LABORATORIUM BIOTECHNOLOGII PRZEMYSA
OWEJ
Kierunek: Biotechnologia
Specjalność: Agrobiotechnologia
Studium: dzienne
ĆWICZENIE NR 16
PRODUKCJA IMMOBILIZOWANEGO
KATALIZATORA METOD
PUA
APKOWANIA I
MIKROKAPSUA
KOWANIA.
UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNO  PRZYRODNICZY
WYDZIAA
TECHNOLOGII I INśYNIERII CHEMICZNEJ
Katedra In\
ynierii Chemicznej i Bioprocesowej
BYDGOSZCZ
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
1. Wprowadzenie
Tradycyjnie prowadzi siÄ™ procesy biosyntezy lub biotransformacji za pomocÄ…
enzymów natywnych lub zawiesiny komórek drobnoustrojów. Tego typu rozwiązania
procesowe mają szereg wad i z tego względu immobilizowane (unieruchomione)
biokatalizatory znajdują coraz szersze zastosowanie w biotechnologii przemysłowej.
Immobiliozowane biokatalizatory otrzymuje się z materiału biologicznego w postaci całych
komórek, struktur podkomórkowych lub enzymów.
Zastosowanie biokatalizatora w postaci immobilizowanych komórek ma następujące
zalety:
" Wysoka koncentracja komórek w jednostce objętości bioreaktora prowadzi do wzrostu
produktywności
" Istnieje mo\
liwość prowadzenia ciągłego procesu w kontrolowanych warunkach
" A
atwe wydzielanie i oczyszczanie produktów
" Mniejsze niebezpieczeństwo zaka\
enia przy krótkich czasach przebywania roztworu
reakcyjnego w bioreaktorze
Występują tak\
e pewne wady przy tym rozwiÄ…zaniu procesowym:
" Utrudniony dopływ substratów i odpływ produktów na skutek oporów dyfuzyjnych
" Zakłócenie procesów metabolicznych w przypadku u\
ycia \
ywych komórek
" Nakłady na produkcję immobilizowanego enzymu
Znanych jest wiele metod immobilizacji materiału biologicznego. Dobór odpowiedniej
metody zale\
y od wymogów jakie musi spełnić immobilizowany biokatalizator w danym
procesie .
Immobilizacje materiału biologicznego mo\
na uzyskać przez następujące metody:
1. AgregacjÄ™ fizyczna lub chemicznÄ…
2. Wiązanie z nośnikiem poprzez adsorpcję lub wiązanie kowalencyjne,
3. Pułapkowanie (inkluzję) w sieci polimerowej lub kapsułkowanie.
Agregację uznaje się za jeden z najprostszych sposobów immobilizacji. Je\
eli chodzi
o metody fizyczne to stosuje się je w praktyce tylko dla komórek mikroorganizmów, które
wykazują w określonych warunkach tendencję do tworzenia agregatów (flokuł). Agregację
chemiczna realizuje się przez działanie na materiał biologiczny substancjami zawierającymi
dwie grupy funkcyjne (aldehyd glutarowy, karbodiimidy itd.). Z reguły występują trudności
przy kontrolowaniu wielkości cząstek agregatów, a ponadto ich wytrzymałość mechaniczna
jest często niewystarczająca.
Wiązanie z nośnikiem jest metodą immobilizacji o znacznie większym, praktycznym
znaczeniu. Podstawowe wymagania w odniesieniu do materiałów jako nośników są
następujące:
- trwałość chemiczna i biologiczna,
2
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
- odporność na ścieranie,
- du\
a powierzchnia właściwa,
- dogodna postać z technologicznego punktu widzenia( np. kuliste granulki maja małe
opory przepływu przez zło\
e,
- niska cena.
Nośniki do immobilizacji dzieli się na nieorganiczne i organiczne. Do nośników
nieorganicznych zalicza się: krzemionkę, tlenki metali (np. glinu, tytanu), szkło porowate,
materiały ceramiczne, naturalne glinokrzemiany, bentonit. Jako nośniki organiczne stosuje się
następujące materiały:
- polisacharydy (celuloza, dekstran, agaraza, chitozan itd.)
- polimery syntetyczne (poliakryloamid, poliuretany, poliamidy, itd.)
- jonowymienne \
ywice polimerowe (Amberlit, Duolit),
- kolagen.
Immobilizację całych komórek prowadzi się bardzo często przez inkluzję
(pułapkowanie) w polimerach. Stosowane są polimery syntetyczne (poliakryloamid,
poliuretany, poliamidy itd.) lub pochodzenia naturalnego (agar, alginiany, chitozan, karagen
itd.). W trakcie polimeryzacji polimerów syntetycznych często dochodzi do dezaktywacji
materiału biologicznego. Zaletą polimerów naturalnych są łagodne warunki podczas
immobilizacji.
Immobilizowane komórki drobnoustrojów stosuje się obecnie do prowadzenia szeregu
procesów biotechnologicznych. Taka forma biokatalizatora pozwala na wielokrotny wzrost
produktywności w porównaniu do tradycyjnych metod fermentacyjnych. Wa\
nÄ… zaletÄ…
immobilizowanych biokatalizatorów jest mo\
liwość uciąglenia procesów przez zastosowanie
bioreaktorów ze zło\
em stałym lub fluidalnym.
1.1. Immobilizacja metodÄ… inkluzji
W metodzie inkluzji uzyskuje się najtrwalsze związanie materiału biologicznego
z nośnikiem. Istota tej metody polega na tym, \
e materiał biologiczny znajduje się
w trójwymiarowej sieci splecionych łańcuchów polimerowych. Średnica porów musi być
mniejsza od średnicy cząstek materiału biologicznego. Z drugiej strony pory muszą być na
tyle du\
e, aby zapewnić swobodną dyfuzję substratów i produktów. Zwykle uzyskiwane
nośniki mają strukturę o znacznej porowatości. Przykładowo porowatość \
eli pochodzÄ…cych
od kwasu akrylowego wynosi od 50% do 90%.
Nośniki syntetyczne uzyskuje się przez polimeryzację w bloku lub metodą emulsyjną.
W celu przeprowadzenia immobilizacji przygotowuje się mieszaninę reakcyjną, która zawiera
następujące składniki: materiał biologiczny, monomer, czynnik sieciujący (je\
eli jest to
3
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
niezbędne) i wodny roztwór buforowy. W niektórych przypadkach wprowadza się do
mieszaniny dodatki, chroniące materiał biologiczny przed dezaktywacją. Następnie do
mieszaniny dodaje siÄ™ czynniki inicjujÄ…ce polimeryzacjÄ™ (nadsiarczany, fotoinicjatory).
Polimeryzacja trwa zwykle od kilku minut do kilku godzin i ma charakter rodnikowy.
Ze względu na wydzielające się ciepło mieszanina reakcyjna musi być chłodzona.
Spolimeryzowany \
el z materiałem biologicznym rozdrabnia się mechanicznie i dlatego
otrzymywane czÄ…stki charakteryzujÄ… siÄ™ du\
ą niejednorodnością pod względem rozmiarów
i kształtów.
W niektórych przypadkach lepszym rozwiązaniem jest zastosowanie polimeryzacji
emulsyjnej. Podczas procesu łatwiej odprowadzać ciepło, a uzyskiwane granulki
biokatalizatora mają kształt kulisty i ich wytrzymałość mechaniczna jest kilkakrotnie większa,
ni\
uzyskanych przez mechaniczne rozdrobnienie spolimeryzowanego bloku. W metodzie
emulsyjnej stosuje się jednak rozpuszczalniki organiczne (toluen, chloroform), które mogą
oddziaływać negatywnie na materiał biologiczny.
Zastosowanie polimerów pochodzenia naturalnego jako nośników pozwala na
wyeliminowanie wielu wad, które występują przy otrzymywaniu nośników syntetycznych.
Podstawową zaletą polimerów naturalnych są bardzo łagodne warunki podczas immobilizacji
materiału biologicznego. Z drugiej strony takie biokatalizatory mają równie\
pewne wady.
Najczęściej ich wytrzymałość mechaniczna jest mniejsza i mo\
e to powodować szereg
problemów przy realizacji procesu w skali przemysłowej.
1.2. Immobilizacja metodą kapsułkowania
Kapsułkowanie jest metodą polegają na otaczaniu materiału biologicznego (tzw.
rdzenia) cienką, półprzepuszczalną błoną, przez którą mogą dyfundować małocząsteczkowe
substraty i metabolity, natomiast niemo\
liwa jest migracja komórek. Rdzeń mo\
e stanowić od
10 % do 90 % ogólnej masy kapsułki, mo\
e być jednoskładnikowy bądz
stanowić mieszaninę
w postaci stałej, ciekłej lub gazowej. Membrana mo\
e mieć budowę jedno- lub
wielowarstwowÄ… i mo\
e być wytworzona ze związków naturalnych bądz
syntetycznych, np.
\
elatyny, gumy arabskiej, tłuszczów, pochodnych celulozy, \
ywic, polietylenu, alginianów i
innych.
Obecnie kapsułkowanie znalazło zastosowanie w immobilizacji komórek
zwierzęcych, roślinnych, bakterii, glonów oraz grzybów. Ze względu na średnicę, kapsułki
dzieli się na: nanokapsułki (poni\
ej 0,2 µm), mikrokapsuÅ‚ki (0,2  5000 µm) oraz
4
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
mikrokapsułki (powy\
ej 5000 µm). KsztaÅ‚t mikrokapsuÅ‚ek zale\
y od metody kapsułkowania,
a tak\
e od rodzaju substancji wchodzących w skład rdzenia i błony. Najczęściej wytwarza się
kapsułki idealne sferycznie, poniewa\
istnienie tzw. ogonków mo\
e w przypadku ich
oderwania doprowadzić do wycieku wolnych komórek z rdzenia.
1.3. Alginiany
Alginiany nale\
ą do polisacharydów najczęściej stosowanych do immobilizacji
komórek mikroorganizmów. Kwas alginowy lub jego sole (alginiany) otrzymuje się
z brunatnych alg morskich. Alginiany są zbudowane z długich prostych łańcuchów kwasu
²-D-mannuronowego i kwasu Ä…-L-guluronowego, poÅ‚Ä…czonych wiÄ…zaniami
1 4-glikozydowymi. W wodorostach alginiany pełnią funkcje strukturalne, podobnie jak
celuloza w roślinach i występują w postaci mieszaniny soli sodowej, wapniowej
i magnezowej. Ekstrakcja alginianów odbywa się w ten sposób, \
e wodorosty poddaje siÄ™
działaniu ługu sodowego, a następnie oddziela się części nierozpuszczalne poprzez filtrację.
Roztwór alginianu sodowego jest dalej oczyszczany i suszony w suszarkach rozpyłowych.
Alginiany są szeroko stosowane w przemyśle spo\
ywczym jako czynniki zagęszczające,
stabilizujÄ…ce, emulgujÄ…ce i \
elujące. Roztwory alginianów \
elują pod wpływem jonów
dwuwartościowych (poza Mg2+) i trójwartościowych. Właściwości otrzymanych \
eli są ściśle
skolerowane z budową i długością bloków zawierających jednostki kwasu guluronowego (G-
bloki) w łańcuchu polimerowym. Zaproponowano model  egg-box , opisujący \
elowanie
bloków kwasu guluronowego (rys.1). Wielowartościowe jony, a w szczególności jony
wapniowe, tworzÄ… chelatujÄ…ce kompleksy z blokami G zawierajÄ…cymi ponad 20 jednostek
G G G G G G
Ca2+ Ca2+ Ca2+
G G G G G G
Rys.1. Schemat modelu \
elowania alginianów pod wpływem jonów Ca2+
Zastosowanie alginianów ograniczone jest brakiem stabilności \
elu, gdy występują
w środowisku reakcji substancje wykazujące znaczne powinowactwo wobec jonów Ca2+.
5
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
2. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest
a) zapoznanie siÄ™ z metodÄ… otrzymywania immobilizowanego biokatalizatora przez
pułapkowanie komórek dro\
d\
y w \
elu alginianu wapnia
b) zapoznanie się z metodą immobilizacji komórek dro\
d\
y w alginianie wapnia metodÄ…
kapsułkowania
c) wyznaczenie współczynnika efektywności otrzymanego biokatalizatora na podstawie
badań jego aktywności.
3. Część doświadczalna
pompa infuzyjna
strzykawka
mieszadełko
zlewka
magnetyczne
statyw
Rys. 2. Zestaw do produkcji granulek/kapsułek
6
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
3.1. Produkcja biokatalizatora metodą pułapkowania
Produkowane będą granulki biokatalizatora przez pułapkowanie (inkluzję) komórek
dro\
d\
y Saccharomyces cerevisiae w \
elu alginianu wapnia. Najpierw nale\
y przygotować
roztwór alginianu sodu o stę\
eniu 2% mas. Następnie odmierza się 15ml wody destylowanej
do zlewki, wprowadza siÄ™ 5-15g wilgotnych dro\
d\
y piekarskich (dokładną wielkość próbki
dro\
d\
y poda prowadzący ćwiczenia) i miesza w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny.
Następnie do 5g zawiesiny nale\
y stopniowo wprowadzić około 25g roztworu alginianu i
dokładnie wymieszać. Do \
elowania będzie stosowany roztwór CaCl2 o stę\
eniu 1% mas. i w
ilości 50ml, który powinien być wcześniej przygotowany.
PrzygotowanÄ… zawiesinÄ™ nale\
y pobierać strzykawką, którą następnie montuje się w
pompie infuzyjnej. Pod strzykawką umieszcza się w zlewce roztwór \
elujÄ…cy: CaCl2 o
stÄ™\
eniu 1% mas. i w ilości 50ml. Po uruchomieniu pompy infuzyjnej krople zawierające
alginian i komórki dro\
d\
y wpadajÄ… do roztworu w zlewce i \
elują. Po zakończeniu
wkraplania nale\
y odczekać około 15 min, aby doprowadzić do całkowitego z\
elowania
granulek biokatalizatora. Po upływie tego czasu granulki nale\
y odsączyć na sitku i po
przemyciu H2O(dest) są one gotowe do dalszych badań.
3.2. Produkcja biokatalizatora metodą kapsułkowania
Kapsułkowanie dro\
d\
y Saccharomyces cerevisiae będzie przeprowadzane metodą
jednostopniową w 1% alginianie sodu o niskiej lepkości. W tym celu nale\
y odwa\
yć 12g
wilgotnych dro\
d\
y piekarskich i zmieszać je z 3ml 4% CaCl2, który powinien być wcześniej
przygotowany. Następnie nale\
y odmierzyć do 100ml zlewki około 50ml alginianu sodu.
PrzygotowanÄ… zawiesinÄ™ dro\
d\
y nale\
y pobrać strzykawką zaopatrzoną w igłę o
średnicy 1,2mm, którą następnie montuje się w pompie infuzyjnej. Pod strzykawką umieszcza
się na mieszadełku zlewkę z alginianem i ustawia obroty mieszadełka tak, aby powstał
niezbyt du\
y lej i aby krople zawiesiny trafiały na jego brzeg. Po uruchomieniu pompy
infuzyjnej krople wpadają do alginianu. W momencie zetknięcia się jonów Ca2+ z zawiesiny z
alginianem następuje jego \
elowanie na zewnętrznej warstwie kropli. W celu uformowania
kulistej kapsułki z równomierną otoczką konieczne jest zastosowanie odpowiednio
dobranych, łagodnych obrotów. Wkraplanie nale\
y prowadzić tylko przez 2 minuty, gdy\

przy zbyt du\
ej ilości kropel zawiesiny w alginianie mo\
e następować ich zlepianie. Po
zakończeniu wkraplania pozostawić zlewkę jeszcze przez 6 min. na mieszadełku, odsączyć na
7
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
sitku i kilkukrotnie przepłukać otrzymane kapsułki wodą wodociągową. Następnie Kapsułki
nale\
y przenieść do 60ml 1% CaCl2 i mieszać jeszcze przez 15 min. Po upływie tego czasu
kapsułki nale\
y ponownie odsączyć na sitku i po przemyciu H2O(dest) są one gotowe do
dalszych badań.
3.3. Określanie kontrakcji objętości kropli na skutek \
elowania
W celu określenia kontrakcji objętości kropli wyznacza się najpierw masę 10 kropli
roztworu, a przy obliczaniu objętości pojedynczej kropli przyjmuje się, \
e gęstość zawiesiny
dro\
d\
y wynosi Á = 1050 kg/m3. ObjÄ™tość pojedynczej granulki/kapsuÅ‚ki oblicza siÄ™ na
podstawie pomiaru średnic 10 szt. granulek za pomocą mikroskopu. Współczynnik kontrakcji
È obliczamy z zale\
ności:
Vk
È =
Vg
gdzie:
Vk - objętość pojedynczej kropli [mm3],
Vg - objętość pojedynczej granulki [mm3].
3.4. Wyznaczanie współczynnika efektywności biokatalizatora
Immobilizowane komórki dro\
d\
y zawierają enzym- katalazę, która katalizuje
rozkład nadtlenku wodoru na tlen i wodę. Na szybkość reakcji rozkładu nadtlenku wodoru
przez immobilizowany biokatalizator maja wpływ opory związane z dyfuzja substratu w
porach granulek bÄ…dz
dyfuzji przez błonę kapsułek. W związku z tym w in\
ynierii
bioreaktorowej stosuje się współczynnik efektywności biokatalizatora, definiowany jako
stosunek rzeczywistej szybkości reakcji do szybkości reakcji bez oporów dyfuzyjnych.
Do pomiarów nale\
y przygotować dwie próbki biokatalizatora wskazanego przez
prowadzącego o masach po 2g. W oznaczeniach będzie u\
yty wcześniej przygotowany
roztwór nadtlenku wodoru , którego stę\
enie nale\
y oznaczyć metodą mangometryczną
(próbba  0 ). Do zlewki zawierającej 2g biokatalizatora wlewa się 100 ml roztworu nadtlenku
wodoru o znanym stÄ™\
eniu i uruchamia mieszadło magnetyczne. Po 20 min pobiera się dwie
próbki roztworu reakcyjnego i oznacza stę\
enie pozostałego nadtlenku wodoru przez
8
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
miareczkowanie roztworem nadmanganianu potasu. Uzyskany rzeczywisty stopień przemiany
Ä…rz obliczamy z zale\
ności:
C0 - Ck1
Ä…rz = (1)
C0
gdzie: C0 - poczÄ…tkowe stÄ™\
enie H2O2, obliczone jako średnia arytmetyczna z
dwóch oznaczeń,
Ck1 - stÄ™\
enie H2O2 po czasie 20 min, obliczone jako średnia arytmetyczna
z dwóch oznaczeń.
Granulki drugiej próbki biokatalizatora nale\
y mechanicznie rozetrzeć, aby w trakcie
badań aktywności nie występowały opory dyfuzji. Do zlewki zawierającej 2g roztartych
granulek nale\
y wlać 100 ml roztworu nadtlenku wodoru o znanym stę\
eniu i uruchomić
mieszadło magnetyczne. Po 20 minutach pobiera się dwie próbki roztworu reakcyjnego i
oznacza siÄ™ stÄ™\
enie nadtlenku wodoru. Maksymalny stopień przemiany ąmax obliczamy z
zale\
ności:
C0 - Ck 2
Ä…max = (2)
C0
gdzie:
Ck 2 - stÄ™\
enie H2O2 po czasie 20 min rozkładu przez katalazę zawartą w
komórkach dro\
d\
y uwolnionych z granulek/kapsułek.
Współczynnik efektywnoÅ›ci biokatalizatora · obliczamy z zale\
ności:
Ä…rz
· = (3)
Ä…max
3.5. Oznaczanie stÄ™\
enia H2O2 metodÄ… manganometrycznÄ…
Przy oznaczaniu stÄ™\
eń nadtlenku wodoru dla ka\
dej próbki nale\
y przygotować
kolbki Erlenmayera z 10ml H2O(dest) i 5ml 5N kwasu siarkowego. Pobrana po odpowiednim
czasie próbka, po wprowadzeniu do tak przygotowanego roztworu zostaje zakwaszana, co
powoduje natychmiastowe zatrzymanie reakcji. Nale\
y ją wówczas miareczkować 0,0125M
roztworem nadmanganianu potasu do uzyskania trwałej, malinowej barwy roztworu.
Nadmanganian potasowy utlenia nadtlenek wodoru zgodnie z równaniem reakcji:
2KMnO4 + 5H2O2 + 4 H2SO4 2MnSO4 + 5 O2 + 8H2O + 2KHSO4
9
Laboratorium biotechnologii przemysłowej. Ćwiczenie nr 16.
5
1000cm3 - 1MKMnO4 - molaH O2
2
2
Obliczenia nale\
y wykonać według następującej kolejności:
a) oblicz ile gramów KMnO4 zu\
yto podczas miareczkowania próby,
b) oblicz na podstawie w/w reakcji ile gramów H2O2 odpowiada wcześnie
obliczonym gramom KMnO4,
c) znając ile gramów H2O2 było w badanej próbie oblicz stę\
enie H2O2.
4. Literatura
1. Chmiel, Biotechnologia, Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa
1994.
2. U.E. Viesturs, I.A. Szmite, A.W.śilewicz, Biotechnologia. Substancje biologicznie
czynne, technologia, aparatura, WNT, Warszawa 1992.
3. S. Russel, Biotechnologia, PWN, Warszawa 1990.
4. R. Dembczyński, T. Jankowski, Unieruchamianie komórek drobnoustrojów metodą
kapsułkowania  stan obecny i mo\
liwości rozwoju tej metody. śywność. Nauka.
Technologia. Jakość 4, 2004, 5  17.
10