Pałeczki Gram-ujemne względnie beztlenowe.
Klasyfikacja Gram-ujemnych pałeczek względnie beztlenowych.
Charakterystyka:
" Pałeczki - barwiące się Gram-ujemne, ruchome. - urzęsienie
okołorzęse (rzęsek nie wytwarzają rodzaje: Klebsiella i Shigella).
Niektóre wytwarzają otoczki: np. rodzaj Klebsiella i mikrootoczki to śluz,
antygen V i występują u Salmonella typhi i niektórych gatunków
Citobacter spp.
" Nie wytwarzają przetrwalników. Rosną w warunkach tlenowych lub względnie
beztlenowych.
" Fermentują glukozę oraz inne węglowodany. Produkty fermentacji to alkohole
i gaz lub sam alkohol.
" Pałeczki te są - katalazo-dodatnie (zdarzają się wyjątki) - oksydazo-
ujemne tzn. nie wytwarzajÄ… oksydazy-cytochromowej, redukujÄ… azotany do
azotynów, nie wytwarzają DNAzy (dezoksyrybahukleazy) wytwarza ją
jedynie Serratia spp.), niektóre wytwarzają H2S (siarkowodór) np. Proteus
spp., Salmonella spp., Citobacter spp., z wyjÄ…tkiem np. Proteus spp. nie
powodują tlenowej dezaminacji fenyloalaniny, niektóre wytwarzają ureazę
np. Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Morganella morganii, oprócz: E.
coli, K. pneumoniae, Citobacter freundii i Enterobacter spp. nie fermentujÄ…
laktozy.
" Wzrost: podÅ‚oża zwykÅ‚e, temperatura optymalna 35-37°C (Yersinia spp. i
Erwinia spp.22-29°C). Yersinia spp. wykazuje zdolnoÅ›ci poruszania siÄ™ w
temp. 22°C - brak poruszania w 37°C. Wzrost paÅ‚eczek w czasie 18-24
godz. (wzrost optymalny). Jedynie Yersinia spp. rośnie do 72 godz.
Diagnostyka:
Podłoża wybiórczo-różnicujące m.inn.
" MacConkey'a
" SS
" Wilson - Blaira
Niektóre szczepy mogą wytwarzać barwniki rosnąc na podłożu stałym np.
Serratia marcescens i Serratia rubidaeae wytwarzajÄ… barwnik czerwony
(prodigiozyna), a Escherichia hermanii, Enterobacter sakazakii, Xenorrhabous
luminescens (wytwarzają barwniki żółte)
1. Obserwacja ruchu -
" W probówce-podłoże półpłynne z dodatkiem TTC (chlorek
trifenylotetrazoliowy)
" posiać igiełką ezy badane szczepy drobnoustrojów przebijając całe
podłoże do dna probówki
" inkubować w cieplarce w temp. 35 - 37°C przez 24 godz.
" odczytać wynik:
" drobnoustroje wytwarzające rzęski (mające zdolności poruszania się) rosną w
całej objętości
" podłoża zmieniając jego zabarwienia na kolor ciemnoczerwony,
spowodowany rozkładem TTC
" Drobnoustroje niewytwarzające rzęsek rosną bez zmiany zabarwienia
podłoża tylko na linii
" wkłócia.
2. Preparat przyżyciowy:
" w kropli wiszÄ…cej
" na szkiełku podstawowym
Przygotować hodowlę bulionową (24 godzinna) badanego szczepu, dokładnie
odtłuścić szkiełko podstawowe za pomocą pipety przenieść 1 kroplę na szkiełko
podstawowe przykryć szkiełkiem nakrywkowym ruch drobnoustrojów oglądać pod
powiększeniem 40x
Drobnoustroje wytwarzające rzęski poruszają się ruchem  pływakowatym"
Drobnoustroje nie wytwarzające rzęsek - ruchem Browna (dookoła własnej osi).
Oznaczenie oksydazy -
1. Odczynnik - L-naftol lg rozpuszczony w C2H5OH 96%
2. Odczynnik - chlorowodorek p-aminodwumetyloaniliny lg rozpuszczony w H2O
Obecność oksydazy cytochromowej obserwowana jest jako wystąpienie
intensywnie niebieskiego zabarwienia w ciÄ…gu 30 sek do 2 min. Zabarwienie to
spowodowane jest przez błękit indotenolu, który tworzy się z dodawanych
odczynników przy obecności tlenu, cytochromu C, a także oksydazy
cytochromowej.
Oksydaza cytochromowa katalizuje w obecności tlenu utlenienie
zredukowanych cytochromów. Występuje u drobnoustrojów bezwzględnie
tlenowych np. Pseudomonas spp. i Micrococcus spp.
Test na oznaczenie zdolności do wykorzystania cukrów -
Odczyn 0-F(oxidation-fermentantion) na podłożu Hugh-Leifsona. Odczyn ten
służy do oznaczania zdolności do wykorzystania cukrów z wytworzeniem
kwasu w warunkach beztlenowych. Test ten wykonuje siÄ™ z zastosowaniem
podłoża Hugh-Leifsona z dodanym barwnikiem (błękit bromotymolowy). Podłoże
szykowane jest-.w dwóch probówkach (zalane warstewką jałowej parafiny i bez
warstewki parafiny).
Oczkiem ezy pobrać kolonie bakteryjne i posiać na dno probówek. Następnie
jedną z nich pokryć cienką warstwą jałowej parafiny, inkubować w cieplarce i
odczytać wynik. Jeśli cukier jest wykorzystany z wytworzeniem kwasu następuje
zmiana zabarwienia podłoża z niebieskiego na żółty. Probówka z parafiną
charakteryzuje warunki beztlenowe.
Coli ID)
Jest to wybiórcze podłoże zawierające chromogeny, służące do wykrywania, oceny
ilościowej oraz różnicowania pałeczek podobnych do E. coli, a także do
identyfikacji E. coli w probówkach żywności.
Opis metody - podłoże to zawiera dwa chromogenne substraty: jeden dla B-
glukuronidazy - barwi kolonie E. coli na czerwono; drugi dla ²-galaktazydazy -
barwi kolonie pałeczek podobnych do E. coli na niebiesko. Połączenie obu
substratów umożliwia jednoczesne wykrycie E. coli oraz pałeczek do niej
podobnych.
Badany materiaÅ‚ posiać na podÅ‚oże, inkubować 24-48 godz., 35-37°C, E. coli 
kolonie różowo-fioletowe; pałeczki podobne do E. coli - kolonie niebiesko-szare inne
bakterie Gram- ujemne - kolonie bezbarwne.
Wzrost na podłożu agarowym -
Escherichia coli rośnie w postaci kolonii gładkich lub szorstkich. Kolonie gładkie
mają szarawy odcień, są lekko wypukłe o równej krawędzi, powierzchnia kolonii jest
wilgotna i błyszcząca, łatwo zawieszają się w NaCl.
Kolonie szorstkie - powierzchnia szorstka, konsystencja sucha, trudno zawieszajÄ…
siÄ™ w NaCl.
Klebsiella spp. - rosną w postaci kolonii gładkich, dużych, błyszczących, śluzowych o
barwie szarobiałej.
Enterobacter spp. - duże, białe kolonie, błyszczące, gładkie
Proteus spp. - rośnie w postaci tzw. wzrostu mgławicowego (na świeżym podłożu)
pełza pocałej objętości podłoża.
Zdolności drobnoustrojów do dekorboksylacji aminokwasów.
Podłoże to zawiera chlorowodorek pirydoksyny, odpowiedni aminokwas (np. lizynę),
purpurę bromokrezolową, czerwień krezolową. Podłoże należy rozlać do
probówek i pokryć warstewkę jałowej parafiny. Do części podłoża nie dodawać
aminokwasu (będzie to próba kontrolna), natomiast podłoże z aminokwasem (to
próba właściwa). Badane szczepy przesiać do obu probówek (jedna - kontrola i
druga - wÅ‚aÅ›ciwa), inkubować 24 godz. w 37°C. Wynik badania - w podÅ‚ożu
kontrolnym bez aminokwasu (bez lizyny) następnie rozkład glikozy, zakwaszenie
środowiska i zmiana zabarwienia z fioletowego na żółty. W drugiej probówce -(z
lizyną) wytwarza się nadmiar amin, zachodzi zobojętnienie kwaśnych produktów i
alkalizacja podłoża (wskaz
nik pozostaje zabarwiony na fioletowo). Wynik dodatni -
kontrola żółta (bez lizyny), próba właściwa fioletowa (z lizyną).
Wzrost na podłożu Simmonsa z cytrymianem
Cytrynian stanowi z
ródło węgla. Szczepy Escherichia spp., Shigiella i niektóre
Proteus nie rozkładają go i nie wykorzystują jako z
ródło energii. Z tej przyczyny na
tym podłożu nie rosną. Drobnoustroje rozkładające cytrynian rosną na nim i
zmieniają jego zabarwienie. Podłoże to zawiera między innymi: NaCl, cytrynian
sodu, wodorofosforan potasu, dwuwodorofosforan amonu, siarczan magnezowy i
barwnik (błękit bromotymolowy). Badany materiał posiać ezą na podłoże, inkubować
48 godz. w 37°C. Wynik dodatni - alkalizacja podÅ‚oża (wytwarzanie NH3 z
fosforanu amonowego) i zmiana zabarwienia podłoża z zielonego na niebieskie.
Rozkład kwasu malonowego
Jednym ze składników jest malonian sodu barwnik - błękit bromotylolowy.
Podłoże przelać do probówek, posiać badane drobnoustroje, inkubować 24
godz. w 37°C. PaÅ‚eczki rozkÅ‚adajÄ…ce malomian alkalizujÄ… podÅ‚oże na skutek
czego następuje zmiana zabarwienia z zielonego na niebieskie. Wynik
dodatni - niebieskie zabarwienie podłoża.
Wzrost na podłożu Wilson-Blaira -
Podłoże to zawiera - siarczyn bizmatu, zieleń brylantową, siarczan żelaza.
Kolonie szczepów Salmonella są czarne z metalicznym połyskiem
Szczepy Klebsiella - kolonie śluzowe, brunatno-szare
Escherichia coli - rośnie słabo, kolonie brązowe lub czarne, otoczenie kolonii
niezabarwione.
Enterobacter podobnie jak Klebsiella rosną obficie, kolonie, błyszczące często
śluzowate z zaczernieniem podłoża (otoczenie kolonii). Proteus - kolnie
brunatnoczerwone, szczepy ShigiellÄ… nie rosnÄ….
Podłoże agar SS-
Do izolowania Salmonella i Shigella podłoże to zawiera cytrynian sodu i cytrynian
żelazowy, Laktozę tiosiarczanu sodu, dezoksychalan, czerwień obojętna i zieleń
brylantowa. Większość E. coli słabo rośnie, na tym podłożu, niektóre tworzą
czerwone kolonie otoczone strefÄ… wytrÄ…conego dezoksychalanu sodowego.
Enterobacter, Serratia, Hafnia raczej nie rosną na tym podłożu Salmonella
twórzą.kolonie przejrzyste, bezbarwne, gładkie z czarnymi środkami. Shigella -
przejrzyste, bezbarwne, gładkie. Proteus - żółte z czarnymi środkami.
Podłoże Mac Conkey a
Zawiera laktozę, sole żóici, NaCl. czerwień obojętną. Kolonie pałeczek rozkładające
laktozÄ™ rosnÄ… z czerwonym zabarwieniem, natomiast nie fermentujÄ…ce jej rosnÄ… na
różowo. E. coli -kolnie różowe lub czerwone, Enterobacter aerogenes - różowe,
śluzowate Enterokoki -czerwone, małe; gronkowce - czerwone lub różowe,
Salmonella; Shigella i Pseudomonas -kolonie bezbarwne (brak fermentacji laktozy).
Wytwarzanie ureazy - rozkład mocznika na podłożu Christensena
Pałeczki należące do rodzaju Proteus i niektóre inne wytwarzają enzym ureazę,
która hydrolizuje mocznik do amoniaku (NH3) i CO2.
Amoniak alkalizuje hodowlę. Wchodzącą w skład podłoża czerwień fenolowa
zmienia zabarwienie z żółtego na różowe, (odczyn dodatni - zabarwienie różowe).
Podłoże Kliglera -
Zawiera: NaCL, siarczyn sodu, tiosiarczan sodu, siarczan żelazowy, laktozę,
glukozę, czerwień fenolową. Jest to podłoże różnicujące dla drobnoustrojów
Gram-ujemnych przewodu pokarmowego. Umożliwia obserwację zdolności
fermentowania laktozy i glukozy z wytworzeniem gazu lub bez, jak również
wytwarzanie siarkowodoru. Podłoże jałowe ma zabarwienie czerwone, zmiany
barwne:
a) żółty skos i żółty słupek podłoża - to fermentacja obu cukrów
b) niezmieniona barwa podłoża - to brak fermentacji
c) czerwony skos a żółty słupek - fermentacja jedynie glukozy
d) wytwarzanie siarkowodoru - zaczernienie podłoża
e) wytwarzanie gazu -powstawanie baniek..gazu wewnÄ…trz..agaru,
niekiedy rozerwanie podłoża
Rozkład laktozy
Podłoże płynne z dodatkiem 10% laktozy i purpurą bromokrezolową. Niektóre
pałeczki mają zdolność beztlenowego (pod warstewką jałowej parafiny) rozkładu -
fermentacji laktozy. Podłoże ulega zakwaszeniu, a wynik reakcji obserwujemy jako
zmiany zabarwienia podłoża z fioletowego na żółtą (wynik pozytywny).
Określenie typu fermentacji - odczyn MR
W podłożu Clarka pałeczki przeprowadzające fermentację kwaśną wytwarzają z
cukrów jak i związków pokrewnych kwasy: mrówkowy, octowy, mlekowy,
bursztynowy oraz alkohol etylowy. Na skutek nagromadzenia produktów kwaśnych
odczyn hodowli wynosi pH 4,5. Wtedy czerwień metylowa będąca jednym ze
składników podłoża zmienia zabarwienie z żółtego na czerwone. W drugim typie
fermentacji, w którym powstaje mało kwasów, a więcej produktów obojętnych np.
glikol butylenowy wtedy odczyn hodowli jest mniej kwaśny (pH > 4,5) czerwień
metylowa przybiera zabarwienie żółte (odczyn ujemny). W celu odczytu wyniku
reakcji dodać tyle mililitrów odczynnika (MR) ile jest mililitrów podłoża. Czerwone
zabarwienie hodowli to - odczyn dodatni, natomiast żółte - to odczyn ujemny.
Wytwarzanie acetoiny - (odczyn Vogesa i Proskauera)
W procesie fermentacji w którym powstaje glikol butylenowy (jako główny
metabolit) powstaje także acetoina. W środowisku zasadowym przy dostępie tlenu w
obecności kreatyny albo jej pokrewnych tworzy się diacetyl o zabarwieniu różowym.
Zdolność do wytwarzania acetoiny określana jest w podłożu Clarka. Drobnoustroje
posiać do togo podÅ‚oża, inkubować 48 godz., 37°C, nastÄ™pnie dodać roztworom alfa-
naftolu w absolutnym C2H5OH oraz 40% wodnego roztworu KOH i roztwór kreatyny.
ProbówkÄ™ umieÅ›cić w temperaturze 37°C. Czerwone lub różowe zabarwienie w
górnej części podłoża świadczy o wytwarzaniu acetoiny (odczyn-dodatni);
Wytwarzanie indolu - w podłożu woda peptonowa z tryptofanem.
Niektóre bakterie np. Escherichia, Citobacter wytwarzają indol z tryptofonu. Badany
szczep posiewać do podÅ‚oża inkubować 37°C, 24 godz. Wykrywanie indolu
pochodzącego z rozkładu tryptofanu przez enzym tryptofanaze przy użyciu
odczynnika Ehrlicha lub Kovacsa. Odczynnik Ehrlicha - po podaniu eteru (eter na
powierzchni hodowli). Jeśli jest indol -przechodzi do warstwy eterowej. Odczynnik
ten nabrać pipetą i wypuścić pod warstwą eterową. Wynik dodatni - na granicy
warstwy eterowej tworzą się intensywnie czerwony pierścień.
Odczynnik Kovacsa - po podaniu tego odczynnika jeśli jest wynik pozytywny pojawia
siÄ™ intensywnie czerwone zabarwienie.
Chorobotwórczość
Jej wyznacznikiem są przede wszystkim endotoksyny (LPS). Niektóre z pałeczek
jelitowych mają ponadto inne czynniki zjadliwości np. fimbrie zwykłe, a także
wytwarzanie egzotoksyny albo enzymów toksycznych. One odpowiadają za
adhezję i kolonizację, inwazyjność tzn. penetrację. Wszystkie pałeczki mogą
wywoływać poniżej podane zakażenia:
" przewodu pokarmowego - dominujÄ… Salmonella, Shigiella i E. coli,
Yersinia enterocolitica, Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae,
Serratia marcescens. Zakażenia takie dotyczą najczęściej jelita
cienkiego - określane są jako enterocolitis, enteritis.
" Shigella - dotyczą zakażenia błony śluzowej, jelita grubego
(czerwonka bakteryjna). Objawem zakażeń najczęściej są biegunki.
" zatrucia pokarmowe - najczęściej przez: Salmonella, Escherichia coli,
Yerinia enterocalitica np. biegunki podróżnych
" dróg moczowych - dotyczą dolnego odcinka - zapalenie pęcherza
moczowego i cewki moczowej, górnego - odmiedniczkowe zapalenie
nerek.
" dróg oddechowych - np. różne zapalenie płuc, rzadziej zapalenie
oskrzeli i zakażenie górnych dróg oddechowych, odpowiedzialne są
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, E. coli, Citobacter, Proteus.
Cuchnący nieżyt nosa - Klebsiella ozaenae
" Bakterimie i posocznice - E. coli, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Salmonella, Morganella
morganii. Posocznice są niejednokrotnie przyczyną zejścia śmiertelnego.
" Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych - najczęściej wywoływane
przez E. coli (najczęściej u noworodków). Do zakażenia może dojść
przez powikłania w trakcie akcji porodowej. U dorosłych na drodze
krwiopochodnej (najczęściej pochodzące z pierwotnych zakażeń w
Układzie moczowym lub z dróg żółciowych). Szczepy E. coli mające
antygen powierzchniowy Kl uważane są jako bardziej zjadliwe od tych u
których ten antygen nie występuje. Ponadto inne pałeczki to: Klebsiella
(głównie K. Pnieumoniae), Enterobacter, Serratia, Proteus,
Salmonella, Yersinia, Citobacter. Najczęściej są to zakażenia wtórne
nie pierwotne, będące następstwem bakteriemii lub posocznicy.
" Układ kostno-stawowy - wywoływane najczęściej przez Yersinia, Salmonella,
E. coli.
" Zakażenia różne - np. ropnie skóry, ropnie narządów wewnętrznych
(wątroby, śledziony, nerek), ropne zapalenie pęcherzyka żółciowego lub
dróg żółciowych, zapalenie otrzewnej, odpowiedzialne są: E. coli,
Yersinia spp., Salmonella spp., Erwinia spp., Edwardsiella spp.