Seminarium 5.
KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ.
Aby zaszła reakcja biochemiczna, cząsteczki reagujące muszą posiadać odpowiedni zasób
energii swobodnej, czyli być w stanie aktywnym (osiągnąć stan przejściowy) by móc pokonać
barierę energetyczną reakcji. Bariera energetyczna jest to ilość energii potrzebna do
przeprowadzenia substratów w stan przejściowy, który jest niestabilną formą chemiczną
prowadzącą od substratów do produktów. Stan przejściowy ma w przebiegu reakcji
największą energię swobodną. Aktywne cząsteczki substratów przekształcając się w produkty
wydzielają energię równą różnicy energii swobodnej stanu aktywnego i energii swobodnej
produktów.
Reakcje egzoergiczne to takie, w których:
- energia swobodna produktów jest niższa niż energia swobodna substratów
- zachodzą spontanicznie
- szybkość zależy od energii aktywacji reakcji.
Im większa energia aktywacji tym wolniej reakcja zachodzi  w danym momencie
tylko kilka cząsteczek posiada wystarczającą energię, aby pokonać energetyczną barierę
aktywacji.
Szybkość reakcji można zwiększyć dostarczając dodatkowej energii (energia cieplna)
lub obniżając barierę energetyczną reakcji, czyli obniżając energię aktywacji. Substancje
obniżające energię aktywacji to katalizatory. W układach biologicznych mówimy o
biokatalizatorach, czyli enzymach.
W zasadzie wszystkie enzymy są białkami, ale również pewne RNA są czynne
katalitycznie. Enzymy zwiększają szybkość reakcji (przyspieszenie przynajmniej 106 raza)
przez obniżenie energii aktywacji. Obniżenie energii aktywacji wynika ze stabilizowania
stanu przejściowego poprzez zmianę warunków wiązaniowych miejsca aktywnego enzymu i
przestrzenne dopasowanie substratów. Enzymy są specyficzne ze względu na reakcję
i substrat.
Większość reakcji fizjologicznych ma bardzo wysoką energię aktywacji  bardzo
długi czas jest potrzebny na zajście tych reakcji. Enzymy obniżają energię aktywacji,
ponieważ dzielą przebieg reakcji na kilka etapów, z których każdy posiada niższą energię
aktywacji - przyspieszają dzięki temu osiągnięcie stanu równowagi reakcji. Pozwala to na
zajście reakcjom wewnątrzkomórkowym z dużą szybkością i w temperaturze fizjologicznej.
1
Szybkość reakcji enzymatycznej jest największa, gdy nie ma jeszcze produktu. W
nieobecności produktu nie może wystąpić efekt hamowania przez sprzężenie zwrotne
własnym produktem  co jest częstym zjawiskiem w enzymach - ani też reakcja nie może
przebiegać w kierunku odwrotnym, zasilanym przez produkt. Aby uniknąć wpływu
wymienionych zjawisk, pomiary prędkości początkowej (Vo) dokonuje się, zanim więcej niż
10% substratu przejdzie w produkt.
Szybkość reakcji enzymatycznej jest wyznacznikiem aktywności enzymu. Jest to
ubytek stęż. substratu [S] lub przyrost stęż. produktu [P] w jednostce czasu. Przy [E] = const.
i początkowym [S] = const. szybkość reakcji ma wartość stałą w przedziale czasu: 0  tx, a po
czasie tx maleje.
Dla danego stężenia enzymu ([E] = const.):
" przy niskim początkowym [S] szybkość reakcji jest proporcjonalna do [S]
" gdy wszystkie miejsca enzymu są wysycone, szybkość reakcji osiąga wartość Vmax, na
krzywej pojawia się plateau
" jeszcze większe początkowe [S] nie zmienia już szybkości reakcji enzymatycznej
" Vmax = kcat[E] = const.
" KM = const.
Model Michaelisa-Menten opisuje właściwości kinetyczne wielu enzymów (z wyjątkiem
enzymów allosterycznych).
Dla prostej reakcji: S P
" E + S ES E + P
Enzym (E) wiąże się z substratem (S) tworząc kompleks (ES), reakcję charakteryzuje stała
szybkości k1 . Kompleks może dysocjować do E i S ze stałą szybkością k2 lub przekształcać
się w produkt (P) ze stałą szybkością k3. Zakłada się, że reakcja odwrotna, przekształcania
E+P w ES jest do pominięcia.
Stała Michaelisa Km jest orientacyjną miarą powinowactwa enzymu do substratu (miarą
wiązalności substratu przez enzym) lub, mówiąc inaczej est miarą stabilności kompleksu ES,
stanowiąc iloraz sumy szybkości rozkładu kompleksu ES i szybkości jego powstawania. Im
większe powinowactwo wykazuje enzym, tym mniejsze jest stężenie substratu, przy którym
następuje wysycenie połowy centrów aktywnych enzymu, a więc tym mniejszą wartość
liczbową ma stała Km.
W związku z tym, że szybkość zależy od stężenia enzymu, wprowadzono pojęcie stałej
katalitycznej kcat, która określa maksymalną aktywność enzymu niezależnie od jego stężenia.
2
Stała katalityczna kcat określa liczbę cząsteczek substratu przetworzonych przez 1
miejsce katalityczne enzymu w określonej jednostce czasu, w warunkach, w których enzym
wykazuje maksymalną aktywność. Stała katalityczna kcat określa liczbowo pewną cechę
enzymu, a mianowicie jego zdolność do katalizowania reakcji chemicznych  cecha ta zwana
jest reaktywnością. O ile określenie powinowactwo lub wiązalność odpowiadają pierwszej
fazie reakcji enzymatycznej, to jest związaniu substratu przez enzym, o tyle reaktywność
dotyczy dalszych faz, tj. właściwego przebiegu reakcji i rozpadu kompleksu aktywnego
uwolnieniem produktu reakcji.
Podsumowując: aktywność enzymu przy danym stężeniu substratu zależy od dwu cech
charakteryzujących enzym: powinowactwa do substratu, które liczbowo określa w
przybliżeniu stała Michaelisa Km i jego reaktywności, którą liczbowo wyraża stała
katalityczna kcat. Stała katalityczna kcat związana ze sprawnością katalityczną enzymu -
mierzy tworzenie produktu (liczba obrotów). Liczba obrotów enzymu oznacza liczbę
cząsteczek substratu przekształconych w produkt reakcji na jednostkę czasu, w warunkach
pełnego wysycenia enzymu substratem. Jest ona równa stałej kinetycznej k3
Prędkość maksymalna (Vmax) związana jest z kcat i [E] zgodnie z równaniem:
Vmax = kcat[E].
Wysokie wartości kcat i Vmax świadczą o dużej szybkości katalizy. Iloraz kcat i Km jest
miarą wydajności enzymatycznej.
Szybkość reakcji zależy nie tylko od stężenia enzymu i substratu, lecz także od:
- temperatury,
- stężenia jonów wodorowych,
- potencjału redox
- obecności związków drobnocząsteczkowych (koenzymy, aktywatory, inhibitory)
- siły jonowej środowiska
Temperatura jest miarą energii kinetycznej cząsteczek w rozpatrywanym układzie.
Im niższa temperatura tym mniejsza energia kinetyczna układu.
Energia kinetyczna zderzeń tych cząsteczek może być przekształcona w energię
potencjalną cząsteczek. Gdy energia potencjalna cząsteczek jest wystarczająco wysoka,
cząsteczki mogą pokonać barierę aktywacji reakcji. Czyli, gdy temperatura układu rośnie to
więcej cząsteczek w jednostce czasu może pokonać barierę energii aktywacji i szybkość
reakcji może wzrosnąć.
3
Wzrost temperatury  wzrost liczby zderzeń miedzy miejscem aktywnym enzymu
a substratem w jednostce czasu, czyli może wzrosnąć szybkość reakcji. Dalszy wzrost zasobu
energii cieplnej układu powoduje wzrost energii drgań atomów w cząsteczce zerwanie
słabych wiązań chemicznych (istotnych w utrzymaniu trzeciorzędowej formy aktywnej
enzymu) - następuje termiczna denaturacja enzymu i jego inaktywacja. Optymalna
temperatura to taka, w której szybkość reakcji ma wartość maksymalną. Jest to wartość
właściwa dla danego enzymu oraz kształt krzywej zależności szybkości reakcji od
temperatury jest właściwy dla danego enzymu.
Dany enzym wykazuje aktywność w wąskim przedziale pH. Zmiana pH powoduje
spadek aktywności enzymu i zwolnienie szybkości reakcji. Enzym osiąga aktywność
maksymalną gdy grupy boczne aminokwasów mają właściwy ładunek i struktura
trzeciorzędowa enzymu jest właściwa. Wartość optymalnego pH odzwierciedla pH
środowiska, w którym ten enzym znaleziono.
Inhibiotor to cząsteczka działająca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia
szybkości reakcji katalitycznej przeprowadzanej przez dany enzym. Do inhibitorów enzymów
należą naturalne metabolity komórkowe, które poprzez hamowanie danego enzymu
kontrolują odpowiednie szlaki metaboliczne. Inhibitorami mogą być również substancje obce
dla organizmu np. toksyny i leki, które działają terapeutycznie lub letalnie. Wyróżnia się dwa
główne typy inhibicji: nieodwracalną i odwracalną (kompetycyjna, niekompetycyjna,
akompetycyjna). Inhibitor nieodwracalny wiąże się ściśle, często kowalencyjnie, z resztami
aminokwasów w miejscu aktywnym enzymu, trwale inaktywując enzym.
Inhibicja kompetycyjna
Inhibitor kompetycyjny jest podobny do substratu i oddziałuje z centrum aktywnym
enzymu  współzawodniczy z substratem o miejsce aktywne enzymu
- inhibitor oddziałuje tylko z wolną formą enzymu (przyłączenie substratu do enzymu
związanego z inhibitorem jest niemożliwe)
- w schemacie reakcji występują dwie formy związane enzymu, kompleksy ES i EI
- inhibitor kompetycyjny nie zmiena Vmax, ulega natomiast zmianie stała Michaelisa Km.
Powinowactwo enzymu do substratu zmniejsza się, gdyż pozorna stała Michaelisa Kmapp
wyznaczona w obecności inhibitora jest większa.
Inhibicję kompetycyjną można przezwyciężyć zwiększając stężenie substratu.
4
Inhibicja niekompetycyjna
Inhibitor nie wiąże się z miejscem aktywnym, lecz wiąże się z innym miejscem
enzymu wywołując zmianę kształtu enzymu, co z kolei zmienia kształt miejsca aktywnego.
Inhibitor niekompetycyjny wiążąc się z enzymem zmienia jego aktywność
katalityczną  nie ulega zmianie powinowactwo enzym do substratu (stała Michaelisa Km
pozostaje niezmieniona). Inhibitor może wiązać się z wolną cząsteczką enzymu lub z
kompleksem ES oraz substrat może wiązać się z wolnym enzymem lub z kompleksem EI.
Powstały kompleks ESI jest jednak nieaktywny katalitycznie, ponieważ obecność inhibitora
uniemożliwia uzyskanie przez centrum aktywne odpowiedniej konformacji, niezbędnej do
przeprowadzenia reakcji katalitycznej. Nawet przy najmniejszym stężeniu inhibitora
niekompetycyjnego i największym stężeniu substratu nie jest możliwe przeprowadzenie
wszystkich cząsteczek enzymu w aktywny katalitycznie kompleks z substratem, czyli jest
mniejsze stężenie ES i dlatego w obecności inhibitora niekompetycyjnego nigdy nie może
zostać osiągnięta wartość Vmax. Szybkość maksymalna w obecności inhibitora Vmaxapp zawsze
jest mniejsza od Vmax w jego nieobecności. Mniejsza wartość Vmaxapp nie jest spowodowana
zmniejszeniem stałej szybkości rozpadu ES z utworzeniem E+P. Wartość k3 pozostaje
niezmieniona. Inhibitor niekompetycyjny, wykluczając wytworzenia aktywnego katalitycznie
kompleksu pewnej części cząsteczek enzymu z substratem, zmniejsza w ten sposób stężenie
cząsteczek enzymu zdolnych do przeprowadzenia reakcji, a zatem zmniejsza też szybkość
reakcji. Inhibicji niekompetycyjnej nie można przezwyciężyć przez zwiększenie stężenia
substratu. Nie zmienia się natomiast w obecności inhibitora niekompetycyjnego
powinowactwo enzymu do substratu, czyli nie ulega zmianie wartość Km.
Inhibicja akompetycyjna
- inhibitor wiąże się odwracalnie z kompleksem ES, tworząc nieaktywny katalitycznie
kompleks ESI.
- inhibitor nie wiąże się z wolnym enzymem.
- przy każdym stężeniu inhibitora, nawet przy dużym stężeniu substratu nie jest możliwe
przeprowadzenie wszystkich cząsteczek enzymu w aktywny kompleks ES. Pewna część
nieaktywnego katalitycznie kompleksu ESI będzie zawsze obecna i w konsekwencji Vmax
zawsze jest mniejsze w obecności inhibitora akompetycyjnego niż Vmax w jego
nieobecności (podobnie jak to miało miejsce w obecności inhibitora niekompetycyjnego).
- przy inhibicji akompetycyjnej zmniejsza się również wartość Km.
- inhibitor wpływa jednocześnie na wiązanie substratu i liczbę obrotów enzymu.
5