Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Badanie składników kwasów nukleinowych

Cel ćwiczenia

Ćwiczenie ma na celu poznanie niektórych reakcji barwnych charakterystycznych dla

kwasów nukleinowych. Na ćwiczeniu zostaną wykonane reakcje pozwalające na wykrycie:

pentozy (reakcja Biala), deoksyrybozy (reakcja Dischego), tyminy i reszty kwasu

fosforowego.

Wprowadzenie

Kwasy nukleinowe są podstawowymi składnikami komórek zwierzęcych, roślinnych i

drobnoustrojów. Występują one w jądrze komórkowym, chloroplastach, mitochondriach oraz

w cytoplazmie. Wśród kwasów nukleinowych wyróżnia się: kwas deoksyrybonukleinowy

(DNA), który stanowi informację genetyczną we wszystkich organizmach żywych (wyjątek

wirusy RNA) oraz kwasy rybonukleinowe (RNA), które uczestniczą między innymi w

ekspresji genów i biosyntezie białka.

Kwasy nukleinowe są biopolimerami składającymi się z monomerów, zwanych

nukleotydami. Nukleotyd, składa się z: cząsteczki cukru – pentozy, zasady azotowej, oraz

reszty kwasu fosforowego. Cukier wchodzący w skład nukleotydu to: ryboza (β-D-ryboza),

charakterystyczna dla nukleotydów budujących kwasy rybonukleotydowe (RNA) lub

deoksyryboza (β-D-2-deoksyryboza) występująca w cząsteczkach DNA. Obie cząsteczki

cukru występują w formie hemiacetalowego pierścienia. Deoksyryboza różni się od rybozy

tylko brakiem grupy hydroksylowej przy drugim atomie węgla w pierścieniu (rys 1).

Rysunek 1. Wzory cukrów występujących w kwasach nukleinowych

.

Zasady azotowe występujące w kwasach nukleinowych są związkami organicznymi,

heterocyklicznymi o charakterze aromatycznym. Zasady te to pochodne purynowe: adenina i

guanina oraz pirymidynowe: cytozyna, tymina i uracyl. Zarówno w DNA, jak i RNA

występują zasady purynowe – adenina (6-aminopuryna) i guanina (2-amino-6-

hydroksypuryna) oraz pochodna pirymidynowa –

cytozyna

(2-hydroksy-4-

1

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

aminopirymidyna). Poza tym w RNA występuje pochodna pirymidynowa – uracyl (2,4-

dihydroksypirymidyna), a w DNA pochodna pirymidynowa – tymina (2,4-dihydroksy-5-

metylopirymidyna). Wzory tych zasad są podane na rysunku 2.

Rysunek 2. Wzory zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych.

Zasada azotowa połączona z pentozą wiązaniem N-glikozydowym tworzy nukleozyd.

Wyróżniamy następujące nukleozydy: adenozyna, guanozyna, cytydyna, tymidyna i urydyna.

Na rysunku 3 pokazano przykładowe nukleozydy.

Rysunek 3. Wzory nukleozydów występujących w kwasach nukleinowych.

Nukleotydy należą do grupy estrów fosforanowych. Są to estry nukleozydów i kwasu

fosforowego. Typowym miejscem estryfikacji jest grupa hydroksylowa przy piątym (C-5)

atomie węgla pentozy. Ze względu na rodzaj pentozy wyróżniamy dwa typy nukleotydów:

rybonukleotydy zawierają β-D-rybozę, a deoksyrybonukleotydy - β-D-2-deoksyrybozę.

Natomiast w zależności od rodzaju zasady azotowej istnieje 5 typów nukleotydów:

adenozyno-5'-monofosforan, guanozyno-5'-monofosforan, cytydyno-5'-monofosforan,

tymidyno-5'-monofosforan, urydyno-5'monofosforan. Na rysunku 4 pokazano przykładowe

nukleotydy.

2

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Rysunek 4. Wzory nukleotydów występujących w kwasach nukleinowych.

Sąsiednie nukleotydy w łańcuchach kwasów nukleinowych połączone są ze sobą

wiązaniem 3’,5’-fosfodiestrowym. W wiązaniu tym fosforan jest podwójnie zestryfikowany

grupami hydroksylowymi cukru. Pierwsze wiązanie estrowe utworzone jest pomiędzy resztą

fosforanową, a grupą hydroksylową przy C-3’ pentozy jednego nukleotydu. Drugie wiązanie

estrowe łączy ten sam fosforan z grupą hydroksylową przy C-5’ pentozy następnego

nukleotydu. Jest to kowalencyjne wiązanie reszty fosforanowej między grupą 5’-

hydroksylową jednej rybozy i 3’ hydroksylową następnej.

Wyróżnia się dwa sposoby badania składników kwasów nukleinowych. Pierwszy z

nich wymaga wcześniejszej hydrolizy tych związków do składników podstawowych, tj. do

kwasu fosforowego, pentozy oraz zasady azotowej. Hydrolizę przeprowadza się z udziałem

odczynników chemicznych lub enzymatycznie. Degradacja chemiczna zachodzi pod

wpływem kwasów i zasad. DNA i oligodeoksyrybonukleotydy ulegają degradacji tylko w

środowisku kwaśnym, natomiast RNA i oligorybonukleotydy zarówno w środowisku

kwaśnym, jak i zasadowym. W przypadku środowiska alkalicznego, hydrolizie ulegają

jedynie wiązania 3’,5’-fosfodiestrowe między fosforanem, a grupą hydroksylową. Ponieważ

hydroliza ta wymaga wytworzenia wiązania estrowego między fosforanem, a grupą

hydroksylową w pozycji 2’ cukru, ulega jej tylko RNA i oligorybonukleotydy. Chemicznie

najczęściej wykonuje się hydrolizę traktując kwasy nukleinowe mocnymi kwasami

mineralnymi np. 60 % kwasem nadchlorowym w temperaturze 100°C przez 1 godzinę. W

takich warunkach w pierwszej kolejności hydrolizie ulega wiązanie N-glikozydowe miedzy

puryną a pentozą. Uwalniane są wolne puryny i tzw. kwas apurynowy. Dalsza hydroliza

prowadzi do rozpadu wiązania estrowego między pentozą, a resztą kwasu fosforowego w

efekcie, czego uwalniany jest cukier i fosforan. Następnie hydrolizie ulegają wiązania

fosfodiestrowe między nukleotydami zawierającymi zasady pirymidynowe. Pełna hydroliza

3

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

prowadzi do rozpadu wiązań N-glikozydowych miedzy zasadami pirymidynowymi, a pentozą

i wiązań estrowych między tym cukrem a fosforanem.

Całkowitą hydrolizę kwasów nukleinowych można też przeprowadzić stosując

specyficzne enzymy. Nukleazy hydrolizują wiązanie 3’,5’-fosfodiestrowe uwalniając

pojedyncze nukleotydy, natomiast glikozydazy hydrolizują wiązania N-glikozydowe,

prowadząc do odłączenia zasad azotowych od szkieletu cukrowo-fosforanowego. Fosforan

może być uwolniony od reszty cukru przez działanie fosfataz, które hydrolizują wiązania

estrowe. Wspólne działanie wszystkich tych enzymów prowadzi do otrzymania mieszaniny

wolnych zasad azotowych (puryn i pirymidyn), fosforanu i cukru (β-D-rybozy lub β-D-2-

deoksyrybozy).

Reakcje barwne, wykonane na ćwiczeniach charakterystyczne dla hydrolizowanych

preparatów kwasów nukleinowych to reakcje pozwalające wykryć obecność fosforanów oraz

tyminy.

Drugi sposób badania składników kwasów nukleinowych związany jest z wykonaniem

reakcji barwnych bez konieczności ich hydrolizy. W niehydrolizowany preparacie kwasów

nukleinowych można wykryć pentozy dzięki reakcji Biala oraz obecność β-D-2-

deoksyrybozy wykonując reakcję Dischego.

Odczynniki

1.

Wodny roztwór kwasów nukleinowych.

2. 0,1 M NaOH

3.

60% w/o HClO

4

4. Odczynnik Biala

5. 1% w/o roztwór difenyloaminy

6.

10,6% w/o roztwór molibdenianu amonu

7. 5 M NaOH

8.

1,1% w/o Na

2

CO

3

9. Odczynnik diazowy

10. 3 M NaOH

11.

20% w/o roztwór hydroksyloaminy.

12.

96% w/o alkohol etylowy skażony 3% w/o acetonem.

4

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Wykonanie

Wszystkie barwne reakcje studenci wykonują na ćwiczeniach 4 godzinnych

indywidualnie, na ćwiczeniach 3 godzinnych wykonują parami. Natomiast wytrącanie

etanolem kwasów nukleinowych z roztworu wodnego oraz ich hydrolizę kwaśną w grupach

czteroosobowych.

1. Wytrącanie etanolem kwasów nukleinowych z roztworu wodnego.

Do cylindra o objętości 100 ml zawierającego 20 ml wodnego roztworu kwasów

nukleinowych (1) został wlany po bagietce alkohol etylowy (12). Wytrącony w tych

warunkach osad kwasów nukleinowych należy nawinąć na bagietkę, nadmiar alkoholu

usunąć, przyciskając bagietkę z nawiniętym osadem do ścianki cylindra. Delikatnie obracając

bagietkę rozpuścić preparat kwasów nukleinowych w 3 ml 0,1 M NaOH (2). Tak otrzymany

preparat kwasów nukleinowych podzielić na dwie części. Do szklanej probówki odpipetować

1 ml kwasów nukleinowych i dodać 4 ml 0,1 M NaOH (2). Otrzymany w ten sposób

rozcieńczony preparat zostanie wykorzystany do przeprowadzenia reakcji Biala i reakcji

Dischego. Pozostałą część preparatu wykorzystać do hydrolizy.

2. Hydroliza kwasów nukleinowych.

Do probówki zawierającej 2 ml roztworu kwasów nukleinowych w 0,1 M NaOH dodać 2 ml

HClO

4

(3) (hydrolizat, próba pełna). Do drugiej probówki odpipetować 2 ml 0,1 M NaOH (2)

i 2 ml HClO

4

(3) (próba odczynnikowa). Zawartość obu probówek dokładnie wymieszać.

Następnie obie probówki inkubować we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę, do probówek

włożyć chłodniczki, które zapobiegają parowaniu zawartości probówek. Po zakończonej

hydrolizie do czystej probówki odpipetować 2 ml hydrolizatu, a do kolejnej probówki 2 ml

roztworu próby odczynnikowej, obie próby zobojętnić dodając 2 ml 5M NaOH (7). Zawartość

obu probówek dokładnie wymieszać. Otrzymane zobojętnione roztwory wykorzystać do

wykonywania reakcji na obecność tyminy. Do pozostałych niezobojętnionych 2 ml

hydrolizatu i 2 ml próby odczynnikowej dodać po 4 ml wody. Otrzymane w ten sposób

zhydrolizowane, kwaśne roztwory wykorzystać do wykonania reakcji na obecność kwasu

fosforowego.

3. Reakcje wykonywane na preparacie DNA niehydrolizowanym.

a. Reakcja charakterystyczna dla pentoz – reakcja Biala.

W reakcji Biala pentozy połączone z zasadami purynowymi występujące w nukleotydach

podczas ogrzewania z odczynnikiem Biala przekształcają się w furfural. Powstały furfural

5

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

tworzy z orcyną w obecności jonów Fe

3+

kompleks o trwałej barwie zielonej (rys. 5). W tych

warunkach β-D-2-deoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej od rybozy.

Rysunek 5. Reakcja Biala.

Do dwóch probówek odmierzyć po 2,5 ml odczynnika Biala (4) i wstawić do wrzącej łaźni

wodnej na 5 minut. Następnie do jednej probówki dodać 0,5 ml rozcieńczonego preparatu

kwasów nukleinowych (próba pełna), do drugiej probówki 0,5 ml 0,1-M NaOH (2) (próba

odczynnikowa). Zawartość obu probówek dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni

wodnej na 5 minut.

b. Reakcja charakterystyczna dla β-D-2-deoksyrybozy – reakcja Dischego.

Reakcja Dischego pozwala odróżnić dwa typy kwasów nukleinowych (DNA i RNA). W

środowisku kwaśnym deoksyryboza tworzy z difenyloaminą produkt kondensacji o barwie

niebieskiej. Ta reakcja barwna jest konsekwencją powstania aldehydu ω-

hydroksylewulinowego z β-D-2-deoksyrybozy pod wpływem działania kwasu siarkowego i

octowego.

Rysunek 6. Reakcja Dischego.

6

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

Do jednej probówki odmierzyć 0,5 ml rozcieńczonego preparatu kwasów nukleinowych

(próba pełna), do drugiej probówki 0,5 ml 0,1 M NaOH (2) (próba odczynnikowa). Następnie

do obu probówek dodać po 2 ml roztworu difenyloaminy (5), dokładnie wymieszać i wstawić

do wrzącej łaźni wodnej na 5 min.

4. Reakcje wykonywane na preparacie hydrolizowanym DNA.

a. Wykrywanie tyminy.

Reakcja służąca do wykrywania tyminy, odróżniająca oba typy kwasów nukleinowych (DNA

i RNA), polega ona na wytworzeniu przez tyminę z diazową pochodną kwasu sulfanilowego

kompleksu o barwie czerwono-różowej, dodatek hydroksyloaminy, w środowisku zasadowym

wzmacnia barwę kompleksu.

Do dwóch probówek odmierzyć po 2,5 ml Na

2

CO

3

(8) i po 1 ml odczynnika diazowego (9),

zawartość obu probówek dokładnie wymieszać. Następnie do jednej z tych probówek dodać

0,5 ml zobojętnionego hydrolizatu kwasów nukleinowych (próba pełna), a do drugiej 0,5 ml

zobojętnionego roztworu próby odczynnikowej, zawartość obu probówek dokładnie

wymieszać. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do obu probówek dodać po 1

ml 3 M NaOH (10) i 2-3 krople hydroksyloaminy (11), zawartość probówek dokładnie

wymieszać i po 5 min obserwować zabarwienia roztworów w próbie pełnej i odczynnikowej.

b. Wykrywanie reszt fosforanowych.

Reakcja charakterystyczna dla fosforanów polega na łączeniu się molibdenianu amonu z

jonem fosforanowym, w wyniku czego powstaje żółty osad fosfomolibdenianu amonu.

Do jednej probówki odmierzyć 1 ml rozcieńczonego kwaśnego hydrolizatu kwasów

nukleinowych, a do drugiej 1 ml rozcieńczonego kwaśnego roztworu próby odczynnikowej.

Następnie do obu probówek dodać po 2 ml roztworu molidbenianu amonu (6), zawartość obu

probówek dokładnie wymieszać.

Opracowanie wyników

W sprawozdaniu należy podać otrzymane zabarwienia po przeprowadzeniu poszczególnych

reakcji oraz opisać zasady metod wykorzystywanych w tych reakcjach. Wyjaśnić celowość

wykonywania prób odczynnikowych.

Pytania

1. Napisać i podać wzory zasad purynowych i pirymidynowych. Podać ich nazwy

systematyczne.

7

Przedruk materiałów dydaktycznych w całości lub w części możliwy w celu przygotowania do ćwiczeń z biochemii realizowanych w Katedrze Biochemii, WRiB SGGW w Warszawie.

Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione.

2.

Co to jest nukleozyd, a co nukleotyd? Jakie charakterystyczne typy wiązań w nich

występują? Nazwać i przedstawić wzory nukleozydu i nukleotydu, zawierających

odpowiednio β-D-rybozę i β-D-2-deoksyrybozę.

3. Z jakich jednostek strukturalnych zbudowany jest kwas deoksyrybonukleinowy, a z

jakich kwas rybonukleinowy?

4.

Jak można hydrolizować kwasy nukleinowe i w jaki sposób była wykonana hydroliza

na ćwiczeniach?

5.

Jakie związki uwalniają się w wyniku całkowitej hydrolizy DNA, a jakie po hydrolizie

RNA?

6.

Jakie reakcje charakterystyczne są wspólne dla DNA i RNA, a które pozwalają

odróżnić te związki?

Literatura:

J. Marmur (1961) A procedure for the isolation of DNA from microorganisms. J Mol Biol 3: 208-218.

Z. Dische, E.Borenfreund (1951) A new spectrophotometric method for the detection and determination of keto

sugars and trioses. J. Biol. Chem. 192: 583-587.

Z. Dische, E. Landsberg (1957) A color reaction of pentose phosphate esters substituted in position 5.

Biochimica et Biophysica Acta 24: 193-195.

G Miller, R Golder, E Miller (1951) Determination of Pentoses. Effect of Varying Proportions of Components of

Bial's Color Reagent. Anal. Chem. 23: 903–905.

G. Hunter (1936) A test for thymine, with observations on the keto-enolic type of diazo-test. Biochem J. 30:

745–749.

8