Ćwiczenie 1

Oznaczanie stężenia białka

Większość metod wymaga rozpuszczonych substancji, takich jak peptydów, białek, białek modyfikowanych potranslacyjnie (np. glikozylowane) lub białek modyfikowanych chemicznie (np. PEG-owanych). Kowalencyjna modyfikacja (glikozylacja lub PEGylacja) może specyficznie oddziaływać z konkretną metodą.

Jeśli nie ma standardu białka do porównania -> użyć standardu np. BSA lub IgG (unikać metody Bradford!)

Jeśli nastąpiły modyfikacje potranslacyjne (np. glikozylacja) -> unikać metody Bradford i Lowry’ego

Jeśli próbka ma Mcz > 8 kDA oraz dużo reszt Tyr i Trp -> unikać metody Bradford i pomiaru absorbancji przy 280 nm

(wrócić do Fi.8.1)

Spektroskopia absorbancji UV przy 280 nm:

• pochodzi głównie od reszt aromatycznych (tyrozyna i tryptofan) – jeśli więc jest ich mało, może dać błędne wyniki

• używane kuwety kwarcowe,

• unikać buforów ze składnikami z silną absorbancją UV – detergentów (głównie Triton X-100)

• odnośnik – bufor bez białek

• jeśli zna się współczynnik ekstynkcji molowej, można skorzystać z prawa Lamberta-Beera:

• zakres: 20-300 µg (dla zakresu 1-100 mierzy się przy 205 nm)

Metoda Bradford:

• barwnik Coomassie-Blue G-250,

• polega na łączeniu się barwnika w kwaśnym pH do reszt argininy, histydyny, phenyloalaniny, tryptofanu i tyrozyny -> reakcje hydrofobowe

• po związaniu barwnika z białkiem następuje zmiana z 465 do 595 nm (stabilizacja anionowej formy barwnika)

• reagenty:

• Coomassie Brilliant Blue G-250

• etanol

• kwas fosforowy

• mierzy się absorbancję przy 450 i 595 nm

• zalety: łatwośc użycia, wrażliwość, niskie koszty

Metoda Lowry’ego – alkaliczna redukcja miedzi:

• dwustopniowa procedura:

1. reakcja biuretowa: redukcja Cu2+ do Cu+ przez białka w alkalicznym roztworze

(siarczan miedzi jest dodawany do alkalicznego roztworu białka -> kolor purpurowo-fioletowy)

2. redukcja reagenta Folin-Ciocalteu (fosfomolibdenian i fosfowolramian) -> niebieski kolor z max absorbancji przy 750 nm

• barwa zależna nie tylko od kompleksu (zredukowana miedź-wiązanie amidowe), ale też od reszt tyrozyny, tryptofanu, cystyny, cysteiny i histydyny.

• mierzy się absorbancję przy 750 nm

• wrażliwa na różne związki towarzyszące

Metoda BCA – kwas bicynchoninowy:

• zastąpienie odczynnika Folin-Ciocalteu kwasem bicynchoninowym -> zwiększenie wrażliwości i tolerancji na związki przeszkadzające

• tworzy się fioletowy kompleks z jonami Cu+ (powstały z Cu2+ i białek)

• reakcja zależna od temperatury

• inkubacja w 37 lub 60˚C

• mierzy się absorbancję przy 562 nm

• wrażliwe na chelatory miedzi (np. EDTA) i reduktory Cu2+ (np. DTT)

Ćwiczenie 5 i 6:

1. Reakcje chlorku dansylu:

Chlorek dansylu jest reaktywny względem różnych zasad. W analizie sekwencyjnej najważniejsze są aminy pierwszo- i drugorzędowe obecne jako końcówe grupy aminowe peptydów i białek. Reaktywne łańcuchy boczne zawierają (uporządkowane według malejącej reaktywności):

• tiol (cysteina),

• fenolohydroksyl (tyrozyna),

• amina (lizyna),

• imidazol (histydyna)

Chlorek dansylu jest raczej wrażliwy na hydrolizę przez wodę i jony hydroksylowe. Grupy aminowe reagują tylko jako wolna zasada (R-NH2), a nie jako sprzężony kwas (R-NH3+), więc oznaczanie musi odbywać się w pH alkalicznym.

2. Identyfikacja dansylowanych aminokwasów:

• do analizy DNS-aminokwasów używa się elektroforezy wysokonapięciowej oraz chromatografii na warstwach poliamidowych.

• mieszaninę DNS-aminokwasów tworzy się z: aminokwasy + NaHCO3 + DNS-Cl w acetonie (po zakończonej reakcji dodaje się kwasu mrówkowego i w tym przechowuje)

• wysokonapięciowa elektroforeza w pH 4,4: najlepiej najpierw wyekstrahować DNS-aminokwasy z hydrolizatu (octanem etylu z wodą) -> usunięcie HCl

• w hydrolizacie znajduje się głównie chlorek sodu i DNS-OH, a oprócz tego aminokwasy, DNS-aminokwasy oraz DNS-NH2.

• suchy octan etylu nie penetruje soli na tyle wydajnie, żeby wyekstrahować DNS-aminokwasy; górna faza mieszaniny octan etylu/woda jest na tyle mokra, żeby przekształcić sól w cienką warstwę roztworu, z której DNS-aminokwasy łatwo ekstrahują.

3. Wizualizacja DNS-pochodnych:

• substancje wygaszające fluorescencję DNS-aminokwasów: woda, kwasy, pirydyny

Chromatografia cienkowarstwowa DNS-aminokwasów na płytkach poliamidowych

• fluorescencja może być wzniecona zarówno przez falę światła UV długą (366 nm), jak i krótką (254 nm).