloperoksydazy leukocytarnej (MPO), lipooksygenazy czy innych enzymów w ścianie naczynia. Taka hipoteza tłumaczy brak wpływu α-fakoferolu (wit E)

MPO-właściowości

syntezuje kwas podchlorowy (HOCl) z nadtlenku wodoru i Cl- podczas wybuchu tlenowego w neutrofilach. W reakcji cząsteczki hemu stanowią kofaktor.

Oksydacyjna modyfikacja LDL uważana jest za główny mechanizm rozwoju miażdżycy i jej konsekwencji.

Wolnorodnikowa reakcja łańcuchowa - wolne rodniki odbierają elektrony z lipidów w błonie komórkowej, dając uszkodzenie komórek. Najbardziej podatne są wielonienasycone kwasy tłuszczowe.

Największemu oddziaływaniu tej reakcji poddane są wielonienasycone KT gdyż ich cząsteczki zawierają wiele podwójnych wiązań między którymi znajduja się grupy metylenowe - CH2-. Grupy metylenowe zawierają bardzo aktywne hydrogeny. Przebieg 2 3 etapacg: inicjacia, propagacja i terminacja.

Etapy

Inicjacja - lipidy pod wpływem RFT tworzą RFT. Tworzy się rodnik KT

Propagacja -nie jest trwałą cząsteczką. RFT szybko reaguje z O_{2 i} tworzy rodnik peroksylowanych kwasów tłuszczowych (2) → reaguje z cząsteczkami kwasów nienasyconych dając peroksydowaną cząsteczkę lipidu. Dalej w ten sposób reagują kolejne cząsteczki lipidu

Terminacja - reakcja ustaje gdy dwie aktywne formy RFT tworzą związek, który nią nie jest. W takiej reakcji biorą udział antyoksydanty.

Związki reagujące z kwasem tiobarbiturowym (TBA)

• największa liczba metod do oceny peroksydacji lipidów opiera się na tej reakcji

• oznacza się malonylodialdehyd, który jest końcowym produktem peroksydacji lipidów

• metoda

• badaną próbkę ogrzewa się z TBA w środowisku kwaśnym, gdzie MDA tworzy addukty z TBA i powstaje produkt barwny. Masa powstałego produktu jest proporcjonalna do masy MDA, a tym samym do masy peroksydowanych lipidów

• oznacza się absorbancję przy 532nm lub fluorescencję 553nm

• można też oznaczać MDA z użyciem HPLC albo GC/MS

ox-LDL są pochłaniane przez makrofagi w środku naczyń.

HDL-C

• dobry cholesterol - antyoksydant

• LDL/HDL ≤ 3,5

Jest naturalnym inhibitorem oksydacji LDL.

Cechy

• wysoka zawartość litofilnych antyoksydantów (apoA, α-tokoferol)

• enzymów - paraoksonazy, peroksydazy glutationowej, acetylohydrolazy czynnika aktywacji płytek

Oksydowana forma HDL jest prozapalna.

Metody analityczne w terapii monitorowanej

Liberation

Absorption

Distribution

Metabolism

Excretion

Eliminacja = metabolizm + wydalanie

Liberation - uwalnianie - lek zmienia się w roztwór wodny

1. rozpad

2. rozpuszczenie

3. dyfuzja do miejsca wchłaniania

Absorption - substancja z miejsca wchłaniania do krążenia

Distribution - rozmieszczenie leku w ciele, wiązanie z białkami osocza

Metabolism - przemiany biochemiczne leku w żywym organizmie

Excretion - nerki, żółć, kał itp. itd.

Biologiczny okres półtrwania leku

Czas po którym stężenie leku we krwi zmaleje o połowę w wyniku eliminacji.

wolny metabolizm = skłonność do interakcji

Monitorowanie, aby stężenia mieściły się w zakresie terapeutycznym leku.

Kryteria wyboru leków do monitorowania

1. Niski współczynnik terapeutyczny

2. Niebezpieczne działanie toksyczne

3. Współzależność między stężeniem a działaniem

4. Zastosowanie w długotrwałej terapii

5. Zastosowanie w chorobach zagrażających życiu

6. Znaczne różnice osobnicze w zakresie ich farmakokinetyki

7. Farmakokinetyka nieliniowa

8. Duży współczynnik dystrybucji

Nie dotyczy

• leków przeciwcukrzycowych

• leków hipotensyjnych

• leków wpływających na układ krzepnięcia

Pobieranie próbki krwi - w czasie, gdy lek osiąga stężenia maksymalne i/lub minimalne.

Oznaczamy

• całkowite stężenie leku w surowicy, osoczu, moczu itp.

• stężenie leku niezwiązanego

• stężenie określonego metabolitu

6 metod oznaczania leków w TDM

• RIA

• ELISA

• EMIT

• FPIA

• MEIA

• HPLC

Preparaty litu

• po 48-72 h - pierwsze oznaczenie

• 2 razy w ciągu tygodnia

• co jeden tydzień przez 1 miesiąc

• co jeden miesiąc przez pół roku

• co 3 miesiące + kontrola kreatyniny.

Korzyści TDM

• zwiększenie skuteczności leku i bezpieczeństwa stosowania leku

• możliwość indywidualnego doboru dawki

• możliwość szybkiej interwencji lekarskiej w sytuacji zmieniającego się stanu klinicznego

• zmniejszenie częstości występowania i nasilenia objawów niepożądanych

• możliwość stosowania dużych dawek

• możliwość wykrycia zagrożenia objawami niepożądanymi przed ich klinicznym wystąpieniem

• możliwość sprawdzenia czy chory stosuje się do zaleceń lekarza

• skrócenie czasu leczenia

• obniżenie kosztów leczenia.

---