Struktura i funkcja lipidów – Ćwiczenia

Lipidy to wyjątkowo różnorodna grupa związków organicznych trudna do jednolitego zdefiniowania pod względem chemicznym. Są to związki powszechnie występujące w organizmach żywych, nierozpuszczalne lub bardzo słabo rozpuszczalne w wodzie, a dobrze rozpuszczające się w rozpuszczalnikach organicznych.

Zasadniczo lipidy pełnią funkcję jako:

Materiał zapasowy – utlenienie 1 grama lipidu dostarcza organizmowi 9 kilokalorii, czyli około 37kJ energii, podczas gdy utlenienie innego materiału zapasowego organizmu, a mianowicie glikogenu to tylko 4 kcal. Glikogen występuje w organizmie w postaci silnie uwodnionej, w rzeczywistości więc 1 gram lipidu dostarcza organizmowi nieomal 7x więcej energii niż 1 gram glikogenu. Tłuszcz jest deponowany w cytoplazmie komórek tłuszczowych we wszystkich tkankach, jest więc rozproszony, w przeciwieństwie do glikogenu, który jest magazynowany w wątrobie.

Składnik błon biologicznych – w ich budowie uczestniczą przede wszystkim fosfolipidy, glikolipidy i cholesterol.

Substancje o aktywności biologicznej – hormony kory nadnerczy (kortyzol, aldosteron), hormony płciowe (testosteron, estradiol), witaminy (A, D, E, K), prostaglandyny.

Materiał ochronny – na zewnętrznych powierzchniach roślin i zwierząt, składniki ochronne ścian komórkowych wielu bakterii i komórek roślinnych.

Spośród wszystkich klas lipidów najbardziej rozpowszechnione są triacyloglicerole (tłuszcze proste, tłuszcze właściwe, tłuszcze obojętne, acyloglicerydy).
Triacyloglicerole (zwane też trójglicerydami) są estrami alkoholu glicerolu i kwasów tłuszczowych o przykładowym wzorze:

Spośród kwasów tłuszczowych, jako składnik triacylogliceroli najczęściej występują kwasy tłuszczowe z szesnasto- i osiemnasto węglowym łańcuchem.

Symbol	Nazwa zwyczajowa	Nazwa systematyczna	Wzór
18:0	stearynowy	oktadekanowy	CH3(CH2)16COOH
18:1	oleinowy	9-oktadekenowy	CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
18:2	linolowy	9,12-oktadekadienowy	CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6COOH
18:3	-linolenowy	9,12,15-oktadekatrienowy	CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6COOH
18:3	-linolenowy	6,9,12-oktadekatrienowy	CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3(CH2)3COOH

Biorąc pod uwagę liczbę atomów węgla w cząsteczce kwasu tłuszczowego, liczbę i położenie wiązań podwójnych, łańcuch prosty lub rozgałęziony, obecność innych podstawników (grupy hydroksylowe, ketonowe, epoksydowe) oraz różne kombinacje tych cech łatwo zauważyć, że ilość możliwych rodzajów kwasów tłuszczowych jest olbrzymia.
Kwasy tłuszczowe pochodzenia naturalnego mają z reguły parzystą liczbę atomów węgla. W organizmach żywych kwasy tłuszczowe nie występują w stanie wolnym.

UWAGA! W kwasach tłuszczowych atomy węgla numerujemy od strony grupy karboksylowej. Tak więc zapis „kwas 6, 9, 12 oktadekatrienowy wskazuje, że położenie podwójnego wiązania znajduje się pomiędzy 6 i 7, 9 i 10 oraz 12 i 13 atomem węgla licząc pierwszy węgiel grupy karboksylowej.

Kwasy tłuszczowe nasycone w temperaturze pokojowej są ciałami stałymi, a kwasy nienasycone w tych warunkach są w stanie płynnym. Cecha ta jest przenoszona na triacyloglicerole. Tak więc tłuszcze roślinne (oleje) są z reguły płynne, gdyż w składzie ich triacylogliceroli większy jest procentowy udział jedno- i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, niż w tłuszczach zwierzęcych. Zarówno w materiałach roślinnych jak i zwierzęcych przynajmniej jeden z kwasów tłuszczowych triacyloglicerolu jest prawie zawsze nienasycony. Triacyloglicerol, w którego składzie wszystkie kwasy tłuszczowe są nasycone np. tristearoiloglicerol nie jest w temperaturze pokojowej ciałem mazistym tak jak tłuszcze zwierzęce, ale ciałem stałym w dotyku przypominającym talk lub wysuszone mydło.

Budowa głównych glicerofosfolipidów; R – reszta kwasu tłuszczowego

Charakterystyka niektórych olejów roślinnych.

Olej rzepakowy – wysoka zawartość kwasu erukowego – szkodliwy w żywieniu – przyczyna uszkodzenia mięśnia sercowego.

Olej lniany – wysoka zawartość kwasu linolenowego – cenny w żywieniu, bardzo szybko podlega procesom degradacji. Należy do olejów schnących – wysycha przy udziale tlenu, tworząc na powierzchni twardą i odporną na wpływy atmosferyczne błonę – dzięki temu wykorzystywany do produkcji farb olejnych i preparatów zabezpieczających drewno przed gniciem.

Olej z nasion wiesiołka lub ogórecznika lekarskiego – zawiera ok. 10% kwasu gamma linolenowego (GLA). Niezbędny dla syntezy jednej z serii prostaglandyn. Znalazł zastosowanie jako lek wspomagający w przypadku egzemy atopowej, syndromie przedmenstruacyjnym, syndromie suchości oczu i śluzówek, artretyzmie, dla zmniejszenia poziomu cholesterolu we krwi i przy schorzeniach skóry.

Ekstrakcja lipidów:

Dla rozpuszczalności tłuszczu w rozpuszczalniku organicznym zasadnicze znaczenie ma stopień polarności lipidu.
Generalnie lipidy apolarne (karotenoidy, estry steroli, sterole, woski, triacyloglicerole) lepiej rozpuszczają się w rozpuszczalnikach o małej polarności (chloroform, heksan, benzen), a lipidy bardziej polarne (kwasy tłuszczowe, lipidy fenolowe) w acetonie, eterze etylowym, octanie etylu, alkoholu propylowym, acetonitrylu.
Związki zawierające silnie polarną grupę i długie hydrofobowe łańcuchy np. fosfolipidy źle się rozpuszczają się w pojedynczych rozpuszczalnikach:
- niepolarnych ze względu na silnie polarną grupę np. fosforanową
- polarnych, ze względu na długie hydrofobowe łańcuchy boczne np. kwasów tłuszczowych.
Tego typu związki najlepiej rozpuszczają się w mieszaninach rozpuszczalników polarnych z niepolarnymi, np. heksanu z alkoholem propylowym lub chloroformu z metanolem.

Ekstrakcja lipidów z materiałów suchych – takich jak nasiona roślin, nastręcza mniej kłopotów i wymaga mniejszej objętości rozpuszczalników niż ekstrakcja z materiałów zawierających wodę, np. części zielone roślin, tkanki i narządy zwierzęce. Ekstrakcję tę można prowadzić pojedynczym rozpuszczalnikiem, co umożliwia pewną jej wybiórczość w stosunku do niektórych klas lipidów.

Ekstrakcja z materiałów zawierających wodę – rozpuszczalnikami mieszającymi się z wodą (metanol, alkohol etylowy, aceton) ma sens tylko wówczas jeśli użyjemy dużego nadmiaru rozpuszczalnika w stosunku do objętości próby, a to dlatego, że nawet niewielki procent wody drastycznie zmniejsza rozpuszczalność lipidów. W tym wypadku ekstrakcję najlepiej prowadzić układem
heksan : izopropanol. Obecność wody w próbie, sprawia, że mieszanina ta rozwarstwia się tworząc po ekstrakcji dwie fazy: metanolowo-wodną i chloroformowo-metanolową (lub izopropanol : woda : heksan : propanol). Po ekstrakcji tymi mieszaninami często tworzy się emulsja, aby przyspieszyć utworzenie się dwóch faz, ekstrakt należy odwirować.
Zaletą stosowania tego rodzaju mieszanin do ekstrakcji, jest to, że do fazy zawierającej wodę przechodzi cały szereg związków, które nie są lipidami, a rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych. Uzyskany ekstrakt można powtórnie wytrząsać z wodą usuwając z niego zanieczyszczenia.
Mieszaniny typu: polarny rozpuszczalnik z niepolarnym rozpuszczalnikiem charakteryzują się tym, że dobrze rozpuszczają wiele lipidów i w tym sensie ekstrakcja jest najpełniejsza. Można nimi ekstrahować także materiały suche. Jeśli to konieczne, dla lepszego oczyszczenia uzyskanego ekstraktu można dodać do niego wodę. Z reguły stosuje się mieszaniny o proporcjach polarnego rozpuszczalnika do niepolarnego jak 1:1, 1:2, 2:1.

Ekstrakcja surowych lipidów z jaja
Do żółtka dodajemy 4ml metanolu, mieszamy, dodajemy 8ml chloroformu i wytrząsamy przez 15 min. na wytrząsarce, sączymy przez bibułę/sączek.

Skład procentowy lipidów z żółtka jaja kurzego:
Trójglicerydy – 65%
Fosfolipidy – 30% [lecytyny 80%, kefaliny 17%, sfingomieliny 3%]
Cholesterol – 4%
Barwniki i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach – 1%

Ekstrakcja lipidów z liści rzodkiewki.
WSZYSTKO DODAWALIŚMY NA ĆWICZENIACH 5-KROTNIE MNIEJ!
- 5g podsuszonych, poszatkowanych liści rzodkiewki umieścić w rozdzielaczu, dodać 50ml metanolu i
wytrząsać kilka minut.
- Dodać 40ml chloroformu i wymieszać przez obracanie.
- Dodać 20ml metanolu i mieszać przez chwilę.
- Do całości dodać ok. 50ml 0,8% NaCl i delikatnie wymieszać, następnie pozostawić do rozdzielenia
faz [Tego chyba nie dodawaliśmy z tego co pamiętam?]
- Zebrać fazę dolną do kolby.
- Do fazy górnej dodać 40ml chloroformu i mieszać całość przez kilka minut, pozostawić do
rozdzielenia faz.
- Zebrać fazę dolną i połączyć z zebraną poprzednio.
- Zagęścić otrzymany ekstrakt poprzez częściowe odparowanie rozpuszczalników.
- W komorach chromatograficznych umieścić układy rozwijające A oraz B.
- Przykryć komory płytką szklaną i pozostawić na 30min. Przygotować płytkę do chromatografii – linia
startu 1cm od brzegu.
- Badane próby nanieść kapilarką na linie startową.
- Plamki wysuszyć.
- Włożyć płytkę do komory i rozwijać.
- Wyjąć, gdy front rozpuszczalnika dojdzie do 1-15,cm od górnej krawędzi i suszyć pod dygestorium.
- Wywołać chromatograf – pojemnik z jodem.

Do rozwijania chromatografów stosować dwa układy rozwijające:
A – chloroform : metanol : kwas octowy : woda – 60:50:1:4 – układ rozwijający fosfolipidy
B – chloroform : aceton : metanol : kwas octowy : woda – 50:20:10:10:5 – układ rozwijający fosfo- i glikolipidy roślinne.

Glikolipidy w rzodkiewce: diazylogalaktozyloglicerol [1], diacylogalaktobiazyloglicerol [2], diacylosulfochinowozyloglicerol [3].

Chromatografia cienkowarstwowa TLC
Przeprowadzana na płytkach aluminiowych, plastikowych lub szklanych powleczonych cienką warstwą nośnika (poliamid, SiO2, Al2O3, celuloza). Nośniki są tak przygotowane, by miały jak największą powierzchnię sorpcyjną . „Żel krzemionkowy 60” oznacza, że przeciętna średnica kanalika wynosi 6nm.

Podłoże powinno być dopasowane do techniki wybarwiania związków (czyli, danie plastiku jak się później będzie podgrzewać to bardzo głupi pomysł, tak samo jak połączenie aluminium i kwas)
TLC to najczęściej chromatografia ciecz-ciało stałe. Rozdział następuje pomiędzy ciekła fazą ruchomą(układem rozwijającym), a fazą stacjonarną, na której absorbują cząsteczki rozdzielanych związków. Cząsteczki rozpuszczalnika będą konkurowały z cząsteczkami rozdzielanej subst. o miejsce na powierzchni adsorbenta, w wyniku czego ustali się równowaga:

adsorbent związki rozdzielane

↖ Rozpuszczalnik ↗

Szybkość ustalenie się tej równowagi w odniesieniu do całej powierzchni ziarna adsorbenta zależy od jego wielkości , a więc czasu jaki jest potrzebny, by dany zw. wdyfundował i wydyfundował z systemu kanalików. Im mniejsze ziarna nośnika tym krótszy jest ten czas i lepszy rozdział.
SiO2 i Al2O3 są adsorbentami polarnymi – czyli im bardziej polarny związek, bym bardziej będzie do nich adsorbował. Duże powinowactwo do tych żeli będą wykazywały również zw. posiadające grupy zdolne do tworzenia wiązań wodorowych.
W przypadku zw. aromatycznych i tych o dużej M, mechanizm polega na oddziaływaniu indukowanych dipoli z powierzchnią fazy stacjonarnej.

Przykładzik- TLC fosfolipidów(w cholerę polarne) i estru cholesterolu (mniej polarny) w dwóch rozpuszczalnikach – chloroformie(niepolarny) i izpopropanolu(polarny).
Gdy zastosujemy chloroform, to fosfolipidy nie będą przenoszone w cale, a estry będą wędrowały wraz z rozpuszczalnikiem , bo mają jeszcze mniejsze powinowactwo do fazy stacjonarnej niż fosfolipidy.

Gdy zastosujemy izopropanol, to zauważymy, że obydwa związki są przenoszone. Estry będą wędrowały z czołem rozpuszczalnika, a fosfolipidy ze wzgl. na silniejsza polarność zdecydowanie wolniej.
Pod wzgl. powinowactwa do powierzchni adsorbenta grupy funkcyjne można uszeregować w następujący sposób:

-CH=CH< OCH3 <-COOR <-C=O <-CHO <-SH <-NH2 <-OH <-COOH

Na tym etapie nauki pozdrawiam Cię serdecznie w ten majowy dzień i życzę owocnej nauki przez kolejne 20 minut. Przed Tobą już tylko 3 strony. Więc walcz i nie poddawaj się. To nie jest dużo.

Detekcja lipidów w chromatografach po TLC (nieswoista, czyli wybarwia wszystko):
Suche płytki spryskujemy jednym z r-rów:
-stężonego kwasu siarkowego VI (następuje zwęglenie wszystkich lipidów-widzimy ciemne paski)
-55% r-r kwasu siarkowego VI z K2CrO3
-20% wodny r-r NH4SO4- pod wpływem temp. Następuje piroliza, czyli rozpad na NH3 i H2SO4
Następnie spryskane płytki umieścić na kilkanaście min w temp. Ok. 180stopnii
Metoda alternatywna: wywołanie w oparach jodu- brązowe plamy na żółtawym tle po kilku kilkunastu minutach.

ZE SKRYPCIOCHU – Metody wywoływania chromatogramu.

Jedną z najbardziej uniwersalnych metod wywoływania chromatogramu jest spryskiwanie płytki stężonym kwasem siarkowym VI lub kwasem siarkowym VI z di chromianem potasu i ogrzewanie w temperaturze 180-220 stopni. W tych warunkach następuje zwęglenie związków organicznych (czarne plamy na białym tle) – czyli to pierwsze powyżej.

Inną uniwersalną metodą jest wywoływanie parami jodu (do komory, na dnie której znajduje się kilka kryształów jodu, wkładamy suchy chromatograf i przykrywamy komorę). Jod adsorbuje się na całej powierzchni płytki, ale znacznie szybciej na związkach organicznych, w efekcie po kilkunastu minutach na żółtym tle pojawiają się brązowe plamy rozdzielanych związków. – czyli tu ta alternatywna. Wadą tej metody jest niska czułość. Taką płytkę można powtórnie wywołać w inny sposób.

Wywoływanie lipidów kwasem fosforomolibdenowym (5-10% etanolowy roztwór kwasu fosfomolibdenowego – spryskać płytkę i ogrzewać w 105-129 stopniach przez 5-20min). Plamy rozdzielanych związków mają ciemnoniebieski lub szary kolor na żółtym tle. NASYCONE KWASY TŁUSZCZOWE NIE WYBARWIAJĄ SIĘ W TEJ METODZIE.

Detekcja grup aminowych:
Ninhydryna będzie reagowała z wolnymi grupami aminowymi aminolipidów i niektórych fosfolipidów, tworząc różowo-purpurowy kompleks. (U nas była to fosfoatydyloseryna i fosfoatydylocośtam… tego ostatniego nie zdążyłam zapisać)

Spryskujemy r-rem ninhydryny i po 1-2min. powinny się pojawić plamy. (uwaga, żeby nie przegrzać, bo po jakimś czasie SiO2 też się wybarwi!).

Detekcja grup cholinowych:
Spryskujemy odczynnikiem Dragendorffa z wodnym r-rem jodku potasu. Lipidy zawierające cholinę wybarwią się na pomarańczowo. (u nas: fosfoatydylocholina i sfingomielina)

Detekcja sterydów i ich estrów:
Steroidy (sterydy) − organiczne związki chemiczne, lipidy, których wspólną cechą jest występowanie w ich cząsteczkach szkieletu węglowego w formie czterech sprzężonych pierścieni, czyli steranu (cyklopentanoperhydrofenantrenu).W tkankach roślin i zwierząt wykryto jak dotąd istnienie kilkuset różnych steroidów, które pełnią w ich organizmach rozmaite funkcje. W fizjologii i medycynie najważniejszymi steroidami są cholesterol i jego pochodne oraz hormony sterydowe.

Produkty reakcji cholesterolu z silnymi kwasami dają szaro-fioletowe (czerwono-fioletowe?) kompleksy z solami żelazowymi.

Najpierw spryskujemy r-rem stężonych kwasów(siarkowy i octowy), a później r-rem soli żelazowe (u nas FeCl3) i ogrzać w temp. 100stopnii. Powinny się pojawić plamy cholesterolu. Po dłuższym ogrzewaniu zaczną pojawiać się także inne tłuszcze(bo się wszystko zaczyna zwęglać)

Detekcja lipidów rezorcynolowych:
Lipidy rezorcynolowe są grupą związków lipidowych będących długołańcuchowymi pochodnymi l,3 dwuhydroksy-5-alk(en)ylo-benzenu, są więc homologami orcyny. Lipidy rezorcynolowe występują w materiałach roślinnych, w tym w ziarniakach Gramineae oraz w przetrwalnikach (cystach) bakterii glebowych, takich jak Azotobacter i Micrococcus. Biologiczna rola tych związków nie jest jeszcze poznana, chociaż wiele wskazuje na możliwość ich uczestnictwa w regulacji biosyntezy innych lipidów oraz w mechanizmach obronnych. Charakterystyczną cechą lipidów rezorcynolowych ziaren zbóż jest fakt występowania w nich szerokiego spektrum homologów. Wykazano homologi nasycone, jednonienasycone, a także dwunienasycone. W każdej z tych grup występują z kolei homologi posiadające nieparzystą liczbę atomów węgla w łańcuchach alifatycznych - w ziarnach żyta od Cl3 do C27. Na przykładzie tych związków można prześledzić strategię stosowaną do uzyskania określonego pojedynczego związku lipidowego.

Związki fenolowe będą reagowały z solami diazoniowyni dając barwniki.

Metoda pierwsza: Spryskujemy r-rem 1%waniliny w 50%kwasie o-fosforowym i ogrzewamy w 110stopniach. Lipidy rezorcynolowe wybarwią się na różowo-czerwono.

Metoda druga: (my ja robiliśmy) spryskujemy 0.5%r-rem East BlueB w 5%kwasie octowym, a lipidy rezorcynolowe wybarwią się na czerwono-fioletowo.
W tej matodzie stosowaliśmy płytkę RF-18 czyli tą z odwróconymi fazami (podłoże hydrofobowe, a faza rozwijająca hydrofilowa). Szybciej wędrują lipidy z „krótszym ogonkiem”,

METODY KOLORYMETRYCZNE

Oznaczanie cholesterolu całkowitego:
Wykorzystuje się tutaj powstawanie barwnych kompleksów z solami żelazowymi, w środowisku kwaśnym.
Najpierw dodajemy kwas octowy(1,5ml), później naszą próbkę i 1ml. odczynnika żelazowego(FeCl₃ z kwasem siarkowym). Po dokładnym wymieszaniu odczekać kilka minut i zmierzyć absorbancję przy λ=550nm. Ilość cholesterolu wyliczyć z krzywej kalibracyjnej (20-100µg cholesterolu)

Oznaczanie stężenie fosfolipidów metodą Stewarda:
Wykorzystuje się tutaj zdolność do tworzenia rozpuszczalnego w chloroformie kompleksu pomiędzy fosfolipidami a tiocyjanem żelaza(III)(czyli rodankiem-to takie krwistoczerwone[Fe(SCN)₃). Metoda jest na tyle dobra, że nie zakłócają jej obecność fosforanów nieorganicznych(obecnych np. w płynie do mycia naczyń, czy w buforach). Ograniczeniem jest to, że dla każdej mieszaniny fosfolipidów trzeba robić osobną krzywa kalibracyjną. W tej metodzie słabo wybarwia się np. fosfoatydyloglicerol.


1. Przygotować krzywą kalibracyjną dla standardu o znanym stężeniu (u nas: 0,5mg/ml)-bierzemy 0ml, 0.1ml, 0,2ml…1ml i dopełniamy to do 2ml chloroformem.
2.Do wszystkich probówek dodać 2ml rodanku.
3. To samo robimy z naszymi próbami badanymi(najlepiej zrobić kilka, żeby się zmieścić w zakresie krzywej)
4.Mieszamy na wytrząsarce przez jakieś 2 min.
5.Dolna faza(ta chloroformowa, nie rodankowa) zacznie przybierać barwę krwistoczerwoną, której barwa będzie zależała od stężenie fosfolipidów.
6. Probówki wirujemy przez 5 min i zbieramy dolną warstwę
7. Mierzymy absorbancję przy 485nm używając kuwety szklanej(CHLOROFORM!)8. Ilość fosfolipidów odczytujemy z piknie zrobionej krzywej kalibracyjnej

Oznaczanie fosfolipidów metodą wanilinową
Fosfowanilina reaguje z wiązaniem nienasyconym („=”). Także reakcje dodatnią dają ketony, aldehydy, wyższe alkohole, kwasy karboksylowe i cała ta nienasycona ferajna. Cholesterol ma jedno wiązanie nienasycone i w tej metodzie służy jako standard.. (kwasy tłuszczowe się do tego nie nadają, bo SA nietrwałe, trudne do uzyskania w postaci wysokocząsteczkowej a na dodatek DROGIE).
Uwaga!STRZEŻCIE SIĘ!: Metoda wanilinowa jest metoda współczynnikową, czyli wyliczona wartość ogóle nie musi być równa faktycznej zawartości lipidów nienasyconych! Ale i tak jest chyba najbardziej wiarygodna i najszybszą.

Jak ekstrahujemy lipidy w określonych warunkach z określonego materiału, to porównując oznaczenie składu metodą wagową a następnie metodą wanilinową możemy sobie wyznaczyć współczynnik, przez który możemy sobie pomnożyć naszą wartość, aby uzyskać rzeczywista zawartość lipidów w próbie.

1. W suchej próbówce umieścić 50 µl próby badanej i 2ml stężonego kwasu siarkowego(95%), potem dobrze wymieszać i ogrzewać przez 20min. w łaźni. Ochłodzić. To samo robimy z próbą wzorcową o znanym stężeniu.

2. Pobrać 0.1ml powyższych hydrolizatów i dodać do nich po 4ml odczynnika wanilinowego (0.01M wanilina w 11,5M kwasie ortofosforowym). Mierzymy absorbancję przy 525nm.

3. Ilość wyliczamy ze wzorku
   µg lipidów w próbie= A_badanejx350/A_wzorca