WIEDZA O ZWIERZĘTACH LABORATORYJNYCH.
ZWIERZĘTA LABORATORYJNE - ZWIERZĘTA OKREŚLONEGO GATUNKU, KTÓRE ZOSTAŁY WYHODOWANE W LICENCJONOWANYCH HODOWLACH SPECJALNIE DO CELÓW DOŚWIADCZALNYCH.
GATUNKI ZWIERZĄT UZNANE ZA DOŚWIADCZALNE WYMIENIONE W KONWENCJI EUROPEJSKIEJ :
MYSZ, SZCZUR, ŚWINKA MORSKA, CHOMIK, KRÓLIK, PIES, KOT, PRZEPIÓRKA JAPOŃSKA / inne gat. gryzoni, ssaki „wyższe” (małpy)/
Konwencja Europejska
Zwierzęta muszą być „nabyte bezpośrednio lub [...] pochodzić z zarejestrowanych ośrodków hodowlanych”
(art. 21, ust. 1)
Konwencja zabrania używania do doświadczeń bezpańskich zwierząt udomowionych
(art. 21, ust. 3)
Statystyczne dane wykorzystania zwierząt muszą być publicznie dostępne
(art. 27, ust. 1)
Rozwój ustawodawstwa o ochronie zwierząt
1924 r. Anglia - pierwsza ustawa zawierająca zasady ochrony zwierząt w związku eksperymentowaniem na nich
Polska 22.III.1928 r. - rozporządzenie Prezydenta Rzeczpospolitej o ochronie zwierząt, działające na mocy ustawy, uzupełnione w 1959 r. rozporządzeniem Ministra Szkolnictwa Wyższego /w całości poświęcone zagadnieniom dokonywania doświadczeń na zwierzętach/
Stany Zjednoczone - problemy doświadczeń na zwierzętach laboratoryjnych unormowane od 1978 r. przez Food and Drug Administration jako postanowienia dobrej praktyki laboratoryjnej (good laboratory practice - GLP) dotyczące badań nieklinicznych. Przepisy stosowane w ramach Europejskiego Programu Badań Biomedycznych.
Organizacje Międzynarodowe
Międzynarodowy Komitet do Spraw Zwierząt Laboratoryjnych ICLA 1956 r.
normy prawne eksperymentowania na zwierzętach
warunki utrzymania i hodowli zwierząt laboratoryjnych
sposób przeprowadzania doświadczeń
Międzynarodowa Rada do Spraw Wiedzy o Zwierzętach Laboratoryjnych - ICLAS 1979 r.
Europejska Konwencja w sprawie ochrony zwierząt kręgowych, wykorzystywanych dla celów doświadczalnych i innych celów naukowych
1986 r. Strasburg (11 państw założycieli Rady Europy)
USTAWA O OCHRONIE ZWIERZĄT z dnia 21 sierpnia 1997 r.
Przepisy ogólne
Art. 1.1.
Zwierzę, jako istota żyjąca, zdolna do odczuwania cierpienia, nie jest rzeczą.
Człowiek jest mu winien poszanowanie, ochronę i opiekę.
Dziedziny, w których dopuszczalne jest wykorzystywanie żywych zwierząt:
Konwencja Europejska (art. 2)
zapobieganie chorobom i utracie zdrowia ludzi i zwierząt
edukacja chirurgiczna (kształcenie i szkolenie)
fizjologiczne badania podstawowe
ochrona środowiska
badania naukowe
medycyna sądowa (dochodzenia sądowe)
Metody alternatywne
Badania epidemiologiczne
Badania in vitro
EUTANAZJA ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH
EUTANAZJA - łagodna śmierć; akt humanitarnego uśmiercenia przy ograniczeniu do minimum bólu, strachu i dyskomfortu.
W laboratoriach i ośrodkach hodowlanych zwierzęta uśmierca się z różnych powodów:
na końcu doświadczenia lub gdy mogą wystąpić utrwalone niepożądane skutki
by uzyskać krew lub inne tkanki w celach badawczych
kiedy ból, dyskomfort i cierpienie zbliżają się do niedopuszczalnego poziomu
gdy zagrożone jest zdrowie lub dobrostan zwierząt
kiedy nie są one dłużej zdolne do rozmnażania
gdy dana grupa zwierząt nie posiada wymaganych cech, np. odpowiedniej płci
PODSTAWOWE KRYTERIA WYBORU METOD EUTANAZJI
I ZACHOWANIA DOBROSTANU ZWIERZĄT:
należy stosować taką metodę, która pozwala na zminimalizowanie bólu
błyskawiczne osiągnięcie nieprzytomności i śmierci
ograniczenie do minimum braku swobody i zdenerwowania zwierzęcia
wybrana metoda powinna być odpowiednia do wieku, gatunku i stanu zdrowia zwierzęcia
ograniczać do minimum niepokój i fizjologiczny stres
wybrana metoda powinna być skuteczna, powtarzalna, nieodwracalna, łatwa w wykonaniu (w niewielkich dawkach, jeśli to możliwe)
bezpieczna dla osób wykonujących zabieg oraz akceptowana z estetycznego punktu widzenia
CHARAKTERYSTYKA METOD EUTANAZJI
Szybkość
Skuteczność
Łatwość wykonania
Bezpieczeństwo personelu
Ocena estetyczna
++ do przyjęcia
+ do przyjęcia przez większość osób
- nie do przyjęcia przez wiele osób
Ocena ogólna : 1 - 5 , przy czym 5 wysoce zalecana
ROZPOZNANIE I POTWIERDZENIE ŚMIERCI
zatrzymanie akcji serca i oddychania
brak odruchów
oraz u małych zwierząt laboratoryjnych, obniżenie temperatury ciała poniżej 250C
PODSTAWOWE MECHANIZMY WYWOŁANIA ŚMIERCI
BEZPOŚREDNIE LUB POŚREDNIE NIEDOTLENIENIE
BEZPOŚREDNIA BLOKADA FUNKCJI OŚRODKÓW NERWOWYCH ODPOWIEDZIALNYCH ZA CZYNNOŚCI ŻYCIOWE
FIZYCZNE ZATRZYMANIE AKTYWNOŚCI MÓZGU ORAZ ZNISZCZENIE OŚRODKÓW NERWOWYCH KONTROLUJĄCYCH CZYNNOŚCI ŻYCIOWE
(Andrews i wsp. 1993, Lumb i Jones 1984)
PRZYTOMNOŚĆ
stan świadomości zwierzęcia, w którym może ono odbierać bodźce ze środowiska zewnętrznego i odpowiadać na nie normalnym zachowaniem, typowym dla przytomnego osobnika
BRAK PRZYTOMNOŚCI
stwierdzenie braku wrażliwości na bodźce zewnętrzne, tak jak obserwuje się to w przypadku śpiączki lub podczas znieczulenia ogólnego.
Brak wrażliwości - to zarówno brak reakcji fizycznej na stosowane bodźce, jak i brak reakcji ze strony ośrodkowego układu nerwowego.
BÓL
„negatywne odczucie, które wyzwala obronne reakcje ruchowe, prowadzi do wyuczonego unikania i może modyfikować gatunkowo swoiste sposoby zachowania, włącznie z zachowaniem socjalnym” (Zimmermann 1986)
Ból dotyczy przytomnej reakcji na bodziec, a nie odruchowej reakcji nieprzytomnego organizmu.
Oznaki bólu i stresu.
Zależnie od gatunku są to następujące objawy:
wydawanie odgłosów charakterystycznych dla stanu niepokoju (nie zawsze w zakresie dźwięków odbieranych przez człowieka),
walczenie,
próby ucieczki,
obronna lub ukierunkowana agresja,
zastygnięcie w bezruchu,
dyszenie,
ślinotok,
oddawanie moczu, kału lub opróżnianie torebek odbytniczych,
rozszerzenie źrenic,
częstoskurcz serca,
pocenie się,
odruchowe skurcze mięśni szkieletowych powodujące dreszcze lub inne reakcje spazmatyczne.
MAKROKLIMAT I MIKROKLIMAT
PORY ROKU
TEMPERATURA
gatunkowa strefa obojętności cieplnej tzn. zakres temperatury, w którym wytwarzanie i oddawanie ciepła jest optymalne /gryzonie labor. 20 - 22oC (+ 2oC)/
zależność między temperaturą otoczenia a:
toksycznością preparatów
czasem trwania reakcji zwierząt
efektem działania preparatów
OŚWIETLENIE
Regulacja doby świetlnej w stały, zwykle 12-godzinny rytm dzienno-nocny
WILGOTNOŚĆ
Optymalna wilgotność pomieszczeń - ok. 55% wilgotności względnej (+5%)
CIŚNIENIE
SKŁAD POWIETRZA
ZAPACH
DŹWIĘKI
ZASADY ŻYWIENIA
PODSTAWOWE ELEMENTY PRAWIDŁOWEGO ŻYWIENIA
Człowiek i większość zwierząt: skład pokarmu, jakość, urozmaicenie.
Zwierzęta laboratoryjne: skład pokarmu, jakość, standaryzacja.
Standaryzacja diety - maksymalne ujednolicenie składników diet stosowanych w żywieniu zwierząt laboratoryjnych.
W skład diet mogą wchodzić tylko surowce paszowe, których skład podlega najmniejszym sezonowym wahaniom i mogą być stosowane niezależnie od pory roku i szerokości geograficznej, możliwie we wszystkich hodowlach, laboratoriach i ośrodkach badawczych na świecie.
Brak urozmaicenia wyrównany przez wysoką wartość pokarmową standaryzowanych diet.
Diety dla zwierząt laboratoryjnych:
DIETA STANDARDOWA (standard diet) - z naturalnych surowców paszowych
DIETA „CZYSTA” (purifed diet) - półsyntetyczna z surowców oczyszczonych jak np. kazeina, sacharoza celuloza, gluten pszenny itp.
DIETA CHEMICZNIE ZDEFINIOWANA (defined diet) - z chemicznie czystych ściśle zdefiniowanych składników np. aminokwasy, kwasy tłuszczowe itp.
(Klasyfikacja wg FDA (Food and Drug Administration) - „zasady dobrej praktyki laboratoryjnej” - GLP)
WYMAGANIA POKARMOWE
Wszystkożerne - myszy, szczury, chomiki
Roślinożerne - świnki morskie, króliki
Mięsożerne - koty, psy
ZAPOTRZEBOWANIE POKARMOWE
BYTOWE - zwierzęta po zakończonym okresie wzrostu i rozwoju, nie użyte do rozpłodu
HODOWLANE - zwierzęta młode, w okresie wzrostu; samice w okresie ciąży i laktacji; samce użyte do krycia
WODA
Przeciętne zużycie wody przez zwierzęta różnych gatunków (wg Kohler et al. 1978)
GATUNEK |
ZUŻYCIE WODY w ml / szt. / dzień w okresie |
|
|
wzrostu |
dojrzałości |
Myszy Szczury Chomiki Świnki morskie Króliki Psy Koty |
3,0 - 10,0 5,0 - 80,0 8,0 - 10,0 100,0 - 250,0 100,0 - 400,0 ok. 30,0 / kg ciężaru ciała 200,0 - 300,0 |
ok. 7,0 ok. 30,0 ok. 10,0 ok. 250,0 300,0 - 400,0 ok. 30,0 / kg ciężaru ciała ok. 300,0 |
PRZYGOTOWANIE ZWIERZĄT DO DOŚWIADCZEŃ
TRANSPORT
ADAPTACJA
DOBÓR ZWIERZĄT DO GRUP DOŚWIADCZALNYCH
zminimalizowana zmienność między grupami
zmienność w każdej grupie odpowiada zmienności w obrębie danej populacji (stada lub szczepu)
METODA TWORZENIA GRUP DOŚWIADCZALNYCH
PRZYPADKOWA
LOSOWA np. przy użyciu tabel liczb losowych - biometria
SELEKCYJNA - metoda doboru „genetycznie zbalansowanych osobników”
WYTYCZNE OECD DO BADAŃ SUBSTANCJI CHEMICZNYCH
TOKSYCZNOŚĆ OSTRA
TOKSYCZNOŚĆ KRÓTKOTERMINOWA PRZY POWTARZALNYM DAWKOWANIU I PODPRZEWLEKŁA
DZIAŁANIE MIEJSCOWE NA SKÓRĘ I OKO
UCZULENIE ALERGICZNE
TOKSYCZNOŚĆ ROZRODU
ROZRÓD, PŁODNOŚĆ, TERATOGENNOŚĆ
RAKOTWÓRCZOŚĆ
TOKSYCZNOŚĆ PRZEWLEKŁA
ŁĄCZNA TOKSYCZNOŚĆ PRZEWLEKŁA / RAKOTWÓRCZOŚĆ
TOKSYKOKINETYKA I METABOLIZM
WARUNKI BADAŃ TOKSYCZNOŚCI
WYBÓR ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH
OPIEKA NAD ZWIERZĘTAMI
LICZBA I WIELKOŚĆ GRUP
CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA WYNIK DOŚWIADCZENIA
CZYNNIKI ŚRODOWISKOWE
↓
GENOTYP
↓
FENOTYP
↓
PRZYGOTOWANIE → DRAMATYP ← METODYKA
DO DOŚWIADCZEŃ DOŚWIADCZEŃ
↓
WYNIKI DOŚWIADCZENIA
Standaryzacja czynników środowiskowych dotyczy :
metod i warunków hodowli zwierząt doświadczalnych;
okresu przygotowawczego do eksperymentu;
metod i technik eksperymentalnych.
Zwierzęta o ujednoliconym dramatypie (defined laboratory animals)
zwierzęta o ustalonej charakterystyce hodowane pod stałą kontrolą genetyczną i zdrowotną, w ściśle określonych warunkach środowiskowych.
Przy określaniu stopnia inwazyjności należy uwzględnić
Gatunek zwierzęcia ( poziom organizacji kognitywnej i emocjonalnej) - różna tolerancja tych samych procedur przez różne gatunki
Zastosowanie humanitarnego zakończenia (humane endpoints)
Możliwość kompensacji cierpień w przypadku inwazyjnych doświadczeń, po których zwierzęta mają pozostać przy życiu
SKALA INWAZYJNOŚCI BADAŃ NA ŻYWYCH KRĘGOWCACH
STOPIEŃ 1 - Procedury nieinwazyjne
STOPIEŃ 2 - Procedury powodujące lekki chwilowy ból, stres lub długotrwały lekki dyskomfort
STOPIEŃ 3 - Procedury powodujące umiarkowany ból/stres
STOPIEŃ 4 - Procedury powodujące silny ból/stres i zwykle nieodwracalne uszkodzenie ciała i funkcji psychicznych
STOPIEŃ X - Niedopuszczalne procedury powodujące skrajne cierpienia
HODOWLA ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH
HODOWLA ZWIERZĄT polega na dwóch podstawowych działaniach: selekcji i doborze osobników do kojarzeń.
Genetycznym efektem są zmiany w częstości występowania określonych genów i genotypów w populacji, w wyniku czego powstają nowe szczepy, rasy, stada i mieszańce.
POKREWIEŃSTWO - prawdopodobieństwo posiadania takiego samego genotypu przez osobniki mające wspólnych przodków.
WSOBNOŚĆ - współczynnik wsobności (inbredu) - prawdopodobieństwo homozygotyczności potomka wynikające z faktu pokrewieństwa rodziców.
SZCZEP WSOBNY (inbred) - grupa zwierząt reprezentujących jeden gatunek, charakteryzujących się jednorodnością genotypową i homozygotycznością.
„Szczep może być uważany za wsobny (inbred), jeśli był hodowany systemem kojarzenia brata z siostrą przez 20 następujących po sobie pokoleń (F 20). Szczep tworzy linię złożoną z pojedynczych rodzicielskich par hodowlanych, obejmującą przynajmniej 20 kolejnych pokoleń.
Kojarzenia rodzic x potomek mogą zastąpić kojarzenia brat x siostra pod warunkiem, że będzie do nich użyty młodszy z dwojga rodziców.”
wg Committee on Standarized Genetic Nomenclature For Mice z 1994 r.
STADO NIEKREWNIACZE (outbred) - populacje złożone z osobników o różnych genotypach;
stado każdego gatunku ssaków laboratoryjnych hodowane co najmniej przez 4 pokolenia w zamkniętej populacji z maksymalnym unikaniem kojarzeń krewniaczych.
Rejestracja i symbol*) możliwe tylko wtedy, kiedy system kojarzeń gwarantuje utrzymanie zmienności biologicznej stada przez szereg lat na takim samym poziomie.
Za stado uważać można:
uprzednio wsobny szczep po 4 pokoleniach hodowli systemem kojarzeń z unikaniem pokrewieństwa
mieszańce F1 dwóch różnych szczepów wsobnych
„syntetyczne”, heterozygotyczne populacje pochodzące z mieszańców F1 , względnie segregujące mieszańce F2 , pod warunkiem, że będą stale odtwarzane z wyjściowych szczepów wsobnych.
Niedopuszczalne jest prowadzenie jakiejkolwiek kierunkowej selekcji.
POPULACJE MOZAIKOWE - złożone z osobników pochodzących zarówno ze wsobnych szczepów, jak i ich mieszańców F1 w określonej proporcji.
Inne modele genetyczne
koizogeniczne - linie szczepów wsobnych różniące się jednym zmutowanym genem
kongeniczne - różnią się krótkim odcinkiem jednego chromosomu
konsomiczne - przeniesienie całego chromosomu (X lub Y) na tło genetyczne innego szczepu wsobnego
konplastyczne - powtarzane krzyżowanie wsteczne w celu wprowadzenia genomu jądrowego pochodzącego z jednego szczepu wsobnego na tło cytoplazmatyczne innego szczepu
transgeniczne
ZASADY OZNACZANIA STANU ZDROWOTNEGO ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH
Zwierzęta laboratoryjne, u których występują łatwo wykrywalne objawy chorobowe oraz bezobjawowi nosiciele zakażeń patogennych nie nadają się do doświadczeń, szczególnie doświadczeń biomedycznych.
Kategoryzacja zwierząt laboratoryjnych opracowana przy udziale organizacji międzynarodowych:
WHO - World Health Organization, FAO - Food and Agriculture Organization, ILAR - Institute for Laboratory Animal Resources, ICLAS - International Council for Laboratory Animal Science.
STATUS HIGIENICZNY ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH
Zwierzęta:
GNOTOBIOTYCZNE
GF (germ free) - wolne od wszystkich wykrywalnych mikroorganizmów i pasożytów
MONO-, DI-, POLIBIONTY - zwierzęta GF celowo zasiedlone jednym, dwoma lub wieloma określonymi rodzajami mikroorganizmów
AGNOTOBIOTYCZNE
zwierzęta SPF (Specified Pathogen Free)
zwierzęta konwencjonalne
CV I - kontrolowane, utrzymywane w warunkach częściowej izolacji (semi barrier condition)
CV - hodowla otwarta
PROGRAM KONTROLI ZDROWIA ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH
UWZGLĘDNIANE CZYNNIKI
Kategoria zdrowotna i warunki hodowli zwierząt
Rodzaj doświadczeń, do których będą służyły zwierzęta
Stopień zagrożenia przeniesienia infekcji z innych populacji gryzoni
Przewidywana rola danych patogenów w określonym doświadczeniu
Względy ekonomiczne
Zaplecze techniczne - możliwość zastosowania określonych technik diagnostycznych
MONITOROWANIE ZDROWIA ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH
KONTROLA WIRUSOLOGICZNA - metody serologiczne - test ELISA, test immunofluorescencji (IFA), test zahamowania hemaglutynacji (HI), metody biochemiczne i molekularne
KONTROLA BAKTERIOLOGICZNA - posiewy z wybranych narządów, badania histopatologiczne
KONTROLA PARAZYTOLOGICZNA - metody mikroskopowe, test ELISA i PCR
KONTROLA MYKOLOGICZNA
BADANIA ANATOMOPATOLOGICZNE
KONTROLA GENETYCZNA ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH
MONITOROWANIE GENETYCZNE NA PODSTAWIE MARKERÓW CECH JAKOŚCIOWYCH
MARKERY IMMUNOLOGICZNE - najczęściej stosowane są antygeny zgodności tkankowej, kodowane przez geny głównego kompleksu zgodności tkankowej MHC oraz antygeny zróżnicowania limfocytów
MARKERY BIOCHEMICZNE - izoenzymy i białka nieenzymatyczne kodowane przez polimorficzne, strukturalne geny
MARKERY CYTOGENETYCZNE
MARKERY MORFOLOGICZNE - geny umaszczenia
MARKERY MIKROSATELITARNE w kontroli genetycznej zwierząt szczepowych
MONITOROWANIE GENETYCZNE NA PODSTAWIE ANALIZY CECH ILOŚCIOWYCH - WSKAŹNIKI MORFOMETRYCZNE I REPRODUKCYJNE
→ dane do określenia wskaźników reprodukcyjnych
czas od skojarzenia do wydania pierwszego miotu
odstępy czasowe między kolejnymi miotami
liczba urodzonych młodych
liczba odchowanych młodych
→ wskaźniki osteomertryczne
pomiary żuchwy, czaszki, kości udowej.