Medycyna Wet. 2006, 62 (5)

563

Praca oryginalna

Original paper

Zapalenie wymienia nale¿y do najbardziej kosztow-

nych i trudnych do opanowania metodami weteryna-

ryjnymi chorób byd³a mlecznego. Stwierdzono gene-

tyczne ró¿nice w podatnoœci krów na tê chorobê (5).

Mechanizmy ró¿nic w genetycznej sk³onnoœci do za-

chorowania nie zosta³y jeszcze do koñca poznane.

Przypuszcza siê, ¿e wystêpowanie tej choroby zale¿y

od wielu genów. Identyfikacja tych genów pozwoli³a-

by na zwiêkszenie efektywnoœci selekcji byd³a mlecz-

nego w kierunku poprawy zdrowia wymienia poprzez

prowadzenie selekcji wspomaganej markerami gene-

tycznymi. Poszukiwanie markerów genetycznych obej-

muje, miêdzy innymi, poszukiwanie genów, których

produkty wp³ywaj¹ bezpoœrednio na poziom badanej

cechy (6).

Do identyfikacji markera genetycznego mastitis

konieczne jest wykorzystanie informacji o funkcji genu

w organizmie. Wa¿ne jest równie¿ znalezienie powi¹-

zania pomiêdzy ró¿nymi allelami genu a wystêpowa-

niem choroby.

Geny g³ównego uk³adu zgodnoœci tkankowej (MHC)

odgrywaj¹ wa¿n¹ rolê w regulacji odpowiedzi immu-

nologicznej. Z tego powodu zainteresowano siê zwi¹z-

kiem pomiêdzy genami BoLA klasy II a wystêpowa-

niem mastitis u krów (3, 10-12). Produkty genów

BoLA klasy II odgrywaj¹ wa¿n¹ rolê podczas prezen-

tacji antygenu limfocytom T oraz wp³ywaj¹ na liczbê

i rodzaj komórek T (1). Spoœród genów BoLA klasy II

najbardziej obiecuj¹cy wydaje siê zwi¹zek genu BoLA-

-DRB3 z zapaleniem wymienia (7). Gen ten u byd³a

zlokalizowano na 23 chromosomie. W genie BoLA-

-DRB3 ekson 2 jest wa¿ny funkcjonalnie, poniewa¿

koduje miejsce wi¹zania peptydów i w zwi¹zku z tym

wp³ywa na mo¿liwoœæ immunologicznego rozpozna-

wania obcych bia³ek. Dotychczasowe badania wska-

zuj¹ na powi¹zanie miejsc polimorficznych w eksonie

2 tego genu z wystêpowaniem stanu zapalnego wy-

mienia u krów (7).

Badania genów warunkuj¹cych podatnoœæ na ma-

stitis dotycz¹ równie¿ polimorfizmu genu laktofery-

ny. Laktoferyna jest bia³kiem wielofunkcyjnym, ale

jego g³ównym zadaniem jest zapobieganie infekcjom

bakteryjnym. Jest to powodowane prawdopodobnie

du¿ym powinowactwem laktoferyny do jonów Fe

3+

,

czerpaniem ich ze œrodowiska i pozbawieniem bakte-

rii ¿elaza koniecznego do ich wzrostu (2). Gen lakto-

feryny wystêpuje w chromosomie 22 u byd³a i jest

zbudowany z 17 eksonów. Mimo ¿e mechanizm dzia-

³ania laktoferyny nie zosta³ jeszcze do koñca poznany,

wiadomo, ¿e poziom tego bia³ka wzrasta znacznie

podczas infekcji gruczo³u mlekowego. Prowadzone

by³y prace nad poszukiwaniem powi¹zania pomiêdzy

polimorfizmem genu laktoferyny a wystêpowaniem

mastitis u krów (4, 8). Z powodu wa¿nej roli genów

BoLA-DRB3 i laktoferyny w reakcji na infekcje bak-

teryjne, geny te zosta³y w³¹czone do badañ, których

celem dalekosiê¿nym jest identyfikacja markerów ge-

netycznych mastitis. Badanie markerów genetycznych

obejmuje równie¿ okreœlenie wspó³dzia³ania genów

BoLA-DRB3 i laktoferyny na wystêpowanie mastitis.

Ocena wp³ywu polimorfizmu wybranych genów

na wystêpowanie mastitis u krów*

)

GRA¯YNA SENDER, AGNIESZKA KORWIN-KOSSAKOWSKA,

KARIMA GALAL ABDEL HAMEID, BEATA PRUSAK

Instytut Genetyki i Hodowli Zwierz¹t PAN, 05-552 Wólka Kosowska, Jastrzêbiec

Sender G., Korwin-Kossakowska A., Hameid K. G. A., Prusak B.

Association of the polymorphism of some genes with the occurrence of mastitis in cattle

Summary

The purpose of this study was to investigate the association of the lactoferrin alleles and interaction of

BoLA-DRB3 and lactoferrin alleles with the somatic cell count in cow milk. The polymorphism of the lactoferrin

gene was identified in blood samples collected from 125 cows. Udder health was determined by test - day milk

somatic cell count. Lactoferrin genotype BB was significantly (p<0.01) associated with a decrease of the

somatic cell count in cow milk. Due to the small sample the relationship between interaction of BB lactoferrin

genotype and BoLA-DRB3*16 with somatic cell count were not established.

Keywords: mastitis, genetic markers, lactoferrin gene

*

)

Badania finansowane z grantu KBN 2PO6D03026.

Medycyna Wet. 2006, 62 (5)

564

Celem badañ by³o okreœlenie wp³ywu polimorfizmu

genu laktoferyny i interakcji genotypu BoLA-DRB3

i laktoferyny na liczbê komórek somatycznych w mle-

ku krów.

Materia³ i metody

Badaniami objêto 125 krów rasy holsztyñskiej utrzymy-

wanych w oborze nale¿¹cej do Instytutu Genetyki i Ho-

dowli Zwierz¹t PAN w Jastrzêbcu. Do okreœlania stanu

zdrowia wymienia pos³u¿y³y wyniki comiesiêcznych ba-

dañ liczby komórek somatycznych (wskaŸnik zapalenia

wymienia) oznaczone w próbkach mleka pobieranych

w czasie kontroli u¿ytkowoœci mlecznej badanych zwie-

rz¹t. Ocenê stanu zdrowia wymienia przeprowadzono na

podstawie nie mniej ni¿ piêciu oznaczeñ liczby komórek

somatycznych w próbkach mleka w czasie co najmniej jed-

nej laktacji.

Próbki krwi pobrane od krów pos³u¿y³y do okreœlenia

polimorfizmu genów BoLA-DRB3 i laktoferyny. DNA izo-

lowano z leukocytów krwi wykorzystuj¹c gotowy zestaw

do izolacji DNA Wizard Genomic DNA Purification Kit

(Promega). Do okreœlenia polimorfizmu genu BoLA-DRB3

wykorzystano metodê MPT-PCR (multi-primer target PCR)

(7). Polimorfizm genu laktoferyny okreœlano metod¹ RFLP-

-PCR. Do amplifikacji fragmentu DNA o d³ugoœci 301 par

zasad wykorzystano primery dobrane we wczeœniejszych

badaniach (9). Otrzymany fragment DNA trawiono enzy-

mem restrykcyjnym EcoR1. Miejsce restrykcyjne znajdo-

wa³o siê w intronie 6 tego genu. W wyniku trawienia enzy-

mem restrykcyjnym otrzymano dwa allele. W przypadku

nie wystêpowania miejsca restrykcyjnego otrzymano allel

A o d³ugoœci 301 par zasad. Natomiast allel B by³ trawiony

na dwa fragmenty o d³ugoœci 201 i 100 par zasad (9).

Opracowanie statystyczne materia³u mia³o na celu wy-

kazanie zale¿noœci pomiêdzy genotypem genu laktoferyny

a liczb¹ komórek somatycznych. Przeanalizowano równie¿

zale¿noœæ pomiêdzy interakcj¹ genotypu BoLA-DRB3

i laktoferyny a stanem zdrowia gruczo³u mlekowego mie-

rzonego liczb¹ komórek somatycznych. Do obliczeñ wy-

korzystano procedurê GLM pakietu SAS. W modelu sta-

tystycznym s³u¿¹cym do analizy logarytmu liczby komó-

rek somatycznych w mleku badanych krów uwzglêdniono:

genotyp badanych zwierz¹t, powtarzalnoœæ wyników do-

tycz¹cych zwierzêcia zagnie¿d¿onego w genotypie (lub

interakcji genotypów BoLA-DRB3 i laktoferyny), numer

laktacji, rok i sezon badania, dzieñ laktacji i wydajnoœæ mle-

ka. Wp³yw dnia laktacji i wydajnoœci mleka na liczbê ko-

mórek somatycznych uwzglêdniono w modelu jako regres-

jê. Istotnoœæ ró¿nic pomiêdzy poziomem liczby komórek

somatycznych w grupach krów reprezentuj¹cych ró¿ne ge-

notypy laktoferyny i ró¿ne interakcje genotypów BoLA-

-DRB3 i laktoferyny wykonano za pomoc¹ testu Duncana.

W modelu nie uwzglêdniono wp³ywu buhaja, poniewa¿

badane zwierzêta pochodzi³y po 54 ojcach (œrednio 2,5 córki

na buhaja). W przypadku takiej struktury populacji mo¿na

za³o¿yæ, ¿e wp³yw genotypu ojca by³ losowy.

Wyniki i omówienie

W badanej populacji krów stwierdzono czêstoœæ al-

lelu A laktoferyny wynosz¹c¹ 80% natomiast allelu B

20%. Czêstoœci alleli laktoferyny by³y zbli¿one do

podawanych wczeœniej przez innych autorów (9).

W tab. 1 przedstawiono liczbê komórek somatycz-

nych w zale¿noœci od genotypu laktoferyny. Najni¿-

sz¹ liczbê komórek somatycznych stwierdzono w gru-

pie krów z genotypem BB. Grupa ta ró¿ni³a siê istot-

nie (p < 0,01) od grupy krów z allelem AA oraz krów

heterozygotycznych (tab. 1). Najwy¿sz¹ liczb¹ komó-

rek somatycznych charakteryzowa³y siê krowy o ge-

notypie AB laktoferyny i ró¿ni³y siê istotnie (p < 0,01)

od zwierz¹t z pozosta³ymi genotypami. Niestety, gru-

pa osobników z korzystnym pod wzglêdem wystêpo-

wania mastitis allelem B by³a nieliczna i dlatego ba-

dania te wymagaj¹ potwierdzenia na wiêkszym mate-

riale. Badany polimorfizm wystêpowa³ w intronie

6 genu laktoferyny. Zmiana ta nie mia³a charakteru

funkcjonalnego i nie przek³ada³a siê na sekwencjê ko-

dowanych bia³ek. Jednak¿e omawiany polimorfizm

mo¿e byæ cennym markerem liczby komórek soma-

tycznych w mleku. W dotychczasowych badaniach nie

znaleziono istotnych zale¿noœci pomiêdzy polimorfi-

zmem genu laktoferyny wystêpuj¹cym w eksonach

a wystêpowaniem mastitis. Autorzy przypuszczaj¹, ¿e

mog³o to byæ spowodowane zbyt ma³¹ liczb¹ bada-

nych zwierz¹t (4). Liczebnoœæ badanych zwierz¹t (4)

by³a nieco mniejsza ni¿ w naszych badaniach, a jed-

nak poszukiwano zale¿noœci pomiêdzy polimorfizmem

genu laktoferyny a wystêpowaniem mastitis. W œwiet-

le innych wyników (4) tym cenniejsze wydaje siê osza-

cowanie istotnych ró¿nic liczby komórek somatycz-

nych w zale¿noœci od genotypu laktoferyny w tak nie-

wielkiej populacji.

We wczeœniejszych badaniach genów determinuj¹-

cych podatnoœæ na zapalenie gruczo³u mlekowego,

Tab. 1. Zale¿noœæ pomiêdzy liczb¹ komórek somatycznych

a genotypem laktoferyny (–x ± se)

Objaœnienie: a, b, c – œrednie oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹

siê istotnie przy p £ 0,01

y

n

y

r

e

f

o

t

k

a

l

p

y

t

o

n

e

G

n

)

g

o

l(

h

c

y

n

z

c

y

t

a

m

o

s

k

e

r

ó

m

o

k

a

b

z

c

i

L

A

A

3

8

6

7

,

5

a

4

4

,

0

±

B

B

3

5

7

4

,

5

b

0

4

,

0

±

B

A

7

3

3

0

,

6

c

7

3

,

0

±

Objaœnienie: jak w tab. 1.

Tab. 2. Zale¿noœæ pomiêdzy liczb¹ komórek somatycznych

a interakcj¹ genotypów BoLA-DRB3 i laktoferyny (–x ± se)

y

p

y

t

o

n

e

g

e

n

a

r

b

y

W

y

n

y

r

e

f

o

t

k

a

l

i

3

B

R

D

-

A

L

o

B

n

h

c

y

n

z

c

y

t

a

m

o

s

k

e

r

ó

m

o

k

a

b

z

c

i

L

)

g

o

l(

n

/

6

1

A

A

8

1

0

6

,

5

a

0

5

,

0

±

n

/

3

2

A

A

3

1

8

4

,

6

b

3

5

,

0

±

n

/

n

A

A

0

5

0

6

,

5

a

8

3

,

0

±

n

/

6

1

B

A

0

1

9

5

,

5

a

4

4

,

0

±

n

/

3

2

B

A

1

5

5

8

,

6

c

2

4

,

0

±

n

/

n

B

A

9

1

4

9

,

5

d

2

3

,

0

±

Medycyna Wet. 2006, 62 (5)

565

przeprowadzonych na tym samym materiale, stwier-

dzono powi¹zanie allelu BoLA DRB3.2*16 z obni¿e-

niem liczby komórek somatycznych w mleku krów (7).

Podobne wyniki w stosunku do allelu BoLA

DRB3.2*16 uzyskali równie¿ inni autorzy (10-12).

Stwierdzili oni istotny spadek liczby komórek soma-

tycznych w grupie krów bêd¹cych nosicielkami tego

allelu. W zwi¹zku z tym w badanej populacji przeana-

lizowano wp³yw interakcji genotypów BoLA-DRB3

i laktoferyny na liczbê komórek somatycznych (tab. 2).

Krowy o genotypach AA i AB laktoferyny oraz bêd¹-

ce jednoczeœnie nosicielkami allelu BoLA-DRB3*16

charakteryzowa³y siê istotnie (p < 0,01) ni¿sz¹ liczb¹

komórek somatycznych w mleku w stosunku do krów

bêd¹cych nosicielkami allelu BoLA-DRB3*23. Rów-

nie¿ zwierzêta o genotypie laktoferyny AA nie bêd¹ce

nosicielkami alleli BoLA-DRB3*16 i 23 mia³y istot-

nie ni¿sz¹ liczbê komórek somatycznych w stosunku

do krów o genotypie laktoferyny AA bêd¹cych nosi-

cielkami allelu BoLA-DRB3*23. Z drugiej strony, kro-

wy o genotypie AB laktoferyny, u których nie wystê-

powa³ allelu BoLA-DRB3*16, charakteryzowa³y siê

istotnie (p < 0,01) wy¿sz¹ liczb¹ komórek somatycz-

nych. Z powodu zbyt ma³ej liczebnoœci nie wszystkie

warianty interakcji mog³y byæ przeanalizowane. Jed-

nak¿e najmniej korzystna z punktu widzenia wystê-

powania mastitis wydaje siê interakcja genotypów

BoLA-DRB3*23 i AB laktoferyny. Badanie interakcji

dwóch genów wykaza³o, ¿e na³o¿enie siê wp³ywu

dwóch genów pozwoli³oby wyeliminowaæ z populacji

osobniki najbardziej pogarszaj¹ce liczbê komórek so-

matycznych.

Podsumowuj¹c, najbardziej korzystnym z punktu

widzenia ograniczenia wystêpowania mastitis wydaje

siê genotyp BB laktoferyny, jednak¿e wystêpuje on

w populacji byd³a z nisk¹ czêstotliwoœci¹. Warto za-

znaczyæ, ¿e zwierzêta charakteryzuj¹ce siê tym geno-

typem nie by³y spokrewnione. Z powodu niskiej frek-

wencji genotypu BB laktoferyny niemo¿liwe by³o

uwzglêdnienie wp³ywu interakcji genotypu BB lakto-

feryny i BoLA-DRB3*16 na liczbê komórek somatycz-

nych w mleku krów. Oczekuje siê, ¿e osobniki, u któ-

rych wystêpuje ta interakcja, bêd¹ najmniej podatne

na zapalenie wymienia, wymaga to jednak dalszych

badañ.

Piœmiennictwo

1.Buczek J., Deptu³a W., Gliñski Z., Jarosz J., Stosik M., Wernicki A.: Immuno-

logia porównawcza i rozwojowa zwierz¹t. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa

2000, 277-345.

2.Fang W., Oliver S. P.: Identification of lactoferrin-binding proteins in bovine

mastitis-causing Streptococcus uberis. FEMS Microbiol. Lett. 1999, 176,

91-96.

3.Kelm S. C., Detilleux J. C., Freeman A. E., Kehrli M. E., Dietz A. B., Fox L. K.,

Butler J. E., Kasckovics I., Kelley D. H.: Genetic association between para-

meters of innate immunity and measures of mastitis in periparturient Hol-

stein cattle. J. Dairy Sci. 1997, 80, 1767-1775.

4.Li G., Zhang Y., Sun D., Li N.: Study on the polymorphism of bovine lacto-

ferrin gene and its relationship with mastitis. Animal Biotechnol. 2004, 15,

67-76.

5.Sender G.: Odpornoœæ na mastitis jako sk³adowa celu hodowlanego w pro-

gramach doskonalenia byd³a mlecznego. Prace Mat. Zoot. 2001, 12 zesz.

specj. 1-61.

6.Sender G., Korwin-Kossakowska A., Stepiñska U.: Wykorzystanie marke-

rów genetycznych w programie zwalczania mastitis. Medycyna Wet. 2003,

59, 853-856.

7.Sender G., Korwin-Kossakowska A., Gralak B.: Wp³yw polimorfizmu genu

BoLA-DRB3 na wystêpowanie mastitis u krów. Medycyna Wet. 2005, 61,

540-542.

8.Seyfert H. M., Henke M., Interthal H., Klussmann U., Koczan D., Natour S.,

Pusch W., Senft B., Steinhoff U. M., Tuckoricz A., Hobom G.: Defining can-

didate genes for mastitis resistance in cattle: the role of lactoferrin and lyso-

syme. J. Anim. Breed. Genet. 1996, 113, 269-276.

9.Seyfert H. M., Kuhn C.: Characterization on a first bovine lactoferrin gene

variant, based on an EcoRI polymorphism. Anim. Genet. 1994, 25, 54.

10.Sharif S., Mallard B. A., Sargeant J. M.: Presence of glutamine at position

74 of pocket 4 in the BoLA-DR antigen binding groove is associated with

occurrence of clinical mastitis caused by Staphylococcus species. Vet. Im-

munol. Immunopathol. 2000, 76, 231-238.

11.Sharif S., Mallard B. A., Wilkie B. N., Sargeant J. M., Scott H. M., Dek-

kers J. C. M., Leslie K. E.: Associations of the bovine major histocompatibi-

lity complex DRB3 (BoLA-DRB3) alleles with occurrence of disease and

milk somatic cell score in Canadian dairy cattle. Anim. Genet. 1998, 29,

185-193.

12.Starkenburg R. J., Hansen L. B., Kehrli M. E., Chester-Jones H.: Frequen-

cies and effects of alternative DRB3.2 alleles of bovine lymphocyte antigen

for Holsteins in milk selection and control lines. J. Dairy Sci. 1997, 80, 3411-

-3419.

Adres autora: doc. dr hab. Gra¿yna Sender, ul. G³ówna 26, 05-500 ¯a-

bieniec; e-mail: [e-mail]