IMMUNOLOGIA  PRELEKCJA 2
[e-mail]
Budowa immunoglobulin
część zmienna
VH
CH1 VL
Fragment Fab
CL
papaina
(powstaje Fab+Fab+Fc)
CH2
Fragment Fc
CH3
1. Ig sÄ… zbudowane z:
- 2 łańcuchów ciężkich (H-heavy, zaznaczone na niebiesko)
·ð WystÄ™pujÄ… w piÄ™ciu postaciach różniÄ…cych siÄ™ budowÄ…:
Ä… (alfa), ´ (delta), µ (epsilon), Å‚ (gamma), ź (mi)
·ð dziÄ™ki temu możemy wyróżnić pięć klas immunoglobulin (IgA,D,E,G,M)
·ð drobne różnice Å‚aÅ„cucha ciężkiego w obrÄ™bie tej samej klasy pozwalajÄ… nam
rozróżnić podklasy (np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 )
- 2 łańcuchów lekkich (L-light, zaznaczone na zielono)
·ð WystÄ™pujÄ… w dwóch postaciach: typu º (kappa) lub typu  (lambda)
2. W łańcuchach lekkich i ciężkich można wyróżnić:
- część zmienna (V) każdego łańcucha składa się z:
- 3 regionów hiperzmiennych
- zwane inaczej CDR  regiony determinujÄ…ce dopasowanie
- determinują swoistość przeciwciał (wiążą antygeny)
- 4 regionów zrębowych (frame regions  FR)  przylegają do hiperzmiennych
- części stałe (C)
- łańcuch lekki ma jedną domenę w części stałej (CL)
- łańcuchy ciężkie posiadają różną ilość domen w części stałej: CH1, CH2&
 FR
VH CDR 1,2,3
VL
CH1
CL
H
Region zawiasowy
CH2
domeny
CH3
*domena = obszar homologiczny
- 110 aminokwasowa sekwencja + pętle 60 aminokwasów zamknięte mostkami S-S
- VH i CH  domeny łańcucha ciężkiego
- VL i CL  domeny łańcucha lekkiego
Części stałe w IgA,G,D zawierają po 3 domeny
Części stałe w IgE i IgM zawierają po 4 domeny (dodatkowa domena zamiast regionu zawiasowego)
A
ańcuch Lekki = VL + CL
A
ańcuch Ciężki:
Ä… = VH + CH1 + zawias + CH2 + CH3 + ogonek IgA
Å‚ = VH + CH1 + zawias + CH2 + CH3 IgG
´ = VH + CH1 + zawias + CH2 + CH3 + ogonek IgD
µ = VH + CH1 + CH2 + CH3 + CH4 IgE
ź = VH + CH1 + CH2 + CH3 + CH4 + ogonek IgM
W IgA i IgM występuje ogonek który umożliwia im tworzenie form polimerycznych
3. W wyniku trawienia papainą przeciwciało można również podzielić na
- fragment Fab (Fragment Antigen Binding)
- zawiera miejsca wiążące antygen (paratop)
- paratop jest idealnie dopasowany do epitopu
- fragment Fc  (Fragment Cristallizable)
- krystalizujÄ…cy
- zawiera odcinki odpowiedzialne za aktywacje dopełniacza
- pełni funkcje efektorowe i transportowe
- fragment zawiasowy H
- w pobliżu miejsca trawienia
- zawiera wiązania dwusiarczkowe (3-11) które łączą oba łańcuchy ciężkie
- pozwala na ustawienia fragmentów Fab pod różnym kątem
BIOSYNTEZA PRZECIWCIAA

1) A
AC
CUCH LEKKI
Chromosom 2 - Locus łańcucha lekkiego kappa
- zawiera 40 genów dla V łańcucha lekkiego
- 5 genów kodujących J
- pojedynczy odcinek kodujący fragment stały (C) łańcucha lekkego
Chromosom 22  Locus łańcucha lekkiego lambda
- 30 genów V
- 4 geny J
- 4 geny C
LOCUS A
AC
CUCHA LAMBDA
V1 V2 & & . V39 V40 J1 J2 J3 J4 J5 C
REKOMBINACJA GENÓW
Pojedynczy gen V (np.V2) zostaje
Przyłączony do genu J (np.J4), tworząc
W ten sposób pełny region VJ.
DNA znajdujące się między V2 i J4 zostaje
Usunięte w formie cyrkularnej
V1 V2J4 J5 C
TRANSKRYPCJA
V2 J4 C
Pre-mRNA
SPLICING
mRNA
V2 J4 C
TRANSLACJA
łańcuch białka
2) A
AC
CUCH CI
ŻKI
Locus na chromosomie 14
Oprócz genów VH które kodują reszty aminokwasowe od 1-94 i segmentów JH kodujących reszty od 98-113,
ten odcinek chromosomu zawiera odmienny zestaw segmentów kodujących reszty od 95-97. Te segmenty są
oznaczone literą D (D-diversity, zmienność)
V1 & & .V4& & & V51 D1 & . D8 D9 & & & D27 J1 J2 & .. J6 Cź C´ CÅ‚3 CÅ‚1 CÄ…1 CÅ‚2 C Å‚4 Cµ CÄ…
REARANŻACJA: POA

CZENIE D-J
REARANŻACJA: POA

CZENIE V-DJ
KOMBINATORYKA SEGMENTÓW
1) Lańcuch Lekkie
a. kappa
- 40 segmentów V
- 5 segmentów J 40x5 = 200 różnych genów Vº
b. lambda = co najmniej 120 łańcuchów
c. razem 320 różnych łańcuchów
2) A
ańcuchy ciężkie
- 51 V
- 27 D 8262 kompletnych genów VH
- 6 J
3) Możliwość połączenia każdego z 320 łańcuchów lekkich z 8262 łańcuchami H daje potencjalną
liczbę 2,6x106 przeciwciał o różnej swoistości
4) Dodatkowo mogą wystąpić mutacje somatyczne co zwiększa liczbę do ok. 2,6 x 107-108
ZMIANA KLAS
Pierwsze Ig wytwarzane przez limfocyty B w trakcie rozwoju osobniczego należą do klasy IgM. Póz
niej
pojawiają się IgD i obie klasy umiejscawiają się w błonie limfocytów, jako ich receptory. Na tym etapie
różnicowania (faza G0 cyklu) limf. B mają receptory IgM oraz IgD posiadające identyczne części zmienne a
więc identyczną swoistość. Po złączeniu ze swoistym antygenem limfocyt wchodzi w fazę G1 i ze
współudziałem czynników uwalnianych przez limfocyt T proliferuje i uwalnia wolne przeciwciała.
Początkowo IgM, póz
niej IgG i inne, z zachowaniem tej samej swoistości.
W jaki sposób dochodzi do wytwarzania różnych klas przeciwciał o tej samej swoistości? Okazało się ze
geny dla części stałych łańcuchów ciężkich leżą w odpowiedniej kolejności:
ź --- ´ --- Å‚3 --- Å‚1 --- Ä…1 --- Å‚2 --- Å‚4 --- µ --- Ä…2
1) Pobudzony antygenem limfocyt B prezentuje go (przy udziale MHCII) limfocytowi T
2) Następuje ekspresja glikoproteiny CD40L na limfocytach T która jest ligandem dla CD40 limf. B
3) W tym samym czasie czÄ…steczka CD80 limfocytu B Å‚Ä…czy siÄ™ z CD28 na limf. T
4) Następuje wytwarzanie interleukin przez limfocyt T
5) Przekazanie sygnału dla limfocytu B przy udziale:
a. Interleukin
b. Bezpośrednio przez CD40L i CD40
Te dwa sygnały umożliwiają limfocytowi B zmianę klasy z IgM na inną, w zależności jaki czynnik wydzieli
limofocyt
TGF-² IL-4 TGF-²
IL-10 INF-Å‚ IL-13 IL-10
ź ´ Å‚3 Å‚1 Ä…1 Å‚2 Å‚4 µ Ä…2
IL
CD28 CD80
LIMF. T LIMF. B
TCR MHCII
CD40L CD40
Właściwości immunoglobulin
IgG IgA IgM IgD IgE
Liczba cz. cztero
1,2
1 5 1 1
łańcuchowych
S-IgA (secretory)
A
aÅ„cuch ciężki Å‚ Ä… ź ´ µ
A
aÅ„cuch lekki º lub  º lub  º lub  º lub  º lub 
Wartościowość
2 2,4 2,10,12 2 2
dla antygenu
Stężenie w 5*10^-9
8-16 mg/ml 1-4,4 mg.ml 0,5-2 mg/ml 0-0,04 mg/ml
surowicy
mg/ml
% Ig surowicy 80 13 6 0-1 0,002
WiÄ…zanie
+ - +++ - -
dopełniacza
Przechodzenie
++ - - - -
przez łożysko
WiÄ…zanie z kom.
tucznymi i - - - - +
neutrofilami
WiÄ…zanie z
monocytami i ++ - - - -
makrofagami
Czas półtrwania
23 5,5 5,1 2,8 2
(dni)
Występowanie w
+ + 0-ślad - -
mleku
Właściwości podklas IgG
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
% całkowitego IgG
43-75 16-48 1,7-7,5 0,8-11,7
Przechodzenie
+ + + +
przez łożysko
Ag białkowe
++ +/- ++ +/-
Ag
+ ++ (-) (-)
polisacahrydowe
Alergeny
+ (-) (-) +
Akt dopełniacza
++ + +++ (-)
A
ączenie się IgG z docelowymi komórkami poprzez receptor dla fragmentu Fc (Fcł R)
·ð FcÅ‚ RI (CD64): monocyty, makrofagi, neutrofile, kom. dendrytyczne
·ð FcÅ‚ RII (CD32): monocyty, makrofagi, neutrofile, eozynofile, trombocyty, limf. B, kom.
dendrytyczne, kom. endotelialne
·ð FcÅ‚ RIII (CD16): neutrofile, eozynofile, makrofagi, komórki NK, limf. T
Markery antygenowe immunoglobulin  umożliwiają klasyfikację
Izotypy  występowanie Ig z uwzględnieniem zróżnicowania w budowie łańcuchów ciężkich i
lekkich, umożliwiające podział na klasy i typy.
Allotypy  występowanie różnic w obrębie części stałych łańcuchów ciężkich i lekkich (głównie
ciężkich) różnych aminokwasów w określonych pozycjach łańcucha peptydowego.
Idiotypy  występowanie różnic w obrębie części zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich.
Przeciwciała monoklonalne
Przeciwciała monoklonalne to przeciwciała o tym samym izo-, allo- oraz idiotypie, produkowane przez ten
sam klon limfocytów B i plazmocytów. Możemy dzięki nim otrzymywać w dużych ilościach przeciwciała o
dużej swoistości. W tym celu immunizujemy zwierzę, np. mysz danym antygenem, po czym łączymy jej
limfocyty B z komórką szpiczaka (nowotworu pochodzącego z szeregu rozwojowego limfocytów B), w
której brak HGRPTazy. Zachodzi fuzja tych dwóch komórek, wskutek czego otrzymujemy hybrydy 
komórki hybridoma. Następnie oczyszczamy hybrydę z komórek szpiczaka stosując medium HAS
(hipoksantyna-aminopterydyna-tymidyna) przez co zabijamy komórki nowotworowe  hybrydy mają
HGPRTazę dzięki czemu przeżywają. Następnie przeprowadzamy testy swoistości wobec antygenu
przeciwko któremu dane próbki komórek hybridoma produkują przeciwciała. Po uzyskaniu odpowiednio
swoistego klonu możemy go namnażać in vitro bądz
in vivo. Limfocyt B określa swoistość hybrydy,
natomiast szpiczak jako  motor napędowy nadaje jej  nieśmiertelność i dostarcza rybosomów i aparatu
Golgiego niezbędnego do syntezy białek.
Zastosowanie przeciwciał monokolonalnych:
·ð diagnostyka mikrobiologiczna chorób zakaz
nych, nowotworów, białaczek, chłoniaków, chorób
autoimmunologicznych
·ð immunotoksyny (Ig+toksyna zabijajÄ…ca komórke np. raka)
o rycyna i dyfterotoksyna (wystarczy 1 cz. żeby zniszczyć komórke)
·ð oznaczanie stężeÅ„ biaÅ‚ek i leków w pÅ‚ynach ustrojowych
·ð typowanie tkanek i krwi
·ð ocena ukÅ‚adu odpornoÅ›ciowego
·ð oznaczanie stężenia hormonów
·ð terapia  uwaga na HAMA  human anti-mouse antibodies, p/ciaÅ‚a wytwarzane przez nasz organizm
przeciwko białkom pochodzącym bądz
co bÄ…dz
z mysich komórek
o np. OKT 3  skierowane przeciw CD3 limfocytów T  niszczenie LimfT - immunosupresja
Preparaty immunoglobulinowe:
·ð ludzkie
·ð obcogatunkowe
·ð chimerowe  33% mysie (od strony Fab) + 67% ludzkie
·ð humanizowane, 5-10% mysie (od strony Fab), reszta ludzka
Stosowane preparaty immunoglobulinowe:
·ð Ig ludzkie nieswoiste  od osób nieimmunizowanych (zlewanie surowicy od minimum 1000
dawców i pobieranie z niej przeciwciał)  leczenie pierwotnych i wtórnych niedoborów
odpornościowych typu humoralnego, zakażeń bakteryjnych i wirusowych zagrażających życiu,
profilaktyka WZW typu A i odry.
·ð Ig ludzkie swoiste (o wysokiej zawartoÅ›ci przeciwciaÅ‚)  przeciw HBV (antygen HBSPa), VZV
(odra, półpasiec), wirusowi kleszczowego zapalenia mózgu, wirusowi wścieklizny, CMV
(cytomegalia), toksynie tężcowej, Ig anty Rh
Immunoglobulina Skład Wskazania
anty TNF-alfa chimerowe terapia RZS, choroby Crohna,
colitis ulcerosa
anty HER 2 humanizowane terapia raka piersi z przerzutami
przeciwko receptorowi aktywnych chimerowe terapia i profilaktyka ostrych
płytek krwi (GP IIb/IIIa) stanów niedokrwiennych serca
przeciwko receptorowi CD20 humanizowane leczenie chłoniaków pochodzących
z limfocytów B
anty CD 52 humanizowane przewlekła białaczka limfocytarna
anty IgE humanizowane nadwrażliwość typu I
przeciwko receptorowi CD25 (IL- humanizowane profilaktyka ostrego odrzucenia
2R) przeszczepu
anty CTLA4 humanizowane terapia RZS, melanoma
Testy Immunologiczne
Istnieje wiele odmian testów immunologicznych
" wszystkie polegają na zajściu reakcji wiązania się antygenu ze swoistymi
(rozpoznającymi go) przeciwciałami,
" różnią się natomiast sposobem wykrywania tej reakcji.
Testy immunologiczne bezpośrednie Testy immunologiczne pośrednie
wykrywają określony antygen przy wykrywają immunoglobuliny, które uprzednio
pomocy znakowanych przeciwciał. związały się ze swoistym antygenem.
Antygeny wirusowe czy bakteryjne Opierają się one na na założeniu, że jeśli
występują jednak często w ustroju w organizm kręgowca zetknął się z konkretnym
bardzo niewielkiej ilości, która antygenem, to w surowicy tego organizmu
znalazła by się poniżej progu detekcji. będą się znajdywały swoiste wobec tego
Z tego względu często stosuje się testy antygenu przeciwciała. Ponieważ
immunologiczne pośrednie wykrywające immunoglobuliny jako takie mają właściwości
immunoglobuliny, które uprzednio immunogenne (wywołują odpowiedz

związały się ze swoistym antygenem. immunologiczną), można uzyskać swoiste
przeciwciała skierowane wobec
immunoglobulin innego gatunku.
Charakteryzują się większą czułością, gdyż
wykorzystują naturalną zdolność układu
immunologicznego - amplifikację sygnału, jaki
dociera do układu immunologicznego w
postaci antygenu.
Odczyn precypitacji
Jest to odczyn w którym antygen jest w postaci rozpuszczonej, w przeciwieństwie do aglutynacji gdzie jest
upostaciowiony. Charakteryzuje go mniejsza czułość niż aglutynację. Wymaga udziału wielowartościowego
antygenu i co najmniej dwuwartościowego przeciwciała tak jak w aglutynacji. Musi być także zachowany
odpowiedni stosunek antygen:przeciwciało, ponieważ reakcja najlepiej zachodzi w strefie ekwiwalencji
ilościowej ich stężeń. W strefie nadmiaru antygenu bądz
przeciwciała tworzą się rozpuszczalne kompleksy
immunologiczne.
Podział precypitacji:
·ð W Å›rodowisku pÅ‚ynnym  USR, VDRL stosowane w screeningu kiÅ‚y (nie musi być swoisty, ale
czuły, bowiem dodatni wynik zawsze weryfikujemy).
·ð W Å›rodowisku półpÅ‚ynnym (w żelu)
o Immunodyfuzja podwójna
o Immunodyfuzja pojedyncza
o Immunoelektroforeza
·ð Western-blot
·ð Nefelometria
·ð Turbidymetria
Percypitacja w środowisku płynnym
Metody te są głównie jakościowe. Zalicza się do nich np. wykrywanie antygenów Baccillus antracis
(wąglik) w skórach i innych tkankach zwierzęcych  tzw. odczyn Ascoliego. Antygen jest ekstrahowany z
tkanki, po czym przeprowadza się reakcję surowicy odpornościowej z roztworem zawierającym antygen.
Powstanie pierścienia precypitacyjnego oznacza wynik dodatni.
Odczyny nieswoiste  USR, VDRL  stosujemy w
screeningowej serodiagnostyce kiły. Poszukiwanym
antygenem są reaginy kiłowe. Są to tzw. odczyny
kłaczkujące. Ponieważ jest to metoda screeningowa,
aby potwierdzić wynik pozytywny musimy w następnej
kolejności przeprowadzić swoisty test TPHA.
Precypitacja w żelu
Immunodyfuzja pojedyncza - reakcja dyfuzji radialnej wg Manciniego
- służy do ilościowej oceny antygenu
- przeciwciała unieruchomione są w żelu agarowym, antygen dyfunduje
- metoda ta znalazła zastosowanie w ilościowym oznaczaniu stężenia immunoglobulin w surowicy, a także
składników dopełniacza (C3, C4) oraz niektórych białek ostrej fazy (transferyna, laktoferyna).
Reakcja podwójnej dyfuzji wg Ouchterlony ego
- dyfundują cząsteczki antygenu i przeciwciała
- Jest to metoda pozwalająca określić stopień pokrewieństwa antygenów
test Elecka  służy do badania toksyczności maczugowca błonicy - nie wszystkie szczepy tej bakterii są
toksyczne. Przeciwciało przeciwko toksynie maczugowca umieszczamy na bibułce filtracyjnej, a prostopadle
do niego nanosimy bakterie. Tworzenie  wąsów precypitacyjnych oznacza że dany szczep jest toksyczny.
Immunoelektroforeza
Jest to metoda jakościowa i półilościowa, oceniamy łuki precypitacyjne, prowadzimy ją na szkiełku
pokrytym żelem. Po wycięciu otworów dla surowic (badanej i kontrolnej) najpierw zachodzi elektroforeza
białek, a po niej wycinamy rowki do których dodajemy przeciwciała  zachodzi immunoprecypitacja. Po
wybarwieniu interpretujemy wynik.
Immunoelektroforeza wg Grabara jest metodą półilościową, pozwalającą na diagnozę hiper-, nipo- bądz

agammaglobulinemii. Stosujemy tu surowicę badaną i kontrolną wg. powyższego opisu. Aby zdiagnozować
w/w gammapatie porównujemy obraz prawidłowej surowicy kontrolnej oraz surowicy pacjenta.
Immunoelektroforeza służy także diagnozowaniu szpiczaka mnogiego, gdzie za pomocą swoistych
przeciwciał wykrywamy i identyfikujemy białko monoklonalne, używając jako odniesienia odpowiedniego
wzorca.
surowica kontrolna
rowek z przeciwciałami
surowica badana
Western-blot
Metoda ta służy do wykrywania antygenu i przeciwciała, częściej przeciwciała
1) Elektroforeza próbki na żelu poliakryloamidowym z SDS
2) Rozdzielone białka przenosimy (przez odciśnięcie  ang. Blotting) na filtr nitrocelulozowy, na
którym białko ma lepsze warunki do reakcji z przeciwciałem (przeciwciało jest fabrycznie
naniesione na nitrocelulozę w formie pasków)
3) Powstały kompleks antygen-przeciwciało wykrywamy przemywając go drugim przeciwciałem,
specyficznym dla pierwszego, które dodatkowo jest znakowane radioaktywnie (albo enzymatycznie)
4) Uwidocznienie reakcji na kliszy rentgenowskiej - autoradiogram
Wykrywamy głównie
1) HCV
2) HIV  screeningowo wykonujemy test metodą ELISA obarczony sporym błędem pomiarowym
(wyniki fałszywie dodatnie), Western-blot służy potwierdzeniu wyniku. Często używa się
sonifikowanego (rozbitego ultradz
więkami) wirusa, którego fragmenty służą jako wzorcowe
antygeny  wyłapujące przeciwciała w surowicy krwi. Powstałe kompleksy immunologiczne
wykrywamy surowicą antyglobulinową sprzężoną z enzymem  oznaczamy stężenie produktu
reakcji enzymatycznej.
3) Techniką tą możemy także wykrywać antygen, co zostało wykorzystane w diagnostyce zakażenia
prionami w BSE. Zasada metody polega na denaturacji białek proteazami, na które wrażliwy jest
nawet obecny fizjologicznie w komórkach prion. Trawieniu nie podlegają jedynie priony
chorobotwórcze, które następnie wykrywane są za pomocą swoistych przeciwciał.
4) Zastosowanie także w diagnostyce boreliozy a także zakażenia Helicobacter pylori, jedynego
bakteryjnego karcynogenu klasy I  rozłożone elektroforetycznie antygeny H. pylori (w tym CAK-2)
wiążą się ze swoistymi przeciwciałami.
Nefelometria
Jest to metoda ilościowego oznaczania białek polegająca na pomiarze natężenia światła rozproszonego w
roztworze zawierającym kompleksy immunologiczne. Zaletą metody jest łatwość i krótki czas wykonania.
Zastosowanie diagnostyczne: oznaczanie immunoglobulin (G, A, M), składowych dopełniacza (C3, C4),
białek ostrej fazy (alfa1-IP, ceruloplazmina, CRP), albuminy.
Turbidymetria
Jest to metoda ilościowego oznaczania białek polegająca na pomiarze spadku natężenia światła po przejściu
przez zawiesinÄ™ zawierajÄ…cÄ… kompleksy immunologiczne. Zastosowanie diagnostyczne: oznaczanie
immunoglobulin, składowych dopełniacza, białek ostrej fazy.