Ćwiczenie nr 5

Regulacja ekspresji genów na przykładzie rozwoju bakteriofaga T4.
Prowadząca ćwiczenie: mgr Michalina Filipiak office A/236

Bakteriofag T4 należy do grupy fagów zjadliwych. Fagi zjadliwe są zdolne tylko do

cyklu litycznego, kończącego się zawsze lizą komórki gospodarza i uwolnieniem potomstwa
fagowego. Drugą grupę bakteriofagów stanowią fagi łagodne, które w zależności od
warunków wzrostu komórek gospodarza, mogą wybrać pomiędzy cyklem litycznym a cyklem
lizogenicznym, podczas którego dochodzi do integracji genomu faga z chromosomem
bakteryjnym w formie profaga. Profag jest przekazywany do komórek potomnych i w
określonych warunkach może rozpocząć cykl lityczny, prowadzący do lizy komórki
gospodarza.

Typowy cykl infekcyjny bakteriofaga T4 kończy się tzw. lizą od wewnątrz (LI, ang.

lysis from within), która prowadzi do uwolnienia od 100 do 200 fagów potomnych w 25-30
min po infekcji, jeśli bakterie są hodowane w 37°C w bogatej pożywce. W procesie tym biorą
udział dwa główne białka: holina T i endolizyna E o aktywności lizozymu. Endolizyna E
akumuluje się w cytoplazmie, natomiast holina T jest umiejscowiona w błonie wewnętrznej.
W odpowiednim momencie holina T oligomeryzuje, tworząc pory, przez które endolizyna E
przedostaje się do periplazmy i trawi ścianę komórkową. Powoduje to lizę komórki
gospodarza i uwolnienie potomstwa fagowego. Jeśli bakteriofag T4 zakazi bakterie, które
rosną bardzo wolno albo wcale, to hamuje swój cykl rozwojowy do momentu, aż komórki
bakteryjne zaczną się dzielić. Dopiero wtedy kontynuuje swój rozwój i następuje liza
komórek gospodarza. Mechanizm ten nazwano pseudolizogenią. Jest to jeden z procesów
umożliwiających opóźnienie i dostosowanie czasu lizy do warunków wzrostu komórek
gospodarza.

Kolejnym przystosowaniem jest inhibicja lizy (LIN, lysis inhibition). Polega ona na

tym, że jeśli po 3 minutach (lub więcej) od rozpoczęcia cyklu rozwojowego faga T4, dojdzie
do adsorpcji kolejnych fagów T4 do tej samej bakterii, następuje przesunięcie momentu lizy
nawet o kilka godzin. W tym czasie tworzą się potomne cząstki fagowe, co powoduje, oprócz
opóźnienia lizy w czasie również wzrost plonu fagowego z 100-200 wirionów do nawet 1000.
Do indukcji LIN niezbędne jest funkcjonalne białko RI, będące antyholiną, które
oddziaływuje bezpośrednio z holiną T, uniemożliwiając otwarcie porów w błonie
wewnętrznej i przejście endolizyny E z cytoplazmy do periplazmy, dzięki czemu chroni
ś

cianę komórkową przed trawieniem i blokuje lizę. Białko RI zbudowane jest z 97

aminokwasów, a jego masa wynosi 11,1 kDa. Uważa się, ze domena N-końcowa zawiera 16
aminokwasowy peptyd sygnałowy, odpowiadający za transport RI do periplazmy, który
prawdopodobnie ulega odcięciu między 24 a 25 aminokwasem. Domena C-końcowa pełni
funkcję antyholiny. Kolejnym białkiem biorącym udział w LIN jest białko RIII o masie 9,3
kDa, zbudowane z 82 aminokwasów. Występuje w cytoplazmie i prawdopodobnie stabilizuje
oddziaływania białka RI z holiną T przez oddziaływanie z cytoplazmatyczną N-końcową
domeną holiny T. Transkrypcja genów rI (koduje białko RI) oraz rIII (koduje białko RIII)
zachodzi z wczesnych i późnych promotorów, genu t (koduje holinę T) z promotora późnego,
a genu e (koduje endolizynę E)- mimo obecności promotora wczesnego i późnego- efektywna
translacja zachodzi tylko na bazie transkryptu z promotora późnego. Z wczesnego transkryptu
nie dochodzi do translacji, ponieważ jest zablokowana przez strukturę szpilki, powstającą na
końcu 5’ tego transkryptu.

Nadal nieznany jest sygnał powodujący inhibicję lizy, jak i sygnał powodujący

synchroniczny zanik LIN (LIN collapse), co prowadzi do równoczesnej lizy zakażonych
komórek bakteryjnych.

Mechanizm LIN chroni potomstwo fagowe przed zakażeniem bakterii już

zainfekowanych innym fagiem T4. Adsorpcja nowego bakteriofaga T4 do powierzchni
zainfekowanej komórki jest dla niego samobójstwem, ponieważ jego DNA jest uwalniany do
przestrzeni periplazmatycznej i tam degradowany przez nukleazy.

Jest to strategia ekologiczna, przypominająca „zmysł zagęszczenia” bakterii, która

daje najkorzystniejszy efekt dla całej populacji bakteriofagów T4, szczególnie w warunkach
naturalnego występowania, tj. w jelicie ssaków, gdzie prawdopodobieństwo adsorpcji do już
zakażonej bakterii jest duże.

Doświadczenie będzie polegało na porównaniu profilu lizy i określeniu czasu lizy

hodowli bakteryjnej szczepu E. coli MG1655 po zakażeniu fagiem T4D (wt) lub T4rI (fag T4
z mutacja w genie rI).

Materiały:
- szczep E. coli MG1655, - hodowla nocna
- lizat faga T4D (wt) i T4rI (mutacja w genie rI) ( przygotowany wcześniej),
- pożywka LB,

Wyposażenie:
- wytrząsarka
- spektrofotometr
- stoper

Wykonanie:

1.

Odmłodzić hodowlę nocną szczepu MG1655 w 30 ml pożywki LB (1:50)

2.

Hodować z wytrząsaniem w 37°C do OD

600

=0,1

3.

Dodać do hodowli bakteryjnej lizat faga T4D lub T4rI do m.o.i.=1 i włączyć stoper.

4.

Co 10 min przez 2h pobierać 1ml hodowli i mierzyć gęstość optyczną bakterii przy
OD

600

. Uzyskane wartości zapisać i umieścić na wykresie.

Zagadnienia do samodzielnego przygotowania:

1.

Budowa faga T4 i funkcje poszczególnych elementów budowy.

2.

Cechy charakterystyczne genomu faga T4 i jego replikacji.

3.

Gospodarze faga T4.

4.

Rodzaje transkryptów faga T4 i modyfikacje polimerazy RNA E. coli.

5.

Etapy infekcji bakterii przez faga T4.

6.

Przebieg cyklu litycznego.

7.

Definicje pojęć: inhibicja lizy, liza od wewnątrz, liza z zewnątrz, pseudolizogenia,
lizogenia.

8.

Liczenia miana faga (PFU- plague forming units) oraz M.O.I (multiplicity of
infection).

9.

Zadania obliczeniowe, ile komórek bakteryjnych znajduje się w hodowli o OD

600

=0,1

w objętości 1ml?

Literatura obowiązkowa:

1.

Figura Grzegorz, Budynek Paulina, Dąbrowska Krystyna, Bakteriofag T4:
molekularne aspekty infekcji komórki bakteryjnej, rola białek kapsydowych.

Publikacja jest dostępna na stronie: http://www.phmd.pl/fulltxt.php?ICID=910880

Proszę o przyniesienie kalkulatorów oraz papieru milimetrowego. Korzystanie
z kalkulatorów w telefonie komórkowym będzie zabronione. Przypominam również
o konieczności posiadania fartucha.