Dw. 12 Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych. Efekt cytopatyczny
(CPE  cytopathic effect).
Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych:
1. Dobór odpowiedniej hodowli zależy od jej wrażliwości na dany wirus, np..:
2. Bardzo ważna jest też dawka zakaz
na wirusa, która może byd wyrażona w różnych jednostkach:
a. TCID50 (tissue culture infectious dose)  50% dawka zakaz
na dla hodowli komórek, czyli takie
rozcieoczenie wirusa, które wywołuje efekt cytopatyczny w 50% zakażonych hodowli komórkowych
b. PFU (plaque forming unit)  jednostka łysinkowa  najwyższe rozcieoczenie wirusa wywołujące
zniszczenie hodowli komórek w postaci pól zniszczenia (łysinek) dających się policzyd
c. MOI (multiplicity of infection)  liczba cząstek wirusa przypadających na jedną komórkę
- Odpowiednia dawka zakaz
na decyduje o koocowym mianie namnożonego wirusa.
- W zależności od rodzaju hodowli i wirusa, namnożony patogen zbiera się po 18-120 godzinach
inkubacji w temperaturze optymalnej dla danego układu (zwykle od 26�C do 37�C).
Efekt cytopatyczny (CPE):
�� Efekt cytopatyczny CPE (cytopathic effect) - zespół zmian morfologicznych i degeneracyjnych, występujących w
komórkach pod wpływem replikacji wirusa. Jest on następstwem zahamowania transkrypcji RNA oraz
syntezy białek gospodarza, jak również toksycznego wpływu białek wirusa.
�� Wirusy, zaburzając prawidłowy metabolizm komórki, wywołują charakterystyczny dla danej grupy tzw. efekt
cytopatyczny - zmiana kształtu komórki, zmiany degeneracyjne jądra komórkowego, obecnośd
wewnątrzjądrowych i wewnątrzplazmatycznych wtrętów, wakuolizacja komórek i najczęściej ich rozpad
WPROWADZENIE:
" Wirus atakujący komórkę może powodowad w niej różnego rodzaju zmiany.
" Replikacja wirusa możliwa jest tylko w komórkach wrażliwych, czyli takich, które podtrzymują pełny cykl
replikacji  od adsorpcji i penetracji do uwolnienia zakaz
nych, potomnych cząstek wirusa
" Genom wirusa wywołuje w komórce zasadnicze zmiany prowadzące do:
1. Uszkodzenia funkcji komórki wraz z charakterystycznymi zmianami morfologicznymi, które można
śledzid w mikroskopie elektronowym, a w koocowej fazie uszkodzenia komórki także w mikroskopie
świetlnym. Te nieodwracalne procesy zniszczenia komórki nazywamy  EFEKTEM CYTOPATYCZNYM
2. Utrzymującego się zakażenia komórki z nieznacznymi zmianami nie prowadzącymi do śmierci komórki.
W tym przypadku częśd komórek hodowli produkuje wirusa, a częśd pozostaje nie zakażona. Przy
podziałach komórek zakażonych wirus przechodzi do komórek potomnych.
3. Transformacji komórek, na przykład pod wpływem retrowirusów. Transformacja może wiązad się z
integracją genomu wirusa do genomu komórki, bez replikacji wirusa, lub może byd zachowane tworzenie
się zakaz
nych wirionów.
" Zakażenie cytoidalne powoduje nieodwracalne, poważne uszkodzenie lub zniszczenie komórki w wyniku
zaburzeo metabolizmu komórkowego, działania białek wirusa i nowo syntetyzowanych wirionów.
" Cytopatyczny wpływ wirusa objawia się:
�% Zatrzymaniem ruchu komórek
�% Zahamowaniem podziałów komórkowych
�% Zahamowaniem syntezy komórkowego DNA i białek
�% Powstawaniem składników kwasochłonnych w przestrzeniach okołojądrowych  dezintegracja jądra
komórkowego
�% Wakuolizacją cytoplazmy
�% Degeneracją mitochondriów
�% Uszkodzeniem błony komórkowej i całkowitym rozpadem cytoplazmy
W zależności od rodzaju wirusa obserwuje się różne zmiany w hodowlach komórek in vitro:
" zmiana morfologii komórek
" powiększenie i deformacja jądra komórkowego
" degranulacja mitochondriów
" rozpad błony komórkowej
" syncytia  wielojądrzaste komórki olbrzymie
" śmierd zainfekowanych komórek
Różne rodzaje CPE:
" Efekt cytopatyczny jest charakterystyczny dla określonej grupy wirusów.
1. Np. infekcja wirusem VSV (Vesicular Stomatitis Virus) prowadzi do zniszczenia komórek nie w wyniku
bezpośredniej lizy lecz przez zmiany w przepuszczalności błony komórkowej, w wyniku których komórka nie jest
odpowiednio zaopatrywana w niezbędne jej składniki tj. rybonukleotydy. Prowadzi to do zahamowania syntezy
RNA i w konsekwencji do śmierci komórki. W hodowli zainfekowanej VSV widocznymi objawami infekcji są:
skupianie się komórek w agregaty i ich odpadanie od ścian naczynia.
2. Zakażenie adenowirusami prowadzi do powolnych zmian cytopatycznych wyrażających się zmianą morfologii
komórek:
- powiększenie jąder
- degranulacja mitochondriów
- rozpad błony komórkowej
" Zmiany te pojawiają się zwykle między 2 a 21 dniem infekcji i moment ich pojawienia się zależy od typu
wirusa. Najszybsze zmiany powoduje adenowirus typu 5 - już w 12 godzinie od zakażenia dochodzi do
całkowitego zablokowania syntezy komórkowego DNA, co jest spowodowane działaniem białek wirusowych
3. Szczególną postacią CPE jest tworzenie wielojądrzastych komórek olbrzymich - SYNCYTIÓW. Powstają one na
skutek naruszenia struktury lipidów błony komórkowej przez czynniki uszkadzające, obecne w osłonkach wielu
paramyksowirusów i herpeswirusów. Jądra powstałych komórek olbrzymich są zwykle uszkodzone, a czasem
nawet pozbawione błony jądrowej (tzw. nagie jądra HHV-1 i 2)
Wirus odry
- SYNCYTIA WCZESNE - powstają po wprowadzeniu do hodowli
dużych dawek wirusa i składają się wyłącznie z komórek zakażonych
wirusem
- SYNCYTIA PÓy
NE - powstają po użyciu niewielkiej ilości aktywnych
wirionów i składają się zarówno z komórek zakażonych, jak i
zdrowych
4. Do zniszczenia komórek dochodzi także w wyniku masowego uwolnienia potomnych wirionów, np. podczas
pączkowania wirusów Herpes z błony jądrowej, aparatu Golgiego, siateczki środplazmatycznej i błon
wakuolarnych
5. Charakterystyczne zmiany wewnątrzkomórkowe występują również po zakażeniu komórek wirusem SV40
(Simian Virus).
" Na infekcję tym wirusem komórki reagują kilkukrotnym powiększeniem swojej objętości i silną wakuolizacją
cytoplazmy.
Wtręty komórkowe:
" Ciałka wtrętowe są to skupiska replikujących się wirusów (zakażenie reowirusami) lub stanowią pozostałośd po
procesie replikacji wirusa (wirus opryszczki). Mogą one powstawad w jądrze (wirusy Herpes - opryszczka),
cytoplazmie (Poxwirusy - ospa), bądz
w obu tych strukturach jednocześnie (Paramyksowirusy - odra).
1. Wtręty wewnątrzjądrowe:
" Typ A  wyraz
nie odgraniczone od chromatyny jądrowej otaczającą je jasną
przestrzenią. Powstają one w jądrach komórek zakażonych wirusami: HHV-1 i 2, VZV
(ospa wietrzna  półpasiec), SuHV-1 (Suid herpesvirus 1 powodujący chorobę
Aujeszky ego).
" Typ B  nie posiadają wyraz
nie zaznaczonej granicy, w mniejszym stopniu zauważalne
są też zmiany morfotyczne w jądrze. Występują po zakażeniach wirusami: żółtej
febry, poliomyelitis, wschodniego i zachodniego kooskiego zapalenia mózgu.
2. Wtręty cytoplazmatyczne:
" Ciałka wtrętowe powstające w cytoplazmie są głównie pozostałością cyklu replikacyjnego wirusów i wykazują
powinowactwo do barwników kwaśnych lub zasadowych
" Ich obecnośd jest często bezspornym dowodem wystąpienia infekcji wirusowej, np.:
- w przebiegu wścieklizny w cytoplazmie zakażonych komórek wykrywane są ciałka Babesa i Negriego
- zaś w zakażeniach nosówką  ciałka wtrętowe Lentza
- wtręty cytoplazmatyczne wykrywa się również w komórkach nabłonkowych po zakażeniu wirusem
krowianki, czy wirusem nagminnego zapalenia przyusznic (świnki)
" Ciałka Negriego  okrągławe, podobne do erytrocytów ciałka wtrętowe spotykane w cytoplazmie
neuronów okolicy hipokampa i komórek Purkiniego móżdżku w przebiegu wścieklizny
" Ciałka Guarnieriego  w komórkach barwią się eozyną, wyglądają jak różowe pęcherzyki w
cytoplazmie zarażonych komórek nabłonkowych, znajdowane podczas badania mikroskopowego komórek
epitelialnych u osób zarażonych wirusem z rodziny Pokswirusów (np. wirusem ospy prawdziwej lub wirusem
krowianki)
Aberracje chromosomów:
" Następstwem zakażenia komórek przez wirusy może byd również uszkodzenie kariotypu
" Większośd stwierdzanych zmian ma charakter losowy i obejmuje pęknięcia, fragmentacje i translokacje
chromosomów
" Zmiany kariotypu wywoływane są m.in. przez wirus odry, VZV, adenowirusy, a także wirusy onkogenne
" Szczególnie niebezpieczne są zmiany kariotypu powodowane przez wirus różyczki i CMV (cytomegalowirus),
które prowadzą do poronieo lub do powstania wad rozwojowych u dziecka
Transformacja komórek:
" Zakażenie komórki wirusem onkogennym nie prowadzi do jej śmierci, lecz do nabycia przez nią nowych
właściwości biologicznych, przekazywanych również komórkom potomnym
" Okres produkcji wirusa ograniczony jest tylko długością życia tej komórki
" Transformacja komórki jest uzależniona od obecności w genomie wirusa genów odpowiedzialnych za ten proces
" Komórki transformowane cechują się wzrostem chaotycznym i wielowarstwowym, któremu zwykle towarzyszy
utrata zdolności hamowania kontaktowego i rozchodzenia się komórek na niezasiedlone miejsca
" Zmianie podlega też morfologia komórek i ich metabolizm
" Komórki transformowane mają zmniejszone wymagania odżywcze na niektóre składniki, np. surowicę
" Komórki transformowane wykazują się zwiększoną przemianą cukrową oraz produkcją kwasów organicznych i
mukopolisacharydów
" Transformacja komórek często obejmuje też występowanie losowych nieprawidłowości chromosomowych
(translokacje, inwersje i delecje), często spotykanych zwłaszcza w komórkach pewnych typów białaczek
" Do wirusów mających zdolnośd transformacji komórek prawidłowych należą np.: EBV (limfocyty B zakażone tym
wirusem podlegają ciągłej proliferacji), czy onkogenne retrowirusy (wirus mięsaka Rousa, mysiej białaczki
limfatycznej  MTLV-1)
Wirus EBV w strefie klimatu umiarkowanego wywołuje chorobę - mononukleozę zakaz
ną, natomiast u afrykaoskich
dzieci jest przyczyną łagodnego nowotworu (Chłoniak Burkitta), zaś w południowych Chinach, głównie u mężczyzn
po 50 roku życia pełni rolę w rozwoju raka jamy nosowo-gardłowej. Około 25% chorych na chłoniaka Hodkina
posiada limfocyty B transformowane przez wirus EBV.