SPRAWOZDANIE NUMER 3.

BADANIE KINETYKI REAKCJI ENZYMATYCZNEJ.

Środa 3.11.2010, godzina 9.

Jagoda Chowaniec, Natalia Mucha, Laura Pardyak, Justyna Piekara.

Zadanie:

Wyznaczanie stałej Michaelisa dla arylosulfatazy A.

Wstęp:

Kinetyka reakcji enzymatycznej, to badanie szybkości reakcji katalizowanych przez enzymy. Najprostszym sposobem badania szybkości reakcji jest badanie narastania produktu reakcji w czasie. Jedną z podstawowych cech jest to, że kompleks ES (enzym-substrat) jest koniecznym etapem pośrednim procesu katalitycznego. Powstaje model, który jest najprostszym sposobem opisującym właściwości kinetyczne wielu enzymów. Równanie opisujące kinetykę reakcji eznymatycznej można uprościć, wprowadzając stałą Michaelisa:

KM - stała Michaelisa- wyrażona jest w jednostkach stężenia i jej wartość nie zależy od stężenia enzymu i substratu, jest ważną cechą charakterystyczną odziaływań enzym-substrat. Liczbowo jets równa takiemu stężeniu substratu, pzry którym szybkość reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej.

Arylosulfataza A- kwaśna glikoproteina o dużej zawartości reszt kwasu glutaminowego i asparaginowego, oraz proliny.

Użyty sprzęt labloatoryjny, szkło i odczynniki:

Probówki typu Eppendorf ( dla każdego stężenia substratu po 7 probówek).

Pipety automatyczne

Spektrofotometr, przyrząd do inkubacji, stoper do pomiaru czasu.

Homogenat wątroby ( źródło arylosulfatazy), siarczan p-nitrokatecholu (substrat, użyto 5 różych stężeń: 20mg/10 ml, 40mg/10 ml, 60 mg/10 ml, 80 mg/10 ml, 120 mg/10 ml), bufor octanowy pH 5,0 zawierający 10% NaCl, NaOH, H2O.

Wykonanie:

Ponieważ w doświadczeniu dysponowno 5 rożnymi stężeniami substratu, doświadczenie wykonano 5-krotnie (metodą tradycyjną), przy każdej z prób (A- gdzie steżenie substratu=20mg/10 ml, B=40mg/10 ml, C=60 mg/10 ml, D=80 mg/10 ml, E=120 mg/10 ml) używając innego stężenia substratu.

Dokładny opis wykonywanych czynności dla próby A, gdzie stężenie substartu wynosiło 20 mg/10ml:

1. Wykonanie ślepej odczynnikowej:

1. Do przygotowanej probówki typu Eppendorf odpipetowano 100 mikrolitrów 0,5 M buforu octanowego, 100 mikrolitrów substratu ( p-nitrokatecholu) o steżeniu 20 mg/10 ml i 100 mikrolitrów H2O.

2. Otrzymaną substancję inkubowano w temperaturze 37 °C.

3. Po 5 minutach inkubacji dodano do probówki 1 ml 0,5 m NaOH.

2. Sporządzenie 1,5 ml mieszaniny reakcyjnej ( metodą tradycyjną) :

1. Do przygotowanej probówki typu Eppendorf odpipetowano 0. 6 ml homogenatu wątroby, 0.6 ml substartu o stężeniu 20 mg/ml, 0.6 ml 0.5 M buforu octanowego pH 5.0 zawierającego 10 % NaCl.

2. Mieszaninę wytrząśnięto i inkubowano w temperaturze 37 °C.

3. Po dwóch minutach pobrano 300 mikrolitrów i przeniesiono do przygotowanej wcześniej probówki typu Eppendorf, zawierającej 1 ml 0.5 M NaOH.

4. Tą samą czynność przeniesienia 300 mikrolitrów do poszczególnych probówek (przygotowanych w ten sam sposób) powtórzono po 4 , 6, 8, 10 minutach inkubacji.

5. Po przeniesieniu dokładnie wymieszano probówki.

6. Zmierzono absorbancję ( spektrofotometrem), przy 515 nm, względem przygotowanej wcześniej ślepej odczynnikowej.

Dla pozostały 4 stężeń substratu oznaczenia i ślepą odczynnikową wykonano analogicznie, jak dla steżenia 20 mg/ml, używając przy każdej próbie odpowiedniego stężenia substratu:

B- 0.6 ml substratu o stężeniu 40 mg/10 ml

C-0.6 ml substratu o stężeniu 60 mg/10 ml

D-0.6 ml substratu o stężeniu 80 mg/10 ml

E-0.6 ml substratu o stężeniu 120 mg/10 ml

Wyniki wszystkich pomiarów absorbancji dla różnych stężeń zestawiono w tabeli numer 1.( 3 pomiar dla stężenia substratu 80mg/ 10ml, odrzucono ze względu na pomiar po czasie)

Tabela nr.1

Stężenie substratu 20 mg/10ml- A		Stężenie substratu 40 mg/10ml- B		Stężenie substratu 60 mg/10ml- C		Stężenie substratu 80 mg/10ml- D		Stężenie substratu 120 mg/10ml- E
T [s]	A	T [s]	A	T [s]	A	T [s]	A	T [s]	A
120	0.085	120	0.07	120	0.055	120	0.05	120	0.065
240	0.095	240	0.095	240	0.075	240	0.075	240	0.100
360	0.145	360	0.100	360	0.110	400	0.255	360	0.140
480	0.155	480	0.125	480	0.135	480	0.145	480	0.175
600	0.125	600	0.135	600	0.155	600	0.165	600	0.220

1. absorbancja

T- czas pomiaru (sekunda)

Obliczenia i wnioski:

Na podstawie uzyskanych wyników absorbancji zostały wykreślone krzywe kinetyczne (dla każdego ze stężeń substratu), obrazujące zależność przyrostu stężenia produktu, do czasu inkubacji. (załączniki numer 1,2,3).

Krzywe wykreślono przeliczając uzyskane wartości absorbancji ma ilość uzyskanego produktu ( 4- nitrokatecholu). Obliczeń dokonano, przyjmując, że w podanych warunkach:

1 mol produktu -- absorbancja 3.2-przy 515 nm.

Więc ( obliczenia dla stężenia produktu 20 mg/10 ml):

1. po 120 sec. A=0.085 b) po 240 sec. A= 0.095

1 mol - 3.2 1 mol - 3.2

x - 0.085 x - 0.095

x= 0.02 mola x= 0.029 mola

c) po 360 sec. A= 0.145 d) po 480 sec. A=0.155

1 mol - 3.2 1 mol - 3.2

x - 0.145 x - 0.155

x= 0.045mola x= 0.048 mola

e) po 600 sec. A=0.125

1 mol - 3.2

x - 0.125

x=0.039 mola

Analogicznie wykonano obliczenia dla pozostałych prób: B, C, D, E.

Wyniki zestawiono w tabeli numer 2.

Tabela numer 2.

Stężenie substratu 20 mg/10ml- A		Stężenie substratu 40 mg/10ml- B		Stężenie substratu 60 mg/10ml- C		Stężenie substratu 80 mg/10ml- D		Stężenie substratu 120 mg/10ml- E
T[s]	n[mikromol]	T[s]	n[mikromol]	T[s]	n[mikromol]	T[s]	n[mikromol	T[s]	n[mkromol]
120	0.02	120	0.021	120	0.017	120	0.015	120	0.020
240	0.029	240	0.029	240	0.023	240	0.023	240	0.031
360	0.045	360	0.031	360	0.034	360	0.079	360	0.043
480	0.048	480	0.039	480	0.042	480	0.045	480	0.054
600	0.039	600	0.042	600	0.048	600	0.051	600	0.068

T-czas; n-liczba moli

Na podstawie wykreślonych krzywych kinetycznych wyznaczono graficznie szybkości początkowe :

A. Stężenie substratu= 20 mg/ 10ml B. Stężenie substratu= 40 mg/ 10ml

V0 = mol/s V0 = mol/s

V0 = 1,66 * 10^-4 V0 = 1,75* 10^-4

C.Stężenie substratu= 60 mg/ 10ml D. Stężenie substratu= 80 mg/ 10ml

V0 = mol/s V0 = mol/s

V0 = 1,41* 10^-4 V0 = 1,25* 10^-4

E. . Stężenie substratu= 120 mg/ 10ml

V0 = mol/s

V0 = 1,66 * 10^-4

Aby sporządzic wykres Lineweavera-Burka, użyto danych obliczonych w paragrafach poprzednich ( odwrotności stężenia i prędkości początkowej):

A. 1/ V0=6024 1/[S]=0.05

B. 1/ V0=5714 1/[S]=0.025

C. 1/ V0=7092 1/[S]=0.017

D. 1/ V0=8000 1/[S]=0.0125

E. 1/ V0=6024 1/[S]=0.0083

Sporządzono wykres zależności odwrotności szybkości początkowych, a odwrotności stężeń substratu .Na podstawie wykresu wyznaczono graficznie wartości Km i Vmax- Załącznik numer 4.

---