Dw. 12 Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych. Efekt cytopatyczny
(CPE  cytopathic effect).
Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych:
1. Dobór odpowiedniej hodowli zależy od jej wrażliwości na dany wirus, np..:
2. Bardzo ważna jest też dawka zakaz
na wirusa, która może byd wyrażona w różnych jednostkach:
a. TCID50 (tissue culture infectious dose)  50% dawka zakaz
na dla hodowli komórek, czyli takie
rozcieoczenie wirusa, które wywołuje efekt cytopatyczny w 50% zakażonych hodowli komórkowych
b. PFU (plaque forming unit)  jednostka łysinkowa  najwyższe rozcieoczenie wirusa wywołujące
zniszczenie hodowli komórek w postaci pól zniszczenia (łysinek) dających się policzyd
c. MOI (multiplicity of infection)  liczba cząstek wirusa przypadających na jedną komórkę
- Odpowiednia dawka zakaz
na decyduje o koocowym mianie namnożonego wirusa.
- W zależności od rodzaju hodowli i wirusa, namnożony patogen zbiera się po 18-120 godzinach
inkubacji w temperaturze optymalnej dla danego ukÅ‚adu (zwykle od 26°C do 37°C).
Efekt cytopatyczny (CPE):
Øð Efekt cytopatyczny CPE (cytopathic effect) - zespół zmian morfologicznych i degeneracyjnych, wystÄ™pujÄ…cych w
komórkach pod wpływem replikacji wirusa. Jest on następstwem zahamowania transkrypcji RNA oraz
syntezy białek gospodarza, jak również toksycznego wpływu białek wirusa.
Øð Wirusy, zaburzajÄ…c prawidÅ‚owy metabolizm komórki, wywoÅ‚ujÄ… charakterystyczny dla danej grupy tzw. efekt
cytopatyczny - zmiana kształtu komórki, zmiany degeneracyjne jądra komórkowego, obecnośd
wewnątrzjądrowych i wewnątrzplazmatycznych wtrętów, wakuolizacja komórek i najczęściej ich rozpad
WPROWADZENIE:
" Wirus atakujący komórkę może powodowad w niej różnego rodzaju zmiany.
" Replikacja wirusa możliwa jest tylko w komórkach wrażliwych, czyli takich, które podtrzymują pełny cykl
replikacji  od adsorpcji i penetracji do uwolnienia zakaz
nych, potomnych czÄ…stek wirusa
" Genom wirusa wywołuje w komórce zasadnicze zmiany prowadzące do:
1. Uszkodzenia funkcji komórki wraz z charakterystycznymi zmianami morfologicznymi, które można
śledzid w mikroskopie elektronowym, a w koocowej fazie uszkodzenia komórki także w mikroskopie
świetlnym. Te nieodwracalne procesy zniszczenia komórki nazywamy  EFEKTEM CYTOPATYCZNYM
2. Utrzymującego się zakażenia komórki z nieznacznymi zmianami nie prowadzącymi do śmierci komórki.
W tym przypadku częśd komórek hodowli produkuje wirusa, a częśd pozostaje nie zakażona. Przy
podziałach komórek zakażonych wirus przechodzi do komórek potomnych.
3. Transformacji komórek, na przykład pod wpływem retrowirusów. Transformacja może wiązad się z
integracją genomu wirusa do genomu komórki, bez replikacji wirusa, lub może byd zachowane tworzenie
siÄ™ zakaz
nych wirionów.
" Zakażenie cytoidalne powoduje nieodwracalne, poważne uszkodzenie lub zniszczenie komórki w wyniku
zaburzeo metabolizmu komórkowego, działania białek wirusa i nowo syntetyzowanych wirionów.
" Cytopatyczny wpływ wirusa objawia się:
«% Zatrzymaniem ruchu komórek
«% Zahamowaniem podziałów komórkowych
«% Zahamowaniem syntezy komórkowego DNA i biaÅ‚ek
«% Powstawaniem skÅ‚adników kwasochÅ‚onnych w przestrzeniach okoÅ‚ojÄ…drowych  dezintegracja jÄ…dra
komórkowego
«% WakuolizacjÄ… cytoplazmy
«% DegeneracjÄ… mitochondriów
«% Uszkodzeniem bÅ‚ony komórkowej i caÅ‚kowitym rozpadem cytoplazmy
W zależności od rodzaju wirusa obserwuje się różne zmiany w hodowlach komórek in vitro:
" zmiana morfologii komórek
" powiększenie i deformacja jądra komórkowego
" degranulacja mitochondriów
" rozpad błony komórkowej
" syncytia  wielojądrzaste komórki olbrzymie
" śmierd zainfekowanych komórek
Różne rodzaje CPE:
" Efekt cytopatyczny jest charakterystyczny dla określonej grupy wirusów.
1. Np. infekcja wirusem VSV (Vesicular Stomatitis Virus) prowadzi do zniszczenia komórek nie w wyniku
bezpośredniej lizy lecz przez zmiany w przepuszczalności błony komórkowej, w wyniku których komórka nie jest
odpowiednio zaopatrywana w niezbędne jej składniki tj. rybonukleotydy. Prowadzi to do zahamowania syntezy
RNA i w konsekwencji do śmierci komórki. W hodowli zainfekowanej VSV widocznymi objawami infekcji są:
skupianie się komórek w agregaty i ich odpadanie od ścian naczynia.
2. Zakażenie adenowirusami prowadzi do powolnych zmian cytopatycznych wyrażających się zmianą morfologii
komórek:
- powiększenie jąder
- degranulacja mitochondriów
- rozpad błony komórkowej
" Zmiany te pojawiają się zwykle między 2 a 21 dniem infekcji i moment ich pojawienia się zależy od typu
wirusa. Najszybsze zmiany powoduje adenowirus typu 5 - już w 12 godzinie od zakażenia dochodzi do
całkowitego zablokowania syntezy komórkowego DNA, co jest spowodowane działaniem białek wirusowych
3. Szczególną postacią CPE jest tworzenie wielojądrzastych komórek olbrzymich - SYNCYTIÓW. Powstają one na
skutek naruszenia struktury lipidów błony komórkowej przez czynniki uszkadzające, obecne w osłonkach wielu
paramyksowirusów i herpeswirusów. Jądra powstałych komórek olbrzymich są zwykle uszkodzone, a czasem
nawet pozbawione błony jądrowej (tzw. nagie jądra HHV-1 i 2)
Wirus odry
- SYNCYTIA WCZESNE - powstajÄ… po wprowadzeniu do hodowli
dużych dawek wirusa i składają się wyłącznie z komórek zakażonych
wirusem
- SYNCYTIA PÓy
NE - powstają po użyciu niewielkiej ilości aktywnych
wirionów i składają się zarówno z komórek zakażonych, jak i
zdrowych
4. Do zniszczenia komórek dochodzi także w wyniku masowego uwolnienia potomnych wirionów, np. podczas
pączkowania wirusów Herpes z błony jądrowej, aparatu Golgiego, siateczki środplazmatycznej i błon
wakuolarnych
5. Charakterystyczne zmiany wewnątrzkomórkowe występują również po zakażeniu komórek wirusem SV40
(Simian Virus).
" Na infekcję tym wirusem komórki reagują kilkukrotnym powiększeniem swojej objętości i silną wakuolizacją
cytoplazmy.
Wtręty komórkowe:
" Ciałka wtrętowe są to skupiska replikujących się wirusów (zakażenie reowirusami) lub stanowią pozostałośd po
procesie replikacji wirusa (wirus opryszczki). MogÄ… one powstawad w jÄ…drze (wirusy Herpes - opryszczka),
cytoplazmie (Poxwirusy - ospa), bÄ…dz
w obu tych strukturach jednocześnie (Paramyksowirusy - odra).
1. Wtręty wewnątrzjądrowe:
" Typ A  wyraz
nie odgraniczone od chromatyny jÄ…drowej otaczajÄ…cÄ… je jasnÄ…
przestrzenią. Powstają one w jądrach komórek zakażonych wirusami: HHV-1 i 2, VZV
(ospa wietrzna  półpasiec), SuHV-1 (Suid herpesvirus 1 powodujący chorobę
Aujeszky ego).
" Typ B  nie posiadajÄ… wyraz
nie zaznaczonej granicy, w mniejszym stopniu zauważalne
są też zmiany morfotyczne w jądrze. Występują po zakażeniach wirusami: żółtej
febry, poliomyelitis, wschodniego i zachodniego kooskiego zapalenia mózgu.
2. Wtręty cytoplazmatyczne:
" Ciałka wtrętowe powstające w cytoplazmie są głównie pozostałością cyklu replikacyjnego wirusów i wykazują
powinowactwo do barwników kwaśnych lub zasadowych
" Ich obecnośd jest często bezspornym dowodem wystąpienia infekcji wirusowej, np.:
- w przebiegu wścieklizny w cytoplazmie zakażonych komórek wykrywane są ciałka Babesa i Negriego
- zaś w zakażeniach nosówką  ciałka wtrętowe Lentza
- wtręty cytoplazmatyczne wykrywa się również w komórkach nabłonkowych po zakażeniu wirusem
krowianki, czy wirusem nagminnego zapalenia przyusznic (świnki)
" Ciałka Negriego  okrągławe, podobne do erytrocytów ciałka wtrętowe spotykane w cytoplazmie
neuronów okolicy hipokampa i komórek Purkiniego móżdżku w przebiegu wścieklizny
" Ciałka Guarnieriego  w komórkach barwią się eozyną, wyglądają jak różowe pęcherzyki w
cytoplazmie zarażonych komórek nabłonkowych, znajdowane podczas badania mikroskopowego komórek
epitelialnych u osób zarażonych wirusem z rodziny Pokswirusów (np. wirusem ospy prawdziwej lub wirusem
krowianki)
Aberracje chromosomów:
" Następstwem zakażenia komórek przez wirusy może byd również uszkodzenie kariotypu
" Większośd stwierdzanych zmian ma charakter losowy i obejmuje pęknięcia, fragmentacje i translokacje
chromosomów
" Zmiany kariotypu wywoływane są m.in. przez wirus odry, VZV, adenowirusy, a także wirusy onkogenne
" Szczególnie niebezpieczne są zmiany kariotypu powodowane przez wirus różyczki i CMV (cytomegalowirus),
które prowadzą do poronieo lub do powstania wad rozwojowych u dziecka
Transformacja komórek:
" Zakażenie komórki wirusem onkogennym nie prowadzi do jej śmierci, lecz do nabycia przez nią nowych
właściwości biologicznych, przekazywanych również komórkom potomnym
" Okres produkcji wirusa ograniczony jest tylko długością życia tej komórki
" Transformacja komórki jest uzależniona od obecności w genomie wirusa genów odpowiedzialnych za ten proces
" Komórki transformowane cechują się wzrostem chaotycznym i wielowarstwowym, któremu zwykle towarzyszy
utrata zdolności hamowania kontaktowego i rozchodzenia się komórek na niezasiedlone miejsca
" Zmianie podlega też morfologia komórek i ich metabolizm
" Komórki transformowane mają zmniejszone wymagania odżywcze na niektóre składniki, np. surowicę
" Komórki transformowane wykazują się zwiększoną przemianą cukrową oraz produkcją kwasów organicznych i
mukopolisacharydów
" Transformacja komórek często obejmuje też występowanie losowych nieprawidłowości chromosomowych
(translokacje, inwersje i delecje), często spotykanych zwłaszcza w komórkach pewnych typów białaczek
" Do wirusów mających zdolnośd transformacji komórek prawidłowych należą np.: EBV (limfocyty B zakażone tym
wirusem podlegają ciągłej proliferacji), czy onkogenne retrowirusy (wirus mięsaka Rousa, mysiej białaczki
limfatycznej  MTLV-1)
Wirus EBV w strefie klimatu umiarkowanego wywołuje chorobę - mononukleozę zakaz
nÄ…, natomiast u afrykaoskich
dzieci jest przyczyną łagodnego nowotworu (Chłoniak Burkitta), zaś w południowych Chinach, głównie u mężczyzn
po 50 roku życia pełni rolę w rozwoju raka jamy nosowo-gardłowej. Około 25% chorych na chłoniaka Hodkina
posiada limfocyty B transformowane przez wirus EBV.