Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
Hybrydyzację stosuje się w celu:
le
d
o
a. Wzbogacania
genotypów
obecnie
stosowanych,
-G
(upośledzonych genetycznie) sz
aczepów przemysłowych w
k
wartościowy materiał genetyczny pozyskany ze środowiska
c
naturalnego
ło
b
a
b. Krzyżowania szczepów pochodzących z różnych linii
Z
mutacyjno-selekcyj
a nych, zwłaszcza wywodzących się od
w
różnych przodków.
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
Hybrydyzacja naturalna i związana d z nią rekombinacja
o
genów, prowadząca do powstawania nowych ich kombinacji,
-G
może zachodzić w wyniku:
a
k
c
a. rozmnażania płciowego (typowego dla Eukariota)
ło
b
a
b. paraseksualnych
procesów
(źródło
rekombinacji
u
Z
Procaryota ale równ
a ież u niektórych gatunków grzybów)
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
I. Procesy paraseksualne u bakterii
w
le
d
o
Są trzy sposoby przekazywania cech u bakterii, różniące się
-G
jedynie sposobem przenoszenia inform
a acji genetycznej:
k
a. koniugacja
c
ło
b. transdukcja
b
a
c. transformacja
Z
a
Komórka w której nastąpiła rekombinacja nazywa się
w
rekombinantemr E
r. D
p
O
a
sk
Dawca (F+) – zawiera czynnik płciowy – plazmid F i może wytwarzać pili w
płciowe
le
d
o
Biorca (F-) - nie ma czynnika F, podczas koniugacji może uzyskać ten czynnik, stać się dawcą i wytwarzać pili płciowe
-G
a
k
c
ło
b
a
Z
a
w
Mechanizm replikacji typu toczącego się koła
Nowo syntetyzowany DNA
r E
r. D
p3’ OH
O
5’ P
Odsunięta nić DNA
Transdukcja bakteriofagami
sk
w
Fag replikujący się w bakterii w trakcie cyklu litycznego tnie le
bakteryjny chromosom. W trakcie skład
dania nowych cząstek
o
wirusowych zamiast DNA fagowego do główki fagowej może zostać
-G
omyłkowo zapakowany fragment DNA
a bakteryjnego.
k
Zainfekowanie taką cząstka wirusową kolejnej komórki bakteryjnej c
powoduje wprowadzenie do nie
ł j
o fragmentu DNA innej bakterii, a
b
więc nie spowoduje ani lizogenii ani lizogennego wzrostu.
a
Z
a
w
Wprowadzony obcy DNA albo włącza się do chromosomu w
wyniku homologic
r E
znej rekombinacji, albo zostanie utracony.
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
Po wniknięciu nowego rodzaju DNA do kom
d órki bakteryjnej,
o
zawsze powstaje tylko jeden rodzaj nowego genotypu. Wynika to
-G
z haploidalnego charakteru bakterii.a
k
c
Zmieniony genotyp ujawnia s
ł ię
o od razu fenotypowo.
b
a
Z
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
Istnieją dwa różne mechanizmy włączania do chromosomu lub
d
plazmidu, obcego , pobranego przez komó
o rkę DNA:
-G
a. rekombinacja ogólna lub homolo
a giczna
k
c
ło
b
b.
rekombinacja
zależn
a a od miejsca lub sekwencji
(rekombinacja zlokalizo
Zwana) – wymaga jedynie krótkiego
a
odcinka homologii DNA, koniecznej do rozpoznania się partnerów w
(np. integracja bakteriofaga lambda i plazmidu płciowego F , r E
rekombinacji związanych z ruchomymi elementami genetycznymi
- sekwencje insercyjne, transpozony, bakteriofag Mu).
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
II.A. Procesy płciowe u grzybów
w
le
d
o
Grzyby z klasy Zygomycetes, Ascomyc- ete
G s, Basidiomycetes mają
a
pełny cykl płciowy na który składają się:
k
a.
plazmogamia
c
ło
b.
kariogamia
b
c.
mejoza.
a
Z
a
U poszczególnych gatunków istnieją różnice dotyczące czasu
w
trwania, rozdzielenia czasowego i przestrzennego
r E
poszczególnych faz, poza tym u niektórych gatunków przez
pewien czas grzybnia wegetatywna może trwać w fazie
r. D
dikarion
p u.
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
Grzyby strzępkowe dzielimy na:
le
d
a. Heterotalliczne (rozdzielnopłciowe) o
-G
a
b. Homotalliczne (samozgodne) k
c
ło
b
a
Rekombinacja genów zachodzi podczas:
Z
a
a. mejozy
w
b. rzadziej podczas mitotycznych podziałów komórek
r E
diploidalnych
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
Wykorzystanie procesów płciowych u grzybów w pozyskiwaniu
le
szczepów biotechnologicznych napotyka na liczne trudności:
d
o
a.
procesy płciowe występują tylko u
-G nielicznych gatunków
a
przemysłowych
k
c
b.
procesy płciowe zachodzą raczej z małą częstotliwością
ło
b
a
Z
Opracowano metody otrzymywania krzyżówek na drodze
a
wegetatywnej met
wodą fuzji protoplastów
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje genetyczne sk
II.B. Procesy paraseksualne u grzybów
w
le
d
U organizmów prostych, takich jak grzyby, m
o ogą zachodzić procesy
paraseksualne, polegające na rekombinacji somatycznej. Proces
-G
ten stwierdzono m.in. u Penicillium, Asp
a ergillus.
k
c
Osobniki powstaj
ło
ące w wyniku procesu paraseksualnego różnią się
b
zespołem cech od szczepów ro
a dzicielskich. Różnice te mogą
dotyczyć:
Z
a
- kształtu lub barwy grzybni lub strzępek
w
- wytwarzania enzymów
r E
- wytwarzania barwników
- wytwarzania antybiotyków.
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
d
o
Proces paraseksualny polega na łączeniu się zawartości
-G
strzępek dwóch szczepów h
aaploidalnych grzybów,
k
częściowej
kariogamii
i c mitotycznej rekombinacji
(powstaje bowiem pewna ło
liczba komórek diploidalnych),
b
a następnie do ich hap
aloidyzacji i segregacji materiału
genetycznego z wytw
Zorzeniem rekombinantów.
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
Etapy:
w
le
d
o
I.
Plazmogamia, a następnie segregacja heterokarionu
-G
podczas sporulacji
a
k
II.
Kariogamia z częstotliwoś
ccią 10-6 do 10-7 i wytworzenie
ło
diploidalnych jąder b
a
III. Mitotyczna segregacja materiału genetycznego
Z
(rekombinanty p
a owstają z częstotliwością ok. 10-3) i
dalsze rozmna
wżanie wegetatywne.
r E
Mała częstotliwość rekombinacji w procesie
paraseksualnym powoduje ograniczone jego
r. D
zas
ptosowanie.
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
Fuzja protoplastów
sk
w
le
d
Częstotliwość naturalnej hybrydyzacji to 10-3 do 10-6 co wyklucza o
możliwość bezpośredniego zastosowania tej metody w
-G
pozyskiwaniu nowych szczepów.a
k
c
Główną, fizyczną przeszkodą w
ło plazmogamii komórek jest:
b
a
a. sztywna ściana komó Z
rkowa, która stanowi również barierę
a
niezgodności, uniemożliwiającą fuzje międzygatunkową
w
komórek
b. Ujemny poten
r E
cjał po zewnętrznej stronie błony
cytoplazmatycznej
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
Opracowanie techniki fuzji protoplastów umożliwiło praktyczne d
wykorzystanie
rekombinacji
w
oulepszaniu
szczepów
przemysłowych.
-G
a
k
c
Podczas fuzji powstaje układ heterokariotyczny, w którym z dużą ło
częstotliwością (nawet 10-20
b%) może zachodzić kariogamia i
a
rekombinacja.
Z
a
Udoskonalenie metod
w trawienia ścian komórkowych pozwala
obecnie
uzyskać
protoplasty
prawie
wszystkich
komórek
r E
mikroorganizmów.
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
d
o
Trawienie ściany komórkowej:
-G
a
- bakterie G(+) w tym promieniowce – lizozym
k
c
- bakterie G(-) - lizozym + EDTA
ło
b
- grzyby (w tym drożdże) - sok żołądkowy ślimaka Helix a
pomatia lub drobnoustrojowe enzymy lityczne ( Cytophaga sp., Z
Arthrobacter sp, Tricho
a derma viridis)
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
1. Zawiesina świeżych protoplastów
le
d
o
-G
a
k
c
2. Agregacja protoplastów w obełcn
o ości
b
PEG i Ca2+
a
Z
a
3. Rozcie
w
ńczanie zawiesiny protoplastów
– usuwanie PEG,
r E
widoczne większe
formy są wynikiem fuzji 2 lub większej
liczbycej proto
r. D
plastów
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
d
Selekcja rekombinantów wymaga użycia ge
o netycznie utrwalonych
rekombinantów fizjologicznych, naj
-Gczęściej są to szczepy:
a
k
c
a. auksotroficze,
ło
b. stosuje się również markery
b oporne na różne czynniki
a
chemiczne
Z
c.
lub markery morfologiczne (np. pigmentowe)
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
Zalety protoplastyzacji i fuzji protoplastów:
w
le
a.
wewnątrzgatunkowa fuzja i rekombinacja pomiędzy szczepami o
d
tym samym typie płciowym
o
b.
rekombinacja międzygatunkowa
-G
a
c.
rekombinacja więcej niż dwóch genotypów, przy znacznym
k
zwi
c
ększeniu częstości rekombinacji i krótkim czasie trwania
ło
eksperymentu (w pojedynczym doświadczeniu)
b
d.
wymiana du
a
żych fragmentów DNA, przy czym każdy z
Z
genotypów rodzicielskich może być zarówno dawcą jak i biorcą
a
e.
ułatwiona transformacja plazmidowym DNA i transfekcja
w
fagowa
r E
f.
możliwość fuzji protoplastów z liposomami zawierającymi obcy
materiał genetyczny
r. D
g.
możliwoś
p ć fuzji z organellami komórkowymi np. mitochondriami
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
Technologia rekombinacji DNA in
sk vitro
w
le
d
Technologia
rekombinacji
DNA
in
o
vitro
pozwala
na
manipulowanie materiałem genetyc-G
znym na poziomie genu w
a
sposób całkowicie kontrolowany p
k rzez eksperymentatora.
c
ło
Metoda ta pozwala na:
b
a
Z
a. otrzymywanie kombinacji genów nie występujących w naturze
a
w
b. uzyskiwanie organizmów transgenicznych z bakterii, drożdży, grzybów strzęp
r E
kowych, roślin i zwierząt
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
d
o
Technologia rekombinacji DNA
-G in vitro wykorzystuje
a
różnorodne techniki manipulacji materiałem genetycznym np. :
k
c
ło
a. chemiczną syntezę genów
b
b.
reakcję polimeryzacji łań
a cuchowej (PCR)
c.
syntez
Z
ę cDNA
a
d.
hybrydyzację DNA-DNA i DNA-RNA i inne
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
Rekombinacja DNA in vitro polega na przen
w oszeniu genów z
jednego organizmu do drugiego i otrzym
leywaniu tzw. klonów
d
komórek, które są zdolne do synte
ozy nowego homo- lub
heterologicznego białka.
-G
a
k
Technika ta wymaga pew
cnych podstawowych narzędzi
pozwalaj
ło
ących na:
b
a
a. wycinanie i łączenia fragmentów DNA
Z
b.
syntezę DNA oraz
a wektorów, dzięki którym możliwe jest
wprowadzenie gen
wów do komórek nowego gospodarza i ich
ekspresja. r E
Narzędzia
r. D
mi tymi są liczne enzymy, specyficzne dla danego p
procesu.
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
Enzymy stosowane w technikach rekombinacji in vitro:
le
d
o
a. Restryktazy (endonukleazy restrykcyjne) - podstawowe
-G
narzędzie do fragmentacji dużych cząsteczek DNA i
a
generowania tzw. fragmentów
krestrykcyjnych, które mogą w
c
dalszym etapie być powtórnie włączone według ściśle
ło
zaplanowanej kolejności i
b kierunku.
a
b. Metylazy
- są enzymami towarzyszącymi enzymom
Z
restrykcyjnym, two
a rząc razem system restrykcji/modyfikacji,
chroniący bakte
wrie przed inwazją obcego DNA. W
technologii rekombinacji DNA wykorzystuje się metylazy do
r E
zabezpieczania niektórych miejsc restrykcji przed ich
trawien
r. D
iem restryktazami.
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
c. Egzonukleazy – hydrolizują jednoniciowe DNA i RNA, nie
le
hydrolizują dwuniciowego DNA.
d
o
d. Alkaliczna fosfataza – usuwani
-Ge 5’ terminalnej grupy
a
fosforanowej z kwasów nukleinow
kych
c
ło
e. Polimerazy DNA
–b wykorzystywane do syntezy
a
dwuniciowego DNA na matrycy jednoniciowego DNA.
Z
a
f. Odwrotna transkryp
w taza – syntetyzuje DNA komplementarny
(cDNA) do matrycy mRNA. Enzym używany jest do syntezy
r E
cDNA z mRNA w celu klonowania genu lub wykorzystania
jako sondy
r. D
genetycznej.
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
g. Ligaza – łączyb polinukleotydy ufosforylowane w pozycji 5’ do le
polinukleotydów posiadających wolne grupy 3’-OH (3’-
d
hydroksylowe).
o
-G
a
h. Rybonukleazy – wykorzystywan
k e są do hydrolizowania RNA
c
podczas wyodrębniania DNA z komórek drobnoustrojów oraz
ło
usuwania mRNA w technologi
b i syntezy cDNA
a
Z
i. Enzymy lityczne
–
najczęściej stosowane to lizozym,
a
mutanolizyna, celulazy
w , chitynazy, enzymy lityczne Streptomyces,
ślimaka Helix pomatia. Służą do łagodnej lizy ścian komórkowych r E
drobnoustrojów i komórek roślinnych (podobnie jak w technice otrzymywan
r. D
ia
protoplastów)
podczas
izolacji
DNA
p
chromosomalnego i plazmidowego, które w dalszych etapach O
wykorzystuje się do manipulacji genetycznych.
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
le
d
Wektory do klonowania genów w komó
o rkach bakterii – są to
ró
G
żnego rodzaju plazmidy zdolne do sam
- odzielnej replikacji, które
a
wykorzystuje się do klonowania genów i ich wprowadzania do k
komórek drobnoustrojów gospodar
czy.
ło
b
Wektory czyli przenośniki
a genów, ze względu na rodzaj
gospodarza można podzie
Zlić na bakteryjne, drożdżowe, grzybowe,
a
komórek roślinnych, owadzich i ssaczych.
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
Klonowanie genów – technika pozwalająca na
w wprowadzenie
genów do komórek mikroorganizmów lub org
leanizmów wyższych
d
w celu świadomej i ukierunkowanej modyf
oikacji ich genotypów.
-G
Izolacja lub synteza genu
Wektor
a
k
c
Linearyzacja wektora
ło
Łączenie genu z wektorem
b
(rekombinacja DNA)
a
Z
Wprowadzani
ae rDNA do komórek gospodarza
w
r E
Selekcja klonów zawierających rDNA
r. D
p
Praktyczne wykorzystanie otrzymanych klonów
O
(produkcja białka lub metabolitów komórkowych)
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
Najtrudniejszym etapem klonowania jest izolowanie lub synteza le
genów.
d
o
Obecnie stosuje się kilka podstawowyc
-Gh procedur:
a
k
a. cięcie losowe DNA (shot-gun cloning)
c
ło
b. synteza cDNA
b
a
c. synteza chemiczna i synteza metodą PCR.
Z
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do ko
wmórki
le
d
W tym celu stosuje się różne techniki w za
o leżności od organizmu
gospodarza:
-G
a
k
a. Transformację komórek kompe
ctentnych
ło
b. Transformację protoplastów
b
c. Elektroporację (elektrotrn
asformację)
d. Transfekcję
Z
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
w
Identyfikacja genu w komórce biorcy:
le
d
a. Ekspresja genów i ujawnienie fenotyp
o owe cechy
-G
a
b. Przy braku ekspresji do k detekcji genu używa się
c
znakowanych sond oligonukleotydowych o sekwencjach
ło
komplementarnych do se
bkwencji poszukiwanego fragmentu
a
genu oraz techniki kolonijnej hybrydyzacji DNA-DNA.
Z
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – rekombinacje a genetyczne
sk
Wykorzystanie rekombinowanych szczepów w b
wiotechnologii:
le
d
a. Produkcja wydzielanego przez przysad
o kę mózgową hormonu
wzrostu (somatotropiny) przez szc-ze
Gp E.coli
a
b. Produkcja insuliny przez szczep E.coli
k
c. Produkcja czynników krzepliw
c ości krwi przez szczep E.coli
ło
d. Produkcja
rekombinowanych
immunoszczepionek
b
(stosowanych do szczep
aień ochronnych ludzi i zwierząt) np.
przeciw WZWB, wśc
Ziekliźnie, grypie i innym
a
e. Technologie
produkcji
enzymów,
białek
i
różnych
w
biopolimerów
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
Przechowywanie szczepów
sk
w
le
d
Podstawowym źródłem szczepów dla przemysłu są kolekcje
o
drobnoustrojów przemysłowych.
-G
a
W kolekcjach wymagane jest prowa
k dzenie systematycznych badań
c
nad:
ło
b
a.
pozyskiwaniem i ulepszaniem szczepów przemysłowych
a
b.
klasyfikacją
i
identyfikacją
metodami
klasycznymi
i
Z
genetycznymi
a
w
c. stabilnością właściwości biochemicznych przechowywanych
szczepów
r E
d.
doborem metod przechowalniczych, gwarantujących nie tylko r. D
przeżywalność
szczepu
ale
również
utrzymanie
cech
p
produkc
O yjnych.
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
W 1988 r. na kongresie w Waszyngtonie postanowiono że:
le
d
o
a. szczepy stanowiące przedmiot publikacji naukowych, powinny
-G
być deponowane w kolekcjach ku
a ltur, powinny być dostępne
k
dla środowiska naukowego
c
b.
przechowywane szczepy powinny być preparatami aktywnymi,
ło
b
o stałych cechach fizjologicznych i aktywności produkcyjnej
a
Z
Na świecie istnieje wi
aele kolekcji zrzeszonych w Światowej
w
Federacji Kultur (World Federation of Culture Collections –
WFCC), której
r E
siedziba znajduje się w Japonii. Wykaz kolekcji
zrzeszonych w WFCC zawiera katalog World Directory of
Collection
r. D
s of Cultures of Microorganisms (WDCCM).
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
Do WFCC należy 8 polskich kolekcji:
w
le
d
- Polska Kolekcja Mikroorganizmów (PCM)
o- PAN Wrocław
- Państwowa Kolekcja Szczepów Oddziałów weterynarii (DMVB) –
-G
Instytut Weterynarii Puławy
a
k
- Ośrodek czystych Kultur Drobnous
c trojów Przemysłowych (ŁOCK) –
Politechnika Łódzka
ło
b
- Kolekcja Mikroorganizmów
a Przemysłowych (IAFB) – Instytut
Biotechn. Przem. Rolno-Sp Z
oż. W-wa
a
- Laboratorium Kolekcji Kultur (LCC) – Akad. Rolniczo-Techniczna w
Olsztyn
r E
- Ośrodek Badawczo Rozwojowy Kolekcji Kultur (IBA) – OBR W-wa
- Ośr. Szczepów Salmonella Morskiego Inst. Medycyny (KOS) – MIM
r. D
Gdynia
p
- Kolekcja P
O atogenów Roślin (CPPPPI) – Inst. Ochr. Roślin Poznań
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
W uprawnionych kolekcjach mogą być deponowane szczepy
le
patentowe o okre
d
ślonych, cennych właściwościach. W wielu
o
krajach wprowadzono ochronę patentową szczepów. W Polsce
-G
ochronie patentowej podlega jedynie
aproces technologiczny,
k
prowadzony z zastosowaniem danego szczepu.
c
ło
b
Przechowywane szczepy są katalogowane. Dobrze przygotowany
a
katalog kolekcji dostarcza danych dotyczących zgromadzonych
Z
zasobów jak i ich cech u
a żytkowych.
w
Ułatwieniem dos
r E
tępu do baz jest tworzenie komputerowych baz
szczepów.r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
Pełny zestaw informacji o danym szczepie, zawar
w ty w prawidłowo
prowadzonych bazach danych obejmuje: le
d
a.
informacje wewnętrzne (administracyjne
o )
b.
nazwę szczepu
-G
c.
informacje podstawowe o szczepie
a
k
d.
status
c
e.
ło
środowisko i historię szczepu
b
f.
oddziaływania biologiczne
a
g.
płciowość
Z
a
h.
właściwości
w
i.
genotyp i genetyka
r E
j.
warunki hodowlane
k.
właściwości chemiczne i wyposażenie enzymatyczne
r. D
l.
zastosow
p anie praktyczne
m. warunk
O i przechowywania.
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
Przechowalnictwo szczepów przemys
l ło
e wych
d
o
-G
a
Stosowana metoda przechowalnicza
k powinna:
c
ło
- zapewnić maksymalną prze
bżywalność komórek
a
- zminimalizować liczbę komórek uszkodzonych
Z
- przeciwdziałać sponta
a nicznym mutacjom i selekcji odmian
mniej przydatnych w
wprocesie technologicznym
- ograniczyć przypadkowe zanieczyszczenia
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
le
d
o
Prawidłowe przechowywanie mikroorganizmów możliwe jest
-G
jedynie w profesjonalnych kolekcjac
a h.
k
Brak
jest
uniwersalnej c
metody
przechowywania
ło
drobnoustrojów. Dla pełnego zabezpieczenia ich właściwości b
stosuje
si
a
ę
równocześnie
kilka
różnych
metod
Z
przechowalniczych. a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechowalnictwo a
W celu maksymalnego zachowania cech bi
skotechnologiczno-
w
technologicznych
mikroorganizmów
w
przechowalnictwie
le
szczepów, przy wyborze metody nacisk kła
d dzie się na:
o
a. maksymalne ograniczenie liczby pasaży (przesiewów) w celu
-G
ograniczenia możliwości wystąpien
aia mutacji spontanicznych jak
k
i mikrobiologicznego zanieczys
czczenia przechowywanej, czystej
kultury
ło
b
b.
maksymalne zahamowan
aie procesów metabolicznych na czas
przechowywania
Z
a
c.
zapewnienie maksymalnej przeżywalności komórek
w
d.
opracowanie metody gwarantującej zachowanie jednorodności
genetycznej i w
r E
yjściowej charakterystyki technologicznej szczepu
e.
łatwość uaktywnienia kultury i przygotowania materiału
r. D
posiewow
p ego
f.
koszty
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
Metody:
w
le
d
1. Pasażowanie - powszechnie stosowane
o w codziennej praktyce
laboratoryjnej
-G
a
k
Wadą tej metody jest:
c
-
mo
ło
żliwość zmian cech morfologicznych, hodowlanych i
b
biochemicznych (mutacje
aspontaniczne)
-
możliwość zakażenia m
Zikrobiologicznego
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
Kolejne metody ograniczają pasażowanie kultu
w r i minimalizują
procesy metaboliczne
le
d
o
2. Suszenie
-G
a.
w temp. pokojowej pod normaln
a ym ciśnieniem (szczególnie
k
zalecana
do
przechowywa
c nia sporujących
gatunków
promieniowców i grzybów)ło
b
a
b.
w temp. pokojowe Z
j pod zmniejszonym ciśnieniem i w
a
obecności czynnika pochłaniającego wodę (np. P O )
2
5
w
c.
sublimacja ze
r E
stanu głębokiego zamrożenia
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
3. Liofilizacja – suszenie ze stanu zamrożen
leia.
d
o
Metoda ta pozwala na długoletnie przechowywanie szczepów,
-G
które zazwyczaj zachowują cechy fiz
a jologiczno-technologiczne.
k
c
Metoda dwuetapowa:
ło
b
a
I etap – oziębienie i zam
Zrożenie komórek w temp. –70oC
a
II etap – wysuszenie zamrożonych komórek w wysokiej próżni w
(sublimacja)
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechowalnictwo a
sk
w
4.
Zamrażanie
–
metoda
szczególnie
polecana
dla
le
przechowywania
mikroorganizmów
ni
d e wytwarzających
o
zarodników lub słabo przeżywających proces liofilizacji.
-G
a
Polega na przetrzymywaniu szczep
k ów w stanie zamrożenia w
c
chłodniach w temperaturze –20 do –70oC lub w ciekłym azocie w
ło
temp. –196oC.
b
a
Główna zaleta metody – z
Zachowanie maksymalnej liczby żywych
a
komórek (niska letalność) oraz zachowanie dobrej aktywności w
produkcyjnej szczepów.
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
Ważne jest odpowiednie przygotowanie biomasy. W końcowej le
fazie wzrostu wykładniczego lub początkowym okresie fazy d
stacjonarnej oddziela się komórki od podł
ooża hodowlanego. Przed
rozlaniem do pojemników zawiesza si
-Gę je w świeżym podłożu w
a
połączeniu z roztworami ochronnym
ki.
c
ło
Istotny wpływ na prze b
żywalność komórek mają warunki
a
reaktywacji
biomasy ze stanu zamrożenia. Drobnoustroje
Z
przechowywane w stani
ae głębokiego zamrożenia powinny szybko
by
w
ć ożywione, w celu uniknięcia procesu rekrystalizacji lodu w komórkach. Prób
r E
ki po wyjęciu z zamrażarki należy szybko
umieścić w łaźni wodnej o temp nie przekraczającej 40C, a odmrożoną b
r. D
iomasę przenosi się na podłoże hodowlane, celem
p
namnożenia.
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
Przygotowanie szczepionek dla p
wrocesów
biotechnologicznych
le
d
o
-G
Cel
stosowania
czystych a kultur
w
procesach
k
biotechnologicznych:
c
ło
b
a. wytworzenie cech typowych dla danego produktu
a
b.
nadanie produktom cech standardowych, określonych
Z
wymaganiami norma
a tywnymi
w
c.
zapewnienie
dobrej
trwałości
i
wysokiej
jakości
wytwarzanych
r E produktów
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechowalnictwo a
sk
Produkcją
szczepionek,
zawierających
czyste
kultury
w
mikroorganizmów stosowanych w przemyśle, zajmują się
le
wyspecjalizowane laboratoria mikrobiologi
d czne. Zajmują się one:
o
a. doborem odpowiednich szczepów - p
Goprzez ciągłą izolację i
a
selekcję nowych odmian
k
b.
identyfikacją z uwzględnieni
c em cech morfologicznych i
ło
biochemicznych
b
c.
oceną cech użytkowych, ta
akich jak:
Z
- wydajność i szybkość
a tworzenia produktu
- szybkość wzrostuw
- stabilność genetyczna i fenotypowa oraz fagooporność
r E
- wymagania pokarmowe oraz tolerancja na zmienne warunki środowiska
r. D
p
- czystość i łatwość wydzielania wytworzonego produktu
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
le
d
Przy wyborze czystych kultur do konstruowania szczepionek o
przemysłowych ważną rolę odgrywa:
-G
a
k
a. charakter wzajemnego oddziały
c wania szczepów w hodowlach
mieszanych
ło
b
b.
właściwości
antagonis
a tyczne wobec drobnoustrojów
niepożądanych w proc
Zesie technologicznym
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
le
d
Odpowiedni
dobór
szczepów
pozwala
skonstruować
o
szczepionkę o dobrych cechach co przekłada się na:
-G
a
k
a. wzrost wydajności biomasy ko
cmórek
b.
wzmożona produkcje okreło
ślonych metabolitów
b
c.
zwiększoną aktywnośća
d.
uzyskanie prawidłow
Zych cech organoleptycznych produktów
a
w
r E
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
Produkcja szczepionek przemysłowych polega na:
le
d
o
a. namnożeniu
szczepów
składowych
w
optymalnych
-G
środowiskach hodowlanych
a
k
b.
uzyskaniu dużej liczby komórek w stanie pełnej aktywności c
biochemicznej
ło
b
c.
w przypadku szczepionek wieloskładnikowych standaryzacji
a
składu gatunkowego (zarówno pod względem jakościowym
Z
jak i ilo
a
ściowym – odpowiednie proporcje składowych)
w
d.
zabezpieczeniu żywotności komórek i ich właściwości
biochemicznyc
r Eh poprzez odpowiednie utrwalenie i
przechowywanie szczepionki
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
O niezawodności szczepionek w warunkach prod
w ukcyjnych
le
decyduje:
d
o
-G
a. udział szczepów o cechach najkorzystniejszych dla danego
a
procesu biotechnologicznego k
c
b. maksymalna liczba
o
żywych
ł komórek w szczepionce
b
c. wysoka aktywność
a
Z
d. stabilność cech
a
w
e. stały skład szczepionki (jakościowy i ilościowy) w
kolejnych pa
r E
sażach
f.
brak obcych i szkodliwych drobnoustrojów
r. D
p
O
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechowalnictwo a
Szczepionki dla przemysłu mogą być przygotowywane w różnej sk
formie:
w
a. szczepionki płynne – uzyskiwane poprzez n
leamnażanie bakterii w
d
odpowiedniej pożywce do uzyskania
o maksymalnej liczby
aktywnych
komórek.
Trwałość -to
G około 14 dni przy
a
przechowywaniu w temp 4-5oC. Ta forma szczepionki stosowana k
jest obecnie w bardzo ograniczony
c m zakresie
ło
b.
szczepionki liofilizowane czyli suszone ze stanu mrożenia –
b
powszechnie
stosowana
a
forma
szczepionek
różnych
mikroorganizmów. Liofi
Zlizaty są stosunkowo trwałe i mogą być
a
przechowywane przez wiele miesięcy.
w
c.
szczepionki
mrożone
–
zamrożona
biomasa
może
być
r E
przechowywana bezpiecznie, bez obniżenia stopnia przeżywalności komórek, w stosownej temperaturze zamrożenia lub –30oC przez co r. D
najmniej 3
p miesiące. Temperatura ujemna jest również konieczna
O
podczas transportu.
Ulepszanie szczepów przemysłowych – przechow aalnictwo
sk
w
Szczepionki grzybów mikroskopowych dla potrzeb procesów
le
biotechnologicznych przygotowuje się
d jako:
o
-G
a. hodowle na skosach agarowych
a
b.
hodowle w słupkach przy
k gotowanych ze świeżych
c
skrawków roślin np. z ziemniaka
ło
c.
mieszaninę wysuszonyc
bh zarodników w sterylnym piasku,
a
węglu aktywnym lub cytrynianie wapnia
Z
d.
w formie wodnej z
a awiesiny zarodników
e.
w formie liofiliz
watu zarodników lub grzybni wegetatywnej
r E
Preparaty te wykorzystuje się m.in. W produkcji kwasów
organic
r. D
znych,
enzymów,
antybiotyków,
serów
p
pleśniowych.
O