KULTURY TKANKOWE

ZWIERZĘCE I ROŚLINNE

Wykład 11

Terapia genowa

[e-mail]

TERAPIA GENOWA

z perspektywy choroby

Genetyczna modyfikacja komórek docelowych

mająca na celu wywołanie efektu terapeutycznego

Naprawianie defektów genetycznych;

wprowadzanie prawidłowych genów

zastępujących gen wadliwy lub

uzupełniających jego funkcje - terapia
suplementacyjna

–

choroby jednogenowe)

lub hamowanie ekspresji genu, który

wyłamał się spod kontroli - terapia
supresyjna

Eliminacja nieprawidłowych

komórek z ustroju –terapia

celowana

(choroby wielo-

genowe m.in. nowotwory)

Efekty jakie można osiągnąć terapią genową:

• Kompensację defektu genetycznego

• Skorygowanie mutacji, rewersję genu zmutowanego

• Zahamowanie ekspresji zmutowanego genu

• Uzyskanie przez komórki nowych cech fenotypowych

• Bezpośrednią eliminację niepożądanych komórek

TERAPIA GENOWA

z perspektywy mechanizmu

Manipulacja aktywnością (ekspresją) genów mająca wpływ

na proces chorobowy

Poprzez trasdukcję lub transfekcję

Transfer całych genów oligonukleotydów,

brakujących, defektywnych, rybozymów,

o zbyt niskiej ekspresji czynników transkrypcyjnych

Wprowadzenie „egzogenów” Blokada natywnych genów

• Definicje

• Transdukcja-

przenesienie

genomu wirusa do komórki

eukariotycznej (transfer genu do komórki

za pomocą wektorów

wirusowych

); (w świecie bakterii - wymiana DNA pomiędzy

bakteriami, także za pomocą wirusa)

• Transfekcja

– wprowadznie plazmidowego DNA do komórek

eukariotycznych

za pomocą nosników niewirusowych

• Transformacja

– pobieranie przez komórki bakteryjne

„nagiego” DNA z podłoża

• Transgen

– gen uzyskany na drodze powyższych manipulacji

PODSTAWOWE KROKI TERAPII GENOWEJ

Transfer genów do komórek docelowych

Ekspresja genu terapeutycznego w komórkach

docelowych

Białko terapeutyczne

Korygowanie defektu Niszczenie komórek

Gen + (nośnik) = lek

Efekt terapeutyczny

TECHNIKI WPROWADZANIA GENÓW

Pobranie komórek z

organizmu i hodowla in vitro

Ponowne wprowadzenie zmodyfikowanych
komórek do organizmu

IN VIVO

EX VIVO

Wprowadzenie DNA
wprost do organizmu
(np.

domięśniowo,

doguzowo

, dożylnie)

Modyfikacja
genetyczna i
selekcja zmo-
dyfikowanych
komórek

•

Transfekcja „nagiego” DNA

(plazmidowego)

•

Transdukcja

- wektory wirusowe (retrowirusy, lentiwirusy,

adenowirusy, AAV-

wirusy towarzyszące adenowirusom,

wirusy opryszczki HSV-1, wirusy SV40 i Epstein-Barr)

•

Metody chemiczne

-

nośniki niewirusowe (liposomy,

polikationy, kopolimery, poliaminokwasy (polipleksy)

•

Metody fizyczne

– elektroporacja, sonoporacja,

mikroiniekcja, strzelba genowa (gene gun)

METODY WPROWADZANIA GENÓW

Wektory wirusowe - tworzenie



System tworzenia zrekombinowanych wirusów wymaga:

- wektora wirusowego
-

komórek pakujących

 Wektor wirusowy:

część lub większość genów wirusowych zastępuje

się genem terapeutycznym)



Usuwa się geny odpowiedzialne za replikację wirusa i/lub białka
otoczki



Komórki pakujące

tworzy się wprowadzając trwale do komórek

ustalonych linii geny kodujące brakujące w wektorze białka wirusowe



Takie komórki transdukuje się wektorem wirusowym, który zostaje
upakowany do otoczki



Powstałe wiriony mogą infekować komórki docelowe, ale nie są

zdolne do replikacji w komórkach docelowych (tylko w komórkach

pakujących)

Wektory wirusowe

•

Retrowirusy

rekombinowane, replikacyjnie defektywne; do transferu

in vitro

do komórek (in vivo rzadziej - niska wydajność transdukcji).

•

Transdukują tylko komórki dzielące się (duża wydajność transdukcji)

•

Brak specyficznego celowania in vivo.

•

Materiał genetyczny to jednoniciowe RNA. W zakażonych komórkach
RNA zostaje przepisane na dwuniciowe DNA i wbudowane w genom

komórki -

stabilna integracja

•

Ryzyko rekombinacji genetycznej i możliwość integracji

przypadkowej z chromosomowym DNA => aktywacja onkogenów !

Wektory adenowirusowe

, jedne z najbardziej uniwersalnych nośników.

Wnikają do prawie wszystkich typów komórek, zarówno dzielących się
jak i nie (skuteczność prawie 100%)

Nie integrują z genomem komórki

W naturze adenowirusy atakują nabłonkowe komórki układu
oddechowego i pokarmowego.

Po podaniu do krwi wektory transdukują natomiast głównie wątrobę,
(hepatocyty i komórki śródbłonka).

Wprowadzony transgen pozostaje w jądrze w formie episomalnej, pozwala
to na bardzo silną ekspresję, która jednak jest krótkotrwała
i obniża się gwałtownie po kilku dniach.

(w układzie

CNS

bariery fizyczne, np. arterioskleroza ograniczają

transdukcję do śródbłonka)

Wektory z wirusów towarzyszących adenowirusom

(AAV, adeno-

associated viruses)

– ostatnio budzą zainteresowanie.

AAV mogą transdukować wiele typów komórek, dzielących i nie
dzielących się.

Nie indukują silnej odpowiedzi układu odpornościowego.

Wprowadzany transgen pozostaje zwykle w formie episomalnej.

Dzikie wirusy AAV wbudowują się do genomu ściśle określonym
miejscu (tak zwane locus AAVS1) na chromosomie 19.

Taka specyficzna integracja minimalizowałaby ryzyko indukcji
mutagenezy insercyjnej, przy jednoczesnym zapewnianiu długotrwałej
ekspresji.

W celu przenoszenia leczniczych genów wykorzystywane są również

wirusy z rodziny Herpesviridae

(opryszczki), wirusy krowianki,

Wirusy Polio

Lentiwirusy

-

podrodzina retrowirusów o cylindrycznym kształcie;

mają one zdolność wnikania do jądra komórki i nie są onkogenne
(HIV-1 oraz HIV-

2 są najczęściej wykorzystywane jako

wektory lentiwirusowe.

Inny typem wektorów to wektory plazmidowe.

Plazmidy -

koliste cząsteczki DNA zdolne do replikacji w komórkach

gospodarza niezależnej od replikacji chromosomów.

Preparaty plazmidowe uzyskuje się najczęściej metodą lizy zasadowej
stransformowanych bakterii Escherichia coli, a do oczyszczania
wykorzystuje

się metody chromatograficzne (otrzymuje się duże ilości

mRNA kodującego białko terapeutyczne.

Prowadzone są też badania z wykorzystaniem

transpozonów

oraz

sztucznych chromosomów

(terapia przyszłości?)

Transpozony - ruchome elementy genetyczne zdolne do zmiany
miejsca położenia w genomie.

Wykorzystywane są do otrzymywania organizmów transgenicznych,
z których wycina się zbędne geny i na ich miejsce wprowadza się
geny terapeutyczne.

Być może, zmodyfikowane transpozony będą zdolne do przenoszenia
terapeutycznych genów i ich integracji z genomem uszkodzonej
komórki, w której zajdzie ekspresja leczniczego genu.

Antysensy

•

Krótkie oligonukleotydy (jednoniciowe cząsteczki 12- 20 zasad
o sekwencji komplementarnej do wybranego mRNA).

•

Po hybrydyzacji z RNA zapobiegają translacji

•

Hamowanie ekspresji genów - przede wszystkim przez blokowanie
translacji, ale także przez „blokowanie” funkcji nieprawidłowych
genów

Pułapki oligonukleotydowe

Dwuniciowe DNA, zawierające odcinki wiążące czynniki transkrypcyjne.

Wprowadzane do komórek w dużych ilościach zapobiegają aktywacji
przez czynnik transkrypcyjny genów zawierających w promotorach
sekwencje obecne w pułapce.

Np. Pułapki oligonukleotydowe wiążące czynnik transkrypcyjny E2F
(odpowiedzialny za proliferację komórek i ponowne zwężenie naczyń)
wykorzystano w próbach klinicznych hamowania zarastania pomostów
tętniczo-żylnych (bypasów).

Niestety, mimo bardzo obiecujących wyników badań na zwierzętach oraz

prób klinicznych I i II fazy, testy na 3000 pacjentów nie wykazały efektów
zapobiegających restenozie

Rybozymy

 Oligorybonukleotydy

o właściwościach nukloelitycznych



Enzymatyczne RNA, degradujące mRNA nieprawidłowych
(zmutowanych) genów, np. mRNA v.HIV, mRNA ras



Zawierają region katalityczny i region rozpoznający specyficzną
sekwencję (ok. 6 zasad)



Oprócz hamowania ekspresji genów mogą być wykorzystywane
do naprawy mutacji. Dzięki zdolności do wycinania RNA
możliwe jest usunięcie zmutowanego odcinka z docelowego
mRNA

i ewentualne wprowadzenie prawidłowego fragmentu

(próby leczenia anemii sierpowatej lub dystrofii mięśniowej).

siRNA w terapii genowej

Zainteresowanie budzi siRNA (small interfering RNA ;
niskocząsteczkowe interferujące RNA).

Wykazano eksperymentalnie, że siRNA skierowane przeciwko VEGF
obniża o ok. 40% aktywność tego genu

W innych doświadczeniach cząsteczki siRNA hamowały ekspresję
genu MDR1 (multidrug resistance gene

), kodującego glikoproteinę P

odpowiedzialną za zjawisko oporności wielolekowejn (ulega ekspresji
w większości nowotworów)

Supresja genu MDR1

w ludzkiej linii komórkowej raka piersi MCF-7

korelowała z obniżeniem oporności wielolekowej.

Zastosowanie siRNA usuwającego mRNA VEGF, mediatora procesów
angiogenezy, jest testowane u pacjentów cierpiących na starcze
zwyrodnienie plamki żółtej (ADM)



Kuliste pęcherzyki,

złożone z dwuwarstwy
lipidowej



Powstają w wyniku
spontanicznej
agregacji amfipatycz-
nych

cząstek lipidów

w środowisku
hydrofilowym



Zamykają cząsteczki
leku

Nośniki niewirusowe - Liposomy

Liposomy-
kompleksy DNA-
nośnik

Cząsteczki lipidu
pozbawionego ładunku
(A) wraz z lipidami
kationowymi (B)
tworzą sferyczne
struktury lipidowe
składające się z dwóch
koncentrycznych warstw
lipidów (C)

Transfer DNA do komórki
eukariotycznej

Cząsteczki plazmidowego
DNA nie mogą wniknąć do
komórki z powodu
elektrostatycznego
odpychania. Tworzenie
kompleksu powoduje

kondensację

DNA

plazmidowego

Kompleksy DNA z liposomami
kationowymi (lipopleksy)
wnikają do komórki na drodze
endocytozy.

Transport plazmidowego DNA
zamkniętego w liposomach:

A. Endocytoza

B. Powstanie endosomu

C. Rozpad endosomu
D. Transport kompleksu DNA-
nośnik do jądra

E. Uwolnienie DNA,

F. Transkrypcja

G.Transport mRNA do
cytoplazmy

H. Translacja i synteza białka
terapeutycznego

•

Wydajność transferu DNA do komórek docelowych za pomocą
niewirusowych nośników jest niższa w porównaniu z wirusami

•

Wydajność transfekcji w przypadku nośników niewirusowych zależy
od fazy cyklu komórkowego i wzrasta 10-300 krotnie w fazie S i G2 w
stosunku do fazy G1

•

Nośnik-plazmidowy DNA z transgenem może wniknąć do jądra

niekiedy w drodze fuzji z błoną jądrową

•

Może też wniknąć pasywnie podczas podziału komórki (komórki

dzielące się łatwiej się transfekują)

•

Transport aktywny poprzez związanie z białkiem, które ma sygnał

lokalizacji jądrowej

Idealny wektor do terapii genowej



Jednakowo specyficzny do komórek dzielących się i niedzielących



Zapewniający długotrwałą ekspresję



Przenoszący geny o różnej wielkości (duża pojemność

wektora)



Zapewniający kontrolę czasu i stopnia ekspresji



Zdolny do rozpoznawania specyficznego typu komórek



Podlegający ochronie w krwiobiegu



Zapewniający swoistość transdukcyjną, transkrypcyjną,

endosomolityczną i jądrową

SWOISTOŚĆ

TRANSDUKCYJNA

LIGAND

KOMÓRKA

RECEPTOR

Ograniczenie wprowadzania
genów do określonego typu
komórek przez miejscowe
wprowadzanie genów, tropizm
wirusów do tkanek, immuno-
liposomy lub wykorzystanie
swoistego liganda do właściwego
receptora

SWOISTOŚĆ (DOMENA) TRANSKRYPCYJNA

GEN TERAPEUTYCZNY

SWOISTY PROMOTOR

TRANSKRYPCJA

GEN TERAPEUTYCZNY

SWOISTY PROMOTOR

TRANSKRYPCJA

KOMÓRKA NOWOTWOROWA

KOMÓRKA PRAWIDŁOWA

CZYNNIKI

TRANSKRYPCYJNE

BRAK CZYNNIKÓW

TRANSKRYPCYJNYCH

Cz.tr

. Dla swoistych promotorów występują tylko w danym typie tkanek

(tyrozynaza-czerniak, alfa-fetoproteina-watrobiaki itp..)

DOMENA ENDOSOMOLITYCZNA

• Polietylenoimina

• Fosfatydyloetanoloamina

• Melityna

Domena lokalizacji jądrowej

Sygnał lokalizacji jądrowej (NLS)

Plazmidowy DNA powinien zawierać w promotorze/enhancerze sekwencje, z którymi wiązałyby
się białka cytoplazmatyczne o charakterze czynników transkrypcyjnych i taki kompleks byłby
transportowany do jądra.

Np. w przypadku transferu genów do mięśni gładkich musiałyby te

sekwencje wykazywać powinowactwo do czynników transkrypcyjnych unikalnych dla mięśni.

STRATEGIA POŚREDNIEGO NISZCZENIA

GENY IMMUNOMODULACYJNE

Geny immunomodulacyjne kodują białka aktywujące układ
immunologiczny

Przykłady: geny cytokin, geny MHC, geny kodujące cząsteczki
kostymulujące

Geny kodujące
cytokiny

Aktywacja komórek
układu immunol.:
CD4, CD8, NK, APC

Cytokiny

STRATEGIA POŚREDNIEGO NISZCZENIA

GENY ANTYANGIOGENNE

• Geny antyangiogenne

kodują białka hamujące angiogenezę/

neoangiogenezę (hamujące powstawanie nowych naczyń
nowotworów)

• Komórki docelowe: komórki mięśniowe, komórki guza

• Przykłady: gen angiostatyny, gen endostatyny

CHOROBY GENETYCZNE

CHOROBY JEDNOGENOWE

CHOROBY WIELOGENOWE

Anemia sierpowata

SCID/ADA, SCID/X

Nowotwory

Mukowiscydoza

Choroby neurodegeneracyjne

Fenyloketonuria

Choroby układu krążenia

Choroba Canavan

Choroby infekcyjne

Rodzinna hipercholesterolemia
Dystrofia mięśniowa Duchenne’a
Hemofilia

Anemia sierpowata (mutacja w genie HbS)

Gen beta-globiny zawiera
informacje o sekwencji
aminokwas

ów w jednym z

dw

óch rodzajów podjednostek

w cz

ąsteczce hemoglobiny.

Zamiana tylko jednego
nukleotydu (mutacja)
powoduje powstawanie
hemoglobiny “s”, różniacej się
tylko jednym aminokwasem
(walina zamiast kwasu
glutaminowego)

Choroba dziedziczy się w
sposób autosomalny (nie jest
związana z płcią) i recesywny

Normalne
erytrocyty
(hemoglobina
A, HbA)

Eytrocyty
sierpowate
(hemoglobina
S, HbS)

Anemia sierpowata

Ewentualna terapia genowa:

•

Wprowadzenie do komórek progenitorowych erytroidalnych
prawidłowego genu



A

globiny (z kodonem kodującym kwas

glutaminowy)

•

Naprawa mutacji punktowej w komórkach progenitorowych
poprzez zamianę zmutowanego kodonu GTG na prawidłowy GAG

Choroby jednogenowe

 SCID/ADA

– ciężki złożony niedobór odporności związany z

niedoborem deaminazy adenozyny (dziedziczona autosomalnie
recesywnie; 20q13.11)

 Mutacja genu ADA powoduje,

że deaminaza adenozynowa biorąca

udział w metabolizmie puryn nie jest wytwarzana (m.in. w Ly T, B i
NK) w dostatecznych

ilościach.

 Deoksyadenozyna

gromadzi

się

w

komórkach

(zwłaszcza

prekursorach Ly T) i jest tam

przekształcana przez kinazę

cytydynową

do

toksycznego

związku

–

trifosforanu

deoksyadenozyny

 Dotychczasowe

leczenie:

przeszczepy

szpiku;

podawanie

bydlęcej

deaminazy

adenozyny

(połączonej

z

glikolem

polietylenowym, PEG-ADA)

 Ewentualna terapia genowa

: wprowadzenie

niezmutowanych

kopii genu do Ly T , a lepiej

komórek macierzystych szpiku

SCID/X1

– ciężki złożony niedobór odporności związany z

mutacjami genu IMD4 na chr

. Xq13 (choroba „chłopca w namiocie”)

• Gen IMD4 koduje łańcuch



c

receptora dla cytokin (IL-2, IL-4, IL-7,

IL-9, IL-15)

• Brak prawidłowego różnicowania limfoidalnych komórek

progenitorowych Ly

T i NK, w konsekwencji upośledzenie bariery

immunologicznej

• Ewentualna terapia genowa

: wprowadzenie in vitro

za pomocą

wektorów retrowirusowych niezmutowanych kopii genu do

komórek macierzystych szpiku (nieprzewidziane następstwa –

białaczki)

Mukowiscydoza

(zwłóknienie torbielowate, 1/3000);

mutacje genu CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance

regulator

(gen regulatora transbłonowego przewodzenia w

mukowiscydosie, 170 kDa; 7q31-q32)

•

Istnieje ~ 500 mutacji genu CFTR

•

Zaburzenia transportu Cl

-

z komórki na zewnątrz w nabłonkach płuc

i oskrzeli, jelit, trzustki, przewodów żółciowych i in.

•

Klinicznie: gromadzenie się śluzu i zatykanie tych przewodów;

zwiększenie sodu oraz chloru w pocie (dotychczas leczenie objawowe

i wspomagające)

•

Ewentualna terapia genowa

: wprowadzenie do nabłonków

oddechowych z defektem genetycznym komórek z prawidłowym genem
CFTR

; kompensuje skutki nie likwidując przyczyny; problem ze

sposobem dostarczenia zmodyfikowanych komórek

Dystrofia mięśniowa Duchennea’a (DMD):

•

Sprzężona z chr. X; 1/3500 chłopców

•

Mutacja genu kodującego dystrofinę (Xp21.2); największy genu

człowieka (zawiera ~2,5 mln. pz. tj. ~1,5% ch.X i 0,1% całego

genomu); wytwarzane białko jest nieprawidłowe lub brak

•

Klinicznie: osłabienie mięśni szkieletowych postępujące z wiekiem

do utraty możliwości poruszania, oddychania, cechy upośledzenia

umysłowego; śmierć najczęściej w wieku ~ 20 lat

•

Ewentualna terapia genowa

: wprowadzenie prawidłowej kopii genu

dystrofiny do komórek mięśni poprzecznie prążkowanych (wektory
retrowirusowe

wprost do komórek satelitarnych, także do komórek

macierzystych szpiku)

Fenyloketonuria

: autosomalna recesywna, spowodowana

mutacjami w genie hydroksylazy fenyloalaninowej (PAH, 12q22-q24.2)

•

PAH usuwa nadmiar egzogennego aminokwasu fenyloalaniny
poprzez

hydroksylację do tyrozyny

•

Klinicznie: nie leczona prowadzi do upośledzenia umysłowego

(zapobieganie: dieta uboga w fenyloalaninę, bogata w tyrozynę przez

całe życie)

•

Ewentualna terapia genowa

: wprowadzenie prawidłowej kopii genu

PAH do komórek docelowych, tj. hepatocytów (bezpośrednio do

wątroby za pomocą adenowirusów, lub wprowadzenie genetycznie
zmodyfikowanych

hepatocytów)

Choroba Canavan

: autosomalna, recesywna, spowodowana

brakiem enzymu N-acetyloaspartazy (nagromadzanie kwasu
N-

acetyloasparaginowego w mózgu prowadzące do zniszczenia

włókien nerwowych i degeneracji istoty białej)

•

Mutacja genu (17pter-

p13) typu missens lub nonsens występują

głównie u Żydów aszkenazyjskich (1/37 urodzeń)

•

Ewewntualna terapia genowa

: wprowadzenie do mózgu

niezmutowanego genu N-acetyloaspartazy (wektory
adenowirusowe i liposomy kationowe)

Rodzinna hipercholesterolemia

: dziedziczona autosomalnie,

dominująco; wynik mutacji genu receptora lipoprotein o małej
gęstosci (rLDL, 19p13.1-13.3)

•

Klinicznie: zwiększenie ~10x w osoczu poziomu cholesterolu
związanego z lipoproteinami o małej gęstości (LDL), nagromadzanie
cholesterolu w stawach; śmierć w wieku ~25 lat

•

Ewentualna terapia genowa

: wprowadzenie do komórek wątroby kopii

prawidłowego genu (udana terapia 16-letniej dziewczyny w USA
komórkami własnej wątroby zmodyfikowanymi prawidłowym genem
rLDL przeniesionymi za pomocą wektorów retrowirusowych, rok 1992)

Hemofilie A i B

: choroby sprzężone z płcią; mutacje genów czynników

krzepnięcia VIII i IX zlokaliz. na chr. X

•

Hemofilia A

(1:10 000 urodzonych chłopców , Xq28); niedobór lub brak

czynnika VIII, wytwarzanego w wątrobie (działa z tzw. czynnikiem
Willebranda)

•

Próby terapii genowej:

•

Wprowadzanie do komórek wątroby cDNA cz.VIII za pomocą
adenowirusów i wirusów towarzyszących okazało się hepatotoksyczne.

•

Do izolowanych ze skóry pacjentów fibroblastów wprowadzano
plazmidowy DNA z genem cz.VIII. Stransfekowane komórki
selekcjonowano i wprowadzano pacjentom do otrzewnej; uzyskano
nieznaczny wzrost czynnika krzepnięcia we krwi (bez objawów
toksyczności)

• Hemofilia B

: (1:30 000 mężczyzn) gen czynnika IX zlokalizowany

jest na chr. Xq27.1-q27.2)

•

Próby terapii genowej:

•

Autologiczne fibroblasty transdukowano ex vivo

za pomocą

wektorów retrowirusowych zawierających gen cz.IX i wprowadzono
do organizmu 2 braci (Chińczyków). Tylko u jednego uzyskano
wzrost poziomu czynnika IX do 3% prawidłowego poziomu u osób
zdrowych przez 1 rok.

CHOROBY WIELOGENOWE

Terapeutyczne Szczepionki przeciwnowotworowe

Komórki nowotworowe często mają część antygenów wspólnych
dla zdrowych tkanek, lub są zmienione tak nieznacznie, iż system
odpornościowy nie rozpoznaje ich dostatecznie wcześnie jako
obcych

Szczepionki w chorobach nowotworowych nakierowane są na:

- nieswoiste wzbudzenie i wspomaganie reakcji immunologicznych

(np. szczepionka BCG w leczeniu raka pęcherza),

- wzbudzanie swoistej odpowiedzi immunologicznej przeciwko

danemu nowotworowi i u danego pacjenta (szczepionki w
czerniaku złośliwym),

-

indukcja odpowiedzi przeciw antygenom wspólnym dla różnych

nowotworów lub zmiana ich immunogenności poprzez celowaną
terapię genową (wzbudzanie odpowiedzi przeciw znanym białkom
wspólnym dla wielu nowotworów, np. telomerazie)

Proapoptotyczna terapia genowa

-

transfer genów,

kodujących czynniki proapoptotyczne:

np. bezpośrednio do guzów nowotworowych może

doprowadzić do indukcji apoptozy komórek nowotworowych i
zahamować wzrost nowotworów

Próby eksperymentalne obejmują m. in.:

Transfer prawidłowej wersji genu P53 m. in. do komórek raka

płuc, piersi, jajnika

Transfer prawidłowej wersji genu BRCA 1 do komórek

nowotworowych

Terapia z udziałem Bcl-2 polega na blokowaniu aktywności

genu poprzez wprowadzenie np. siRNA

STRATEGIA BEZPOŚREDNIEGO NISZCZENIA

GENY PROAPOPTOTYCZNE

Geny proapoptotyczne kodują białka indukujące w komórkach
docelowych apoptozę: wirusowy gen apoptyny, wirusowy gen
E4orf4, bax, kaspazy

KOMÓRKA NOWOTWOROWA

Promotor Gen proapoptotyczny

Białko

proapoptotyczne

Białko proapoptotyczne

APOPTOZA

ŚMIERĆ KOMÓRKI

STRATEGIA BEZPOŚREDNIEGO NISZCZENIA

(GENY SAMOBÓJCZE)

Geny samobójcze - bakteryjne lub wirusowe geny kodujące białka
(enzymy), które przekształcają systemowo podawane nietoksyczne
proleki (substraty) do toksycznych metabolitów

Indukują toksyczny fenotyp w komórkach do których zostały
wprowadzone

ŚMIERĆ KOMÓRKI

Promotor Gen samobójczy

Prolek Toksyna

Enzym

Prolek (gancyklowir)

Przykłady

: gen deaminazy cytozyny

(CD) z E.coli, gen kinazy tymidynowej
wirusa opryszczki (HSVtk)

Efekt sąsiadującej komórki (ang. bystander effect) w terapii

genowej dążącej do eliminacji nieprawidłowych komórek

Limfocyty T wyposażono w gen kodujący receptor dla białka CEA
(na powierzchni komórek nowotworowych). W ten sposób LyT łączą się
specyficznie z komórkami, które mają ulec zniszczeniu.

Limfocyty T zawierające receptor dla CEA dodatkowo zmodyfikowano
tak, by produkowały cząsteczki wirusowe zawierające gen

kinazy

tymidylanowej (tk),

pochodzący od wirusa opryszczki.

Enzym tk

– przekształca prolek - ganciclovir w silnie toksyczny lek,

która zabija komórkę.

Zmodyfikowany limfocyt T łączy się z komórką nowotworową poprzez
receptor dla białka CEA, produkuje cząstki wirusowe, które infekują
komórkę.

Po wniknięciu do komórki nowotworowej, gen tk może ulec ekspresji.

Skuteczność opracowanej metody potwierdzono w badaniach na
hodowlach komórkowych i na myszach chorych na raka płuc i wątroby.

Strategia bezpośredniego niszczenia

•

Użycie niepatogennych bakterii z rodzaju Clostridium;
anaerobowych, Gram-

dodatnich bakterii tworzących spory, za

pomocą których można w drodze podania systemowego wywołać
selektywn

ą kolonizację obszarów hipoksycznych i nekrotycznych

np. w guzie.

•

Po genetycznej modyfikacji bakterie

zawierające gen samobójczy

mogą wydzielać terapeutyczne białka np. TNF-



2, lub białka

enzymatyczne (deaminazę cytozynową, nitroreduktazę),

przekształcające proleki w toksyczne produkty

•

Nuyts S, Van Mellaert L, Theys J, Landuyt W, Lambin P, Anne J Clostridium
spores for tumor-specific drug delivery Anticancer Drugs 2002
Feb;13(2):115-25.

PROTOKOŁY KLINICZNE TERAPII GENOWEJ

(cyt. za Szala, Terapia genowa, 2003)

8%

12%

12%

68%

Choroby

Nowotworowe, 68%

Choroby

Infekcyjne, 8%

Choroby

Monogenowe, 12%

Inne choroby, 12%



Miażdżyca naczyń wieńcowych i obwodowych i restenoza po
angioplastyce (przyczyną prawie 50% zgonów w krajach
Zachodu)



Gojenie i przemodelowanie komory mięśnia sercowego po
zawale; Niedokrwienie kończyn dolnych prowadzące do
kalectwa (gdy zawodzi farmakoterapia, kardiologia inwazyjna
i chirurgia



Najwięcej badań dotyczy terapii chorób niedokrwiennych
kończyn i mięśnia sercowego genami czynników
proangiogennych



Restenozie po angioplastyce można zapobiegać genami
samobójczymi

Choroby układu krążenia a terapia genowa

 Geny proangiogenne: VEGF, bFGF, HGF



W miażdżycy naczyń wieńcowych, powodującej niedokrwienie
mięśnia sercowego oraz w miażdżycy naczyń obwodowych
powodującej niedokrwienie kończyn



Stymulacja procesów

angiogenezy

i

arteriogenezy

za pomocą

czynników proangiogennych kodowanych przez terapeutyczne
geny proangiogenne

Terapeutyczna angiogeneza



Geny proangiogenne wprowadza się w plazmidowym DNA

do komórek mięśnia sercowego, mięśni szkieletowych,
komórek ścian naczyń



Wprowadzenie za pomocą nagiego plazmidowego DNA,

liposomów kationowych, adenowirusów, wirusów
towarzyszących adenowirusom, zmodyfikowanych bakterii

*

Clostridium i Salmonella

*

Gen proangiogenny wprowadzony do genomu bakterii;

bakterie namnażają się w rejonach hipoksycznych i
produkują białka terapeutyczne

Terapeutyczna angiogeneza

• Implantacja komórek macierzystych szpiku (BMI) w celu pobudzania

angiogenezy w niedokrwionych obszarach mięśnia sercowego lub
kończyn

Komórki macierzyste wydzielają czynniki proangiogenne: bFGF czy

VEGF i są prekursorami komórek śródbłonka, z których powstają
naczynia włosowate

• Porowate kapsuły polimerowe zawierające zmodyfikowane

genetycznie komórki uwalniające w sposób ciągły białka
terapeutyczne (ochrona przed odpowiedzią immunologiczną)

Terapeutyczna angiogeneza

Terapia genowa z użyciem VEGF

•

VEGF

– vascular endothelial growth factor (najwięcej protokołów

badań klinicznych)

•

Pobudza proliferację i migrację komórek śródbłonka, hamuje ich

apoptozę oraz wpływa na utrzymanie ciągłości warstwy śródbłonka w
naczyniach

•

Konieczny do tego jest fizjologiczny poziom ekspresji genu

kodujacego VEGF i prawidłowe funkcjonowanie receptorów Flt-1 oraz
KDR/flk-1

•

Podany do mięśnia sercowego zwiększa perfuzję, zmniejsza ból

•

Podany domięśniowo przy krytycznym niedokrwieniu kończyn

zwiększa przepływ krwi, zmniejsza objawy przeciwbólowe, może
zapobiec amputacji

Terapia genowa HGF

• Proangiogenny czynnik wzrostu hepatocytów (hepatocyte

growth factor, HGF) wprowadzano do niedokrwiennej
kończyny szczura i królika jako nagi DNA.

• Wzrastała ilość receptorów c-Met dla czynnika HGF w

niedotlenowanych tkankach (=> w tkankach prawidłowych
brak indukcji angiogenezy)

• Efekt terapeutyczny udokumentowano badaniami przepływu

metodą Dopplera, pomiarem gęstości nowo powstałych
naczyń (mikroskopowe badanie preparatów
histochemicznych) oraz angiograficznie

Hamowanie restenozy i miażdżycy naczyń

a)

Za pomocą wirusów-

geny inhibitorów metaloproteaz TIMP-1 i TIMP-2.

Zapobiega to aktywności metaloproteaz i migracji komórek mięśni

gładkich

b)

Antysensy

przeciwko genom regulującym proces proliferacji komórek

np. przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu E2F (regulacja ekspresji
genów cyklu komórkowego). Hamuje to proliferację komórek mięśni
gładkich, ściany naczyń i przerost „neointimy”

c)

Wprowadzenie genów samobójczych

do komórek mięśni gładkich ścian

naczyń, np. genu tk wirusa opryszczki HSV) za pomocą adenowirusów.
Uwrażliwia to komórki na gancyklowir. Zmniejsza to doświadczalną
restenozę o 50%.

d)

Deoksyrybozymy

(katalityczne DNA): np. w hamowaniu ekspresji genu

egr-

1 na poziomie mRNA. Podawanie przed balonikowaniem do komórek

mięśni gładkich zapobiega zamykaniu światła naczyń po zabiegu

Podstawowe problemy terapii genowej

• Brak wydajnych bezpiecznych metod wprowadzania

genów

• Niska swoistość transdukcyjna i transkrypcyjna

wprowadzania genów

• Krótkotrwała ekspresja genów

• Efekty uboczne terapii (immunostymulacja)

Kierunki rozwoju terapii genowej

Bardziej wydajne i swoiste metody wprowadzania genów, m.in. za
pomocą modyfikowanych wirusów, czy syntezowanych nośników
niewirusowych;



Opracowanie nowych konstruktów genetycznych i ulepszenie
systemu ekspresji genów

 Kojarzenie terapii genowej z innymi metodami np. w leczeniu

nowotworów z radioterapią i chemioterapią

 Terapia wielogenowa

– synergizm działania białek terapeutycznych



Zastosowanie siRNA, nieimmunogennych plazmidów, systemów
ekspresji cytoplazmatycznej

W jaki sposób przebiega terapia genowa w czerniaku?

Pierwsze próby zaczęto od wprowadzenia genu (TNFα) do komórek
nowotworowych czerniaka.
TNF

α powodował obumieranie komórek guza –zahamowanie

procesu nowotworowego

Terapię uzupełniono wszczepianiem genów terapeutycznych do
limfocytów, które zazwyczaj naciekają guz.

Zmienione limfocyty powodowały zmniejszenie, a nawet całkowite
zniszczenie nowotworu, i nie dopuszczały do rozprzestrzeniania się.

W terapii czerniaka stosowano także szczepionki z użyciem

genetycznie zmodyfikowanych komórek czerniaka

, pobranych od

pacjenta.

Szczepionka miała wywoływać reakcję immunologiczną i zwiększać
odporność przeciwnowotworową, zmobilizować organizm do
zwalczenia procesu nowotworowego.

Na podstawie pierwszej fazy badań stwierdzono, że właściwie
zastosowana terapia genowa, tzw. przeciwczerniakowa szczepionka
genetycznie modyfikowana, jest całkowicie bezpieczna w stosowaniu.

Niestety na obecnym etapie badań i wiedzy próba leczenia
genami jest wprowadzana najczęściej wtedy, gdy mamy
pewność, że zawiodły inne metody leczenia.

Na razie mówimy o przedłużaniu życia. W tym znaczeniu jedynie
możemy mówić, że u części pacjentów ta terapia daje właściwe
rezultaty (pojedyncze przypadki).

Najbardziej zaawansowane są badania nad terapią
wykorzystującą

wektor adenowirusowy z genem p53

, w leczeniu

raka głowy i szyi.

Badania III fazy w USA weszły, w Chinach wektor taki został
oficjalnie zarejestrowany i dopuszczony do stosowania pod
handlową nazwą Gendicine

Idealna terapia genowa

Powinna być skuteczna i pozbawiona efektów ubocznych.

Łatwa w stosowaniu i tania.

Brak efektów ubocznych (nie ma terapii bez efektów ubocznych).

Istotnym ograniczeniem są olbrzymie koszty produkcji wektorów do
prób klinicznych.

Najważniejszym problemem jest jednak niezadowalająca skuteczność
terapii genowej.

Terapia genowa pozostaje jednak nadzieją medycyny.