IDENTYFIKACJA I ANALIZA ILOŚCIOWA IAA ASPARAGINIANU

METODĄ WYSOKOCIŚNIENIOWEJ CHROMATOGRAFII

CIECZOWEJ (HPLC)

WSTĘP

Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (ang. high pressure liquid chromato-

graphy, HPLC) jest metodą pozwalającą na identyfikację i analizę kilkudziesięciu skład-

ników mieszaniny jednocześnie z zachowaniem wysokiej dokładności. Cechą charaktery-

styczną tej metody jest bardzo mała średnica ziaren (3-10 µm) nośnika chromatograficz-

nego względem całej fazy stacjonarnej. Im mniejsza średnica ziarna tym większa po-

wierzchnia czynna nośnika i lepszy rozdział chromatograficzny. Powyższa cecha stwarza

konieczność stosowania wysokich ciśnień podczas przepływu fazy ruchomej. Wysokie

ciśnienie (nawet do 35 MPa) jest generowane przez pompy wyposażone w tłoki tytanowe.

Wysoka rozdzielczość chromatografii pozwala na nanoszenie niewielkich objętości pró-

bek (od 5 do 50µl).

W skład zestawu do HPLC wchodzą:

• sonifikator: urządzenie usuwające pęcherzyki gazu z roztworu

• pompa tłocząca eluent,

• autosampler – urządzenie samoczynnie pobierające próbki, zaopatrzony w dozownik

prób (injector)- strzykawkę z igłą pobierająca zadaną objętość próbki,

• kolumna chromatograficzna,

• detektor umożliwiający wykrycie rozdzielanych związków chemicznych opuszczają-

cych kolumnę

• komputer pozwalający na rejestrację i integrację wyników chromatografii.

Najczęściej używanym detektorem współpracującym z zestawem HPLC jest spektrofo-

tometr przepływowy mierzący absorbancję w zakresie UV. Pomiar absorbancji odbywa

się w sposób ciągły i nie wymaga każdorazowego pobierania eluatu (wycieku z kolumny)

do kuwety. Auksyny i ich koniugaty zawierają w swojej strukturze pierścień indolowy

wykazujący maksimum absorbancji przy λ= 275 nm, stąd detektor podczas analizy tych

związków ustawiony jest na tę długość fali. Podstawowym parametrem charakteryzują-

cym HPLC jest czas retencji (Rt), czas jaki upływa od nastrzyknięcia związku na kolum-

1

nę do momentu zarejestrowania przez detektor jego największej ilości (szczytu) w wy-

pływie. Porównanie czasów retencji związków wypływających z kolumny z czasami re-

tencji odpowiednich wzorców pozwala na identyfikację składników mieszaniny. Analizę

ilościową wykonuje się w oparciu o wartość pola powierzchni pod szczytem. W tym celu

wykonuje się krzywą kalibracyjną, nastrzykując próbki roztworu wzorcowego w rosną-

cych stężeniach. Po integracji chromatogramu z użyciem odpowiedniego oprogramowa-

nia, należy wykreślić krzywą zależności powierzchni szczytu od stężenia (lub ilości)

wzorca. Im większe stężenie rozdzielanego związku, tym większe pole powierzchni jego

szczytu.

Najpopularniejszym rodzajem HPLC jest chromatografia podziałowa w odwróconym

układzie faz (ang. reverse phase HPLC, RP-HPLC). Fazę stacjonarną stanowi nośnik

chromatograficzny zawierający idealnie sferyczne cząsteczki SiO2 związane kowalencyj-

nie z silnie hydrofobowymi łańcuchami węglowodorowymi o osiemnastu atomach węgla

(C18), stąd nazwa oktadecylosilan (ODS). Podczas chromatografii rozdzielane związki

ulegają ciągłemu podziałowi między fazę ruchomą (eluent), a fazę stacjonarną (hydrofo-

bowy nośnik). Podczas rozdziału dwóch związków różniących się polarnością (hydrofo-

bowa auksyna- IAA i polarny koniugat, IAA-Asp), związki polarne słabo oddziałują z

nośnikiem hydrofobowym i są szybciej eluowane z kolumny. Natomiast niepolarne sub-

stancje wiążą się z nośnikiem oddziaływaniami hydrofobowymi i są wymywane niepo-

larnym eluentem (np.: metanolem). Odwrócenie faz polega więc na zwiększeniu atrak-

cyjności fazy ruchomej (metanol) dla niepolarnego związku oddziałującego z fazą stacjo-

narną.

MATERIAŁY I METODY

Materiał:

•

preparat syntetazy IAA-Asp oczyszczonej z niedojrzałych nasion grochu, zamro-

żony w -20°C i dializowany przed oznaczeniem wobec buforu: 25 mM Tris-HCl

pH 7,6; 5 mM 2-merkaptoetanol.

Chromatograf cieczowy Waters 717 firmy Waters (USA): kolumna chromatograficz-

na: C18 Nova Pack (150 x 3.9 mm, 4µm) z przedkolumną (20 x 3.9 mm, 4 µm)

Detektor: spektrofotometr przepływowy UV-Vis

Odczynniki:

•

20 % (v/v) metanol do HPLC

2

•

50 % (v/v) etanol

•

5% (v/v) kwas octowy w 50 % (v/v) etanolu

•

3 % (v/v) kwas trójfluorooctowy (TFA) w 50 % (v/v) etanolu

•

mieszanina wyjściowa: 270 mM Tris-HCl pH 8,6; 27 mM ATP, 27 mM MgCl2

•

32 mM IAA w 50 % (v/v) izopropanolu

•

32 mM kwas asparaginowy

WYKONANIE:

Przygotowanie krzywej kalibracyjnej

Z roztworu IAA-Asp o stężeniu 1 mM przygotować 100µl rozcieńczonych roztwo-

rów o stężeniach: 20µM, 50 µM, 80 µM, 110 µM, 130 µM 160 µM. Do rozcieńczeń

używać 50 % etanol. Proszę obliczyć ilość nmoli IAA-Asp w 50 µl (objętość próbki na-

noszona na kolumnę). Przenieść 60 µl każdego z roztworów do szklanych vialek (małych

probówek do HPLC). Roztwory do oznaczeń przechowywać w lodówce.

Oznaczenie aktywności syntetazy IAA-Asp z niedojrzałych nasion grochu

Próba badana: Do probówki Eppendorfa napipetować 50 µl środowiska reakcyjnego oraz

30 µl preparatu enzymu. Próbę inkubować 60 minut w łaźni wodnej w temperaturze 30˚C.

Po czasie inkubacji, zatrzymać reakcję dodając 500 µl zimnego 50 % etanolu. Próbę wy-

mieszać i odwirowć w mikrowirówce przez 5 minut.

Próba zerowa: 50 µl środowiska reakcyjnego inkubować 60 minut, dodać 500 µl zimnego

50% etanolu i na koniec 30 µl preparatu enzymu. Wymieszać i odwirować.

Elucja IAA-Asp z mieszaniny inkubacyjnej metodą chromatografii jonowymiennej

na mikrokolumnie DEAE-Sephadex A-25

DEAE (dietyloaminoetyl) jest anionitem, czwartorzędową aminą alifatyczną związaną

kowalencyjnie z żelem Sephadex. Ze względu na dodatnio naładowany atom azotu, no-

śnik ten umożliwia oddziaływania z ujemnie naładowanymi cząsteczkami, pozwalając na

separację związków różniących się ładunkiem elektrycznym oraz wielkością tego ładun-

ku. Podczas niniejszego procesu dochodzi do wymiany jonów. Z nośnikiem oddziałują

składniki mieszaniny obdarzone ładunkiem ujemnym, IAA, Asp, ATP, IAA-Asp. IAA

oraz ATP wykazują słabsze oddziaływania i wymywane są z kolumny 5% kwasem octo-

wym. Asp podobnie jak IAA-Asp, produkt aktywności syntetazy IAA-Asp, ze względu

3

na dodatkową zjonizowaną grupę karboksylową, wiążą się silniej z anionitem, a ich elu-

cja z kolumny wymaga odczynnika o większej sile jonowej (kwas trójfluorooctowy).

2 ml zawiesiny DEAE-Sephadex A-25 w 50 % etanolu ułożyć w strzykawce o objętości 2

ml. Złoże przemyć 10 objętościami 50 % etanolu, nie dopuścić do wyschnięcia ani zapo-

wietrzenia nośnika. Po chromatografii, nośnik zregenerować dodając do zawiesiny anio-

nitu, octan sodu do końcowego stężenia 1M.

500 µl klarownego supernatantu nanieść na powierzchnię kolumienki DEAE-Sephadex

A-25. Po wniknięciu próbki, przemyć złoże 1 ml 50 % etanolu. Następnie przemyć złoże

10 ml 5% kwasu octowego w 50% etanolu. Pod wylot kolumienki postawić probówkę

kalibrowaną. Na szczyt nanieść 1ml 3 % TFA w 50 % etanolu, IAA-Asp wyeluować 4 ml

3 % TFA w 50 % etanolu. 120 µl eluatu przenieść do vialki.

Przygotowanie zestawu HPLC do chromatografii

UWAGA: Wszystkie roztwory do HPLC powinny być specjalnej czystości, przygotowa-

ne z użyciem dejonizowanej wody i przesączone pod zmniejszonym ciśnieniem przez

sączek o średnicy porów 0,2 µm. W trakcie pracy chromatografu, musi być przez cały

czas włączony sonifikator. Przestrzegać kolejności włączania urządzeń!

Kolumnę zaopatrzoną w przedkolumnę podłączyć do dolnego i górnego adaptora.

Wężyk doprowadzający roztwory na kolumnę przenieść do butelki z 20 % metanolem,

włączyć sonifikator, pompę, odkręcić zawór pompy i przepłukać przez 5 minut wybiera-

jąc opcję PURGE. Zakręcić zawór, zatrzymać pompę (STOP) i z menu wybrać opcję

FLOW, ustawić szybkość przepływu na 0,5 ml/min i przemywać ok. 3 godzin.

Włączyć autosampler , po 5 minutach wybrać opcję PURGE PAGE i przepłukać strzy-

kawkę autosamplera. Czynność powtórzyć 5 razy podczas przemywania całego układu.

Po zrównoważeniu kolumny, włączyć detektor. Po kalibracji detektora, włączyć kompu-

ter, uruchomić program Millenium 32. Ustawić długość fali detektora na 275 nm.

Do karuzeli autosamplera wstawić probówki zaczynając od pozycji 1.

Chromatografia

W programie Millenium 32, wpisać numery próbek, objętość nastrzykiwaną na ko-

lumnę (50 µl dla wzorców, 100 µl dla eluatu z DEAE-Sephadex A-25 ) i czas retencji (5

4

minut). Uruchomić rozdział chromatograficzny. Po rozdziale wszystkich prób, wykonać

integrację otrzymanych chromatogramów, wydrukować chromatogramy i tabele.

OPRACOWANIE WYNIKÓW

Wykonać tabelę zależności ilości nmoli IAA-Asp od pola powierzchni szczytu dla

IAA-Asp. Obliczyć współczynniki kalibracji dla każdej próbki wzorca i średni współ-

czynnik kalibracji (Kśr). Wykreślić krzywą kalibracyjną. Korzystając ze średniego współ-

czynnika kalibracji, obliczyć aktywność enzymu: nmole IAA-Asp/60 minut wg wzoru:

X= pole powierzchni IAA-Asp pr. badanej – pole powierzchni IAA-Asp próby zerowej x Kśr x 2.

Porównać czas retencji dla IAA-Asp (wzorzec) i produktu reakcji.

5