Laboratorium z biochemii I

Ćwiczenie „O” – Elektroforetyczny rozkład białek Maciej Kliszczak

Michał Witkowski

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie rozdziału elektroforetycznego fosfatazy kwaśnej.

1. Wstęp teoretyczny

Elektroforeza - technika separacji cząsteczek związków chemicznych w polu elektrycznym. Separacja następuje dzięki różnicom w ruchliwościach elektroforetycznych różnych związków, parametr ten jest wprost proporcjonalny do ładunku danej molekuły, a odwrotnie proporcjonalny do jej promienia. Z uwagi na zastosowane środowisko, rozróżnić możemy elektroforezę w wolnym buforze i elektroforezę żelową. Elektroforeza żelowa jest najczęściej używana do separacji łańcuchów polimerów o różnych masach cząsteczkowych, polegająca na umieszczaniu próbki w specjalnej kolumnie lub na specjalnej płytce a następnie wywoływanie selektywnego przepływu cząsteczek wzdłuż kolumny lub płytki pod wpływem działania zewnętrznego pola elektrycznego.

Wykorzystuje się tu fakt, że ruchliwość molekuł maleje z ich długością, która w przypadku polimerów zbudowanych z podobnych merów jest bezpośrednią wypadkową ich masy cząsteczkowej: dłuższe molekuły poruszają się wolniej.

2. Materiały:

a. Odczynniki:

• bufor do elektroforezy – 0,065 M TRIS – kwas borowy (H3BO3), pH = 9,0

• wskaźnik – 0,1% roztwór wodny błękitu bromofenolowego,

• rurki z żelem poliakrylamidowym

• roztwór do barwienia żeli

• roztwór do odbarwiania żeli

• roztwór białka – fosfatazy kwaśnej o stężeniu 3 mg/ml b. Aparatura i materiały:

• aparat do elektroforeza

• żyletka

• lignina

• łaźnia wodna o temp. 57ºC

3. Wykonanie:

Ćwiczenie wykonaliśmy zgodnie z instrukcją. Po przeprowadzeniu elektroforezy, przez kolejny tydzień, żel odbarwialiśmy 3-krotnie.

2

4. Wyniki:

W wyniku przeprowadzonej elektroforezy otrzymaliśmy żel z serią prążków, na podstawie których można wyznaczyć drogę przebytą przez wskaźnik i poszczególne frakcje.

Ruchliwość elektroforetyczna Rf badanych składników określimy na podstawie zmierzonych odległości, które przebył wskaźnik oraz badany składnik: Rf = droga przebyta przez badany składnik[mm] /droga przebyta przez wskaźnik [mm]

Droga przebyta przez wskaźnik = 55 mm

Droga przebyta przez pierwszy prążek = 6 mm

Droga przebyta przez drugi prążek= 19 mm

Droga przebyta przez trzeci prążek= 25 mm

Droga przebyta przez czwarty prążek = 30 mm

Droga przebyta przez piąty prążek = 45 mm

Rf1 = 6 / 55 = 0,109

Rf2 = 19 / 55 = 0,345

Rf3 = 25 / 55 = 0,454

Rf4 = 30 / 55 = 0,545

Rf5 = 45 / 55 = 0,818

5. Wnioski:

Otrzymaliśmy serię pięciu prążków. Wskazywać to może na to, iż białko składa się z 5

części, bądź też, na to, iż otrzymany preparat kwaśnej fosfatazy był zanieczyszczony.

3