ZASTOSOWANIE
KLINICZNE METOD
BIOLOGII MOLEKULARNEJ
W DIAGNOSTYCE
PREDYSPOZYCJI
NOWOTWOROWYCH

GEN BRCA1



Jest to pierwszy zidentyfikowany gen
supresorowy związany z dziedzicznymi
nowotworami sutka. Zlokalizowany jest na
długim ramieniu chromosomu 17 (17q21).

Gen BRCA1 posiada długość około 80 tysięcy
par zasad. Zawiera region kodujący, który
obejmuje 22 eksony o łącznej długości 5592
nukleotydów.



W genie BRCA1 zidentyfikowano dotychczas
około 170 różnych, rozproszonych w całej
długości genu mutacji predysponujących do
rozwoju nowotworu jajnika i sutka.

Lokalizacja genu BRCA1 zaznaczona
na zielono

dziedziczenie autosomalne dominujące

GEN SUPRESOROWY



Gen supresorowy- (Antyonkogen)  gen
działający hamująco na procesy proliferacji
komórkowej (geny bramkowe) bądź
stabilizująco na procesy utrzymujące
stabilność genetyczną komórki (geny
opiekuńcze).

GENY SUPRESOROWE – W
ZALEŻNOŚCI OD MECHANIZMU
DZIAŁANIA DZIELIMY NA DWIE GRUPY: 



geny „stróże genomu” 



geny „opiekunowie genomu”

-geny regulujące apoptozę
-geny regulujące naprawę DNA

BIAŁKO BRCA1



Białko BRCA1 o masie cząsteczkowej około
220 kD jest fosfoproteiną składającą się z
1863 aminokwasów. W pobliżu jego końca
aminowego znajduje się motyw palca
cynkowego, charakterystyczny dla białek
wiążących się z kwasami nukleinowymi.



Białko BRCA1 oraz BRCA2, kodowane
przez geny o tych samych nazwach, pełni
krytyczną rolę w naprawie DNA, kontroli
cyklu komórkowego i zachowaniu
stabilności materiału genetycznego. 

BUDOWA I FUNKCJA BIAŁKA BRCA1

JAKIE SĄ FUNKCJE BIAŁKA
BRCA1 ?



Gen zapewnia instrukcję dotyczącą powstawania białka
BRCA1, które:

- zapobiega przed wzrostem i podziałem w gwałtowny i
niekontrolowany sposób.
- jest zaangażowane w naprawianie uszkodzonego DNA.



W jądrze wielu typów normalnych komórek, białko
BRCA1



wchodzi w interakcję z kilkoma innymi białkami ( także
tymi wyprodukowanymi na bazie genów RAD51 i
BARD1) żeby naprawić uszkodzenia w DNA, które mogą
być spowodowane promieniowaniem, czynnikami
środowiska lub gdy chromosomy wymieniają się
materiałem genetycznym podczas przygotowywania do
podziału komórki.



Pełni rolę w utrzymaniu stabilności informacji
genetycznej w komórce.



reguluje także aktywność innych genów



odgrywa ważną rolę w rozwoju
embrionalnym

- oddziałuje z innymi białkami supresorowymi,
które także pełnią funkcję regulatorowe

MUTACJE



Mutacje w tym genie odpowiadają za autosomalny,
dominujący zespół dziedzicznej predyspozycji do
wcześnie rozwijających się nowotworów sutka i
jajnika.



Mutacje w tym genie występują w około 45% rodzin z
dziedzicznym zespołem raka sutka i ponad 80%
rodzin z dziedzicznym zespołem raka jajnika.



Oszacowano, że kobiety będące nosicielkami
dziedzicznej mutacji w genie BRCA1 są zagrożone
ryzykiem w wysokości ponad 80% zachorowania na
raka sutka przed ukończeniem 70 roku życia. Ciąży na
nich również zwiększone ryzyko zachorowania na raka
jajnika (44%).

PRZEZ MUTACJE GENU BRCA1

NASTEPUJE:

-

produkcja niekompletnego, krótszego, niefunkcjonalnego

białka BRCA1
- uniemożliwienie powstawania białka na podstawie genu
- zmiany aminokwasów prowadzące do powstania białka
o prawidłowej wielkości, lecz zaburzonej funkcji



usunięcie fragmentu DNA z genu

Do chwili obecnej zidentyfikowano ponad 1000
mutacji

Nagromadzenie tych efektów pozwala komórce

na

niekontrolowany wzrost i podział



W kilku populacjach wykryto mutacje, które występują ze
zwiększoną częstością u kobiet z rodzinną postacią raka
piersi

(tzw. founder mutations – mutacje związane z „efektem
założyciela”), co pozwala w znacznym stopniu przyspieszyć
identyfikację patogennej zmiany w genie BRCA1.



W populacji polskiej są to mutacje:
5382insC, C61G i 4153delA
(I etap diagnostyki), które stanowią około 90% wykrywanych
mutacji BRCA1.



Jednakże zgodnie ze wskazaniami EMQN, mając na
względzie heterogenność populacji europejskich, analizy
genu BRCA1 nie należy ograniczać jedynie do najczęściej
występujących mutacji. Uzupełnieniem podstawowej
diagnostyki u kobiet spełniających kryteria* badania genu
BRCA1, powinna być analiza całej sekwencji kodującej (+
sekwencje otaczające eksony, w których mogą wystąpić
mutacje zaburzające składanie RNA).



Nosicielstwo mutacji w genach BRCA1 i
BRCA2
nie jest jednoznaczne z wystąpieniem raka



Bardzo istotną rolę w patogenezie tej choroby
odgrywają także czynniki środowiskowe,
biochemiczne czy genetyczne.



Badanie genetyczne daje natomiast
informację o predyspozycji do rozwoju raka.

CZYNNIKI MUTAGENNE

• czynniki fizyczne

• czynniki chemiczne
• czynniki biologiczne

ETAPY TWORZENIA NOWOTWORÓW



Preinicjacja



Inicjacja



Promocja



Progresja

METODY WYKRYWANIA MUTACJI W

BRCA1



RFLP/PCR- wykrywanie mutacji za pomocą
enzymów restrykcyjnych w produktach PCR)



ASA - – allelo-specyficzna amplifikacja



PCR w czasie rzeczywistym



Sondy TaqMan



Sondy SimpleProbes



GENOTYPOWANIE SNaPshot



TEST PASKOWY

RFLP/PCR

ASA

DIAGNOSTYKA WIRUSA
HPV

BUDOWA WIRUSA

Ludzkie wirusy brodawczaka HPV należą do rodziny
Papillomaviridae. HPV mają nieosłonięty wirion o
symetrii ikosaedralnej i średnicy 55 nm. Kapsyd
zbudowany jest z dwóch białek strukturalnych: 360
kopii białka L1 i 12 kopii białka L2 zorganizowanych
w 72 kapsomery . Genom wszystkich wirusów
brodawczaka ma postać kolistej, kowalencyjnie
zamkniętej cząsteczki dsDNA, zbudowanej z około 8
tysięcy par zasad, zasocjowanej z histonami tworząc
strukturę podobną do chromatyny. Tylko jedna nić
DNA jest kodująca i zawiera do 8 nachodzących na
siebie otwartych ramek odczytu.

STRUKTURA I ORGANIZACJA
GENOMU WIRUSA BRODAWCZAKA
LUDZKIEGO

Materiał genetyczny ludzkich, jak i zwierzęcych wirusów
brodawczaka zorganizowany jest tak samo. W jego
genomie można wyróżnić trzy rejony: wczesny (E) –
kodujący białka niestrukturalne wirusa, późny (L)–
kodujący

białka

strukturalne

oraz

długi

rejon

regulatorowy (LCR lub NCR) (ang. Long Control Region,
Noncoding Region). Rejony E i L przedzielone są dwoma
miejscami poliadenylacji: wczesnym AE i późnym AL.
Najbardziej zachowawczy jest region kodujący białka E1 i
L1, natomiast najmniej – LCR. Rejon regulatorowy wirusa
(LCR) umieszczony jest pomiędzy otwartymi ramkami
odczytu L1 oraz E6 i zawiera około 1000 pz.
Zlokalizowany jest w nim promotor oraz liczne
sekwencje funkcjonujące jako wzmacniacze i wyciszacze
transkrypcji wirusowych genów.

Dotychczas zidentyfikowano około dwudziestu czynników
białkowych wiążących się z określonymi elementami sekwencji
w LCR. Późne geny L1 i L2 są odpowiedzialne za syntezę białek
otoczki, natomiast wczesny geny E1 i E2 odpowadają za
replikację genomu HPV. Onkoproteiny E5, E6 i E7 biorą udział w
procesie nowotworzenia (transformacji nowotworowej). Białko
E4 umożliwia interakcję z keratynami, co powoduje widoczny
efekt w postaci zmian brodawkowych.

Rys. 1. Schemat genomu wirusa brodawczaka: LCR – długi region
regulatorowy, L1-L2 – otwarte ramki odczytu kodujące białka
późne wirusa, E1-E7 – otwarte ramki odczytu kodujące białka
wczesne wirusa, A

L

– późne miejsca poliadenylacji, A

E

– wczesne

miejsca poliadenylacji, P

97

– wczesny promotor, P

670

– późny

promotor; numery zawarte w wewnętrznym okręgu wskazują
pozycję nukleoty-dów.

Nazwa

białka

Liczba

Masa

 

Waściwości

Funkcje

aminokwasów

cząsteczkowa

(kDa)

 

 

 

 

   

 

 

 

1

2

3

 

4

 

5  

 

 

 

   

 

E1

649

73

– ATP zale¿na

– inicjacja replikacji
wirusowego

 

 

 

helikaza DNA

DNA

 

 

 

 

 

   

– razem z białkiem E2
odpowia-

 

 

 

   

da za utrzymanie DNA
wirusowe-

 

 

 

   

go w postaci episomalnej

 

 

 

   

 

E2

365

41,8

– hydrofobowe

– razem z bialkiem E1

bierze

 

 

 

–

aktywator, represor

transkrypcji

udział w replikacji

wirusowego

 

 

 

   

DNA i jego segregacji

podczas po-

 

 

 

   

działów komórki

(asocjuje do mi-

 

 

 

   

totycznych

chromosomów)

 

 

 

   

– regulacja transkrypcji i

kontro-

 

 

 

   

la ekspresji genów

wczesnych E6

 

 

 

   

i E7

 

 

 

 

 

   

 

E4

95

10,5

–

zachowawczy koniec N

bogaty

– uwalnianie wirionów

potom-

 

 

 

w reszty leucynowe,

nych

 

 

 

 

 

–

może ulegaæ

fosforylacji

– destabilizacja włókien

keraty-

 

 

 

   

nowych w

komórce

 

 

 

 

   

– zdolne do zatrzymania

cyklu

 

 

 

   

komórkowego w fazie G2

 

 

 

 

 

 

Właściwości i funkcje białek wirusów HPV

E5

83

9,4

– hydrofobowe

– obniża poziom białek

MHC klasy

 

 

 

– onkogenne

I i II

 

 

 

 

 

– bia³ko b³onowe

– hamuje apoptozę

 

 

 

   

 

E6

158

19,2

–

aktywator

transkrypcji

– udzial w regulacji

replikacji wi-

 

 

 

– onkogenne

rusa

 

 

 

 

 

–

zawiera dwie domeny

o struk-

–

oddziałuje z

komórko

wym

 

 

 

turze palców
cynkowych

białkiem
P53

 

 

 

 

 

   

 

E7

98

11

–

aktywator

transkrypcji

– udział w regulacji

replikacji wi-

 

 

 

– onkogenne

rusa

 

 

 

 

 

–

zawiera jeden motyw

o struk-

–

oddziałuje z

komórko

wym

 

 

 

turze palca cynkowego

białkiem
pRB

 

 

 

 

 

   

 

L1

531

59,4

–

może ulegać
gliokozylacji

– główne białko
kapsydu

 

 

 

–

właœciwości
antygenowe

 

 

 

 

 

 

–

zachowawcza
sekwencja wśród

różnych typów
wirusów HPV

 

 

 

L2

473

50,6

–

może ulegać

fosforylacji

– białko kapsydu

 

 

 

–

właściwości
antygenowe

– rekrutacja
wirusowych geno-

 

 

 

–

może wiązać się z

DNA

mów w czasie składania

cząstek po-

 

 

 

–

zróżnicowana

sekwencja wśród

tomnych

 

 

 

różnych typów wirusów

HPV

– transport wirusowego

DNA do

 

 

 

   

jądra

JAKIE INFEKCJE POWODUJE?

Wirus brodawczaka ludzkiego - HPV (Human papilloma virus)
-Niektóre z typów HPV wywołują dość powszechne u kobiet i
mężczyzn łagodne zmiany skóry i błon śluzowych narządów
rozrodczych określane jako brodawki płciowe lub kłykciny
kończyste. Są to niewielkie płaskie lub wyniosłe zmiany, pojawiające
się pojedynczo lub w grupach w okolicach narządów rozrodczych i
odbytu, a nawet na udach. U kobiet kłykciny rozwijają się najczęściej
w pochwie, na sromie i szyjce macicy, u mężczyzn zaś w obrębie
penisa, moszny i krocza. W pewnych sytuacjach brodawki płciowe
mogą stanowić poważny problem zdrowotny, na ogół jednak są one
stosunkowo łatwe do leczenia i nie predysponują do rozwoju
nowotworów.

Jednakże niektóre z typów wirusów HPV - tzw. wysokiego ryzyka lub
inaczej onkogenne - przy długotrwałej, przetrwałej infekcji trwającej
wiele miesięcy lub lat mogą doprowadzić u kobiet do rozwoju raka
szyjki macicy. Najczęściej jest za to odpowiedzialny wirus typu 16,
rzadziej 18. W badaniach przesiewowych wskazuje się jednak, że
tylko z niewielu zmian spowodowanych infekcji HPV rozwija się
nowotwór. Do zakażenia dochodzi najczęściej w rejonie tarczy
szyjki.

Wykazano

także

związek

pomiędzy

infekcją

niektórymi typami HPV a rozwojem innych nowotworów, takich jak:
rak sromu i pochwy u kobiet oraz rak prącia u mężczyzn. Ostatnie
doniesienia naukowe wskazują na udział onkogennych wirusów HPV
w rozwoju m.in. niektórych nowotworów głowy i szyi, górnych dróg
oddechowych, a nawet płuc.

TYPY WIRUSA



o niskim poziomie ryzyka
onkologicznego (wirus HPV 6, 11, 42, 43,
44) - odpowiedzialne są one głównie za
niegroźne zmiany skórne



o wysokim poziomie ryzyka
onkologicznego (typu onkogennego)
wysokiego ryzyka (HPV 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 46, 51, 52, 56, 58, 67) - te typy
wirusa brodawczaka ludzkiego (wirus HPV)
znajdowane są głównie w komórkach raka
szyjki macicy.

Wirusy typu 16 i

18 uważane są za

najbardziej

kancerogenne

JAK GO WYKRYĆ?

Diagnostyka zakażeń wirusami HPV opiera

się na :



ocenie wyglądu zmian w przypadku
brodawek i kłykcin kończystych na
powierzchni skóry i błon śluzowych,



badaniu cytologicznym w przypadku infekcji
dróg rodnych,



badaniu materiału z biopsji pobranej w
obrębie zmiany lub, jeśli znajduje się ona w
rejonie szyjki macicy, na badaniu
kolposkopowym z biopsją obszaru
zmienionego,



potwierdzenie wirusowej etiologii choroby
jest możliwe dopiero po wykonaniu testów
molekularnych wykrywających DNA wirusa w
materiale pobranym od pacjenta.

TEST PAP



W przypadku infekcji dróg rodnych celem
przesiewowego badania cytologicznego jest
pobranie i zbadanie materiału ze strefy
przejściowej szyjki macicy (nabłonek
walcowaty kanału szyjki macicy przechodzi
tu w nabłonek płaski części pochwowej), w
której powstaje rak.

WYNIKI PAP OKREŚLAJĄ:



Stopień dysplazji komórek



Śródnabłonkową neoplazję szyjki macicy

Metody cytologiczne

mają szereg

niedoskonałości

Badanie DNA  HPV  metodą
PCR



Diagnostyka molekularna obecności wirusów
wysokoonkogennych i wybranych 
niskoonkogennych z możliwością identyfikacji
genotypów.



Czyli badanie kwasów nukleinowych wirusa
(DNA) techniką PCR



Test wykorzystuje amplifikację fragmentu
DNA za pomocą reakcji łańcuchowej
polimerazy(PCR) hybrydyzację ( połączenie 
DNA z tzw. primerem w wyniku czego
powstaje tzw. hybryda)  kwasów
nukleinowych do wykrywania konkretnych
genotypów wysokiego ryzyka



Następnie hybrydyzację ( połączenie  DNA z
tzw. primerem w wyniku czego powstaje tzw.
hybryda)  kwasów nukleinowych do
wykrywania konkretnych genotypów
wysokiego ryzyka.

  BADANIE MRNA HPV HR



W diagnostyce przewlekłego zakażenia
wirusem HPV pomocne jest nowe badanie
oparte na metodach diagnostyki
molekularnej, które polega na stwierdzeniu
obecności transkryptów mRNA onkogenów E6
i E7, wirusów wysokiego ryzyka.

BADANIE CYTOHISTOCHEMICZNE

Aby zwiększyć uleczalność tej choroby, a
zarazem uratować jak najwięcej kobiet, warto
poszerzyć diagnostykę zmian rakowych i
przedrakowych o nowoczesne testy p16/Ki-
67.

SZCZEPIONKA NA HPV

PROFILAKTYKA

 
Zapobieganie rozwojowi raka szyjki macicy możemy
podzielić na profilaktykę pierwotną i wtórną.
*Pierwotna profilaktyka obejmuje:
-szczepienia przeciwko wysokoonkogennym typom
HPV (typ 16, 18) oraz typom powodującym kłykciny
kończyste (typ 6, 11),
-ograniczenie liczby partnerów seksualnych,
-stosowanie prezerwatywy w sposób prawidłowy i
konsekwentny,



-unikanie

długotrwałego

stosowania

antykoncepcji hormonalnej,



-zaniechanie palenia papierosów.



*Wtórna profilaktyka obejmuje:



-regularne wykonywanie przesiewowych badań
cytologicznych (co 3 lata),



-leczenie stanów przednowotworowych.

SZCZEPIONKA

Obecnie do szczepienia przeciwko HPV najczęściej
stosowana jest czterowalentna szczepionka przeciwko
HPV 6, 11, 16 i 18. Szczepionka ta wydaje się być
skuteczna w zapobieganiu wystąpienia dysplazji
szyjki macicy dużego i średniego stopnia (CIN2/3),
rakowi szyjki macicy, zmian dysplastycznych sromu
dużego i średniego stopnia (VIN 2/3) oraz brodawek
zewnętrznych

narządów

płciowych

(kłykcin

kończystych).

KOMU?

Zaleca się rutynowe podawanie szczepionki
dziewczętom w wieku 11–12 lat, ale także
młodszym, począwszy od dziewiątego roku życia
oraz chłopcom w wieku 9–15 lat. Najkorzystniejsze
jest

szczepienie

kobiet/dziewczynek

przed

potencjalną ekspozycją na zakażenie HPV, a więc
przed inicjacją seksualną. Pełny cykl szczepień
obejmuje podanie domięśniowe trzech dawek
szczepionki (dwie kolejne dawki po 2 i po 6
miesiącach od dawki pierwszej). Szczepienia nie
wykonuje się u kobiet w ciąży.

JAKIE SZCZEPIONKI PRZECIWKO
WIRUSOWI BRODAWCZAKA LUDZKIEGO
SĄ DOSTĘPNE W POLSCE?

W Polsce dostępne są 2 różne szczepionki przeciwko
wirusom

brodawczaka

ludzkiego

w postaci

zastrzyków do podawania domięśniowego:

-

Cervarix przeciwko 2 typom HPV, rakotwórczym

wirusom: HPV16 i HPV18

-

Silgard przeciwko 4 typom HPV, rakotwórczym

wirusom HPV16 i HPV18 oraz HPV6 i HPV11
odpowiedzialnym za brodawki płciowe (kłykciny).