Transformacja, koniugacja trójrodzicielska,
elektroporacja
Mechanizmy horyzontalnego
transferu genów (HTG):

�
1. Koniugacja
2. Transformacja- pobieranie wolnego DNA ze środowiska
a) Naturalna- kom. Naturalnie kompetentne
b) Sztuczna (indukowana)
3. Transdukcja- przenoszenie DNA z udziałem bakteriofagów
a) Ogólna- przenoszenie dowolnej cechy
b) Specyficzna- przenoszenie określonych cech
4. Transfekcja- Transformacja komórek eukariotycznych
5. Stabilna- połączona z integracją DNA do genomu
6. Przejściowa- jeśli cząsteczka DNA nie ulegnie integracji, ekspresja
wprowadzonego genu zostanie zgubiona w miarę podziałów
komórkowych.
TRANSFORMACJA

�
��Przekazywanie fragmentów DNA z dawcy do biorcy
��Nie wymaga kontaktu fizycznego
��komórki biorcy pobierają aktywnie fragmenty chromosomu
dawcy, które ulegają następnie rekombinacji z homologicznymi
odcinkami DNA w chromosomie biorcy.
��Transformacje można przeprowadzić w obu kierunkach  ten sam
szczep może być użyty jako dawca i jako biorca
��Zjawisko odkryte przez Griffitha w 1928r, wyjaśnione przez
Avery ego w 1944
��Bakterie osiągające stan kompetencji spontanicznie: Bacillus,
Streptococcus, Azotobacter, Helicobacter
��Bakterie będące w stanie konstytutywnej kompetencji np.
Neisseria gonorrhoeae
Stan kompetencji

�
��Jest to stan w którym bakterie mogą być transformowanen
��Wydajność transformacji - % otrzymywanych trwałych
transformantów, zależy przede wszystkim od stanu
komórek biorców, a więc ich zdolności do aktywnego
pobierania DNA z pożywki  określamy to mianem
kompetencji
��W procesie pobierania DNA bierze udział szereg białek
enzymatycznych występujących w błonie i ścianie
komórkowej
��Zdolność kompetencji jest cechą dziedziczną określonego
szczepu
��Tylko bakterie wytwarzające białkowy czynnik kompetencji
są zdolne do transformacji
Proces transformacji-
etapy

�
1. Luz
na adsorpcja cząsteczek DNA do miejsc receptorowych
na powierzchni komórki
2. Transport DNA przez ściany i błony komórkowe do wnętrza
komórki. U niektórych gatunków proces ten jest związany z
degradacją jednego łańcucha podwójnego heliksu
3. Transport DNA do nukleoidu, dopasowanie do
homologicznego fragmentu
4. W procesie rekombinacji między DNA biorcy i pobranym
fragmentem DNA dawcy powstaje heterodupleks.
Heterodupleks jest replikowany z chromosomu bakteryjnego
i po podziale połowa komórek potomnych będzie zawierała
allele znajdujące się we włączonym fragmencie DNA
Kotransformacja

�
��Występuje gdy dochodzi do transformacji dwóch
sprzężonych, blisko siebie leżących genów
��Powstają podwójne transformanty
Przykłady transformacji w
środowisku naturalnym

�
��Pseudomonas stutzeri- przekazuję marker oporności
na ryfampicynę
��Pseudomonas sp.  plazmidy
��Acinetobacter calcoaceticus- zdolność do syntezy
histydyny
Transformacja indukowana

�
1. indukcja kompetencji przez specjalne, przedtransformacyjne
zabiegi, np.u Escherichia coli można wymusić stan kompetencji
poprzez traktowanie komórek CaCl2 (jony Ca2+ zwiększają
przepuszczalność ściany komórkowej) w niskiej temperaturze.
2. elektroporacja  polega na zadziałaniu prądem o wysokim
napięciu, który powoduje czasowe tworzenie się porów w błonie
komórkowej co ułatwia wnikanie DNA. Można używać do
transformacji komórek gramdodatnich i gramujemnych.
3. protoplastyzacja komórek  stosuje się głównie w bakteriach
gramdodatnich np. Bacillus, Streptomyces. Protoplasty (komórki
pozbawione ściany komórkowej) uzyskuje się poprzez
potraktowanie np. polietylenoglikolem.
4. balistyka (metoda tzw.  armatki genowej )  stosuje się głownie do
transformacji roślin. Polega na wstrzeliwaniu drobnych kuleczek
wolframowych lub złotych opłaszczonych DNA.
Wydajność transformacji

�
��Mierzy się ją w przeliczeniu na ilość transformantów
np. ilość wyrośniętych kolonii w przeliczeniu na
mikrogram DNA
��Zależy od:

�Stopnia pokrewieństwa

�Liczby kompetentnych komórek

�Stężenia DNA

�Odpowiedniej temperatury
Mechanizm transformacji

�
a) Komórki wytwarzają białkowy czynnik kompetencji (jego ilość
zmienia się w czasie wzrostu bakterii), wchodzi on w reakcję z
receptorem błonowym, który po aktywacji wysyła sygnał do
chromosowego DNA i umożliwia ekspresję genów
kompetencji, których produktami są różne białka np.
autolizyny, które ułatwiają ekspozycję nukleaz i białek
wiążących DNA na powierzchni komórki.
b) Dwuniciowe fragmenty DNA są adsorbowane na powierzchni
komórki za pomocą białek wiążących. Nukleazy degradują
jedną nić DNA, druga łączy się z białkami stanu kompetencji i
zostaje wprowadzona do wnętrza komórki. Obce genomowe
DNA odszukuje homologiczny odcinek w genomie
gospodarza i w procesie rekombinacji (podwójny c-o)
dochodzi do wymiany pojedynczych nici DNA.
Quorum sensing

�
��Quorum sensing (QS), sygnalizator zagęszczenia
jest systemem komunikacji między komórkami
bakterii uczestniczącym w regulacji ekspresji genów
w odpowiedzi na gęstość populacji drobnoustrojów
��ma szczególne znaczenie w opanowywaniu przez
bakterie nowych terytoriów i precyzuje do jakich
warunków mogą zaadoptować się poszczególne
drobnoustroje
��stwierdzono u bakterii Gram-dodatnich i Gram-
ujemnych
Quorum sensing

�
�� W systemie międzykomórkowej komunikacji pośredniczą małe
cząsteczki sygnalizacyjne (autoinduktory). Po przekroczeniu
progowego stężenia tych związków (co świadczy o osiągnięciu
przez populację mikroorganizmów odpowiedniej liczebności, czyli
kworum) dochodzi do skoordynowanej zmiany ekspresji genów,
niezbędnej do efektywnego współdziałania całej populacji
�� Procesy, w których wykorzystywane jest przez bakterie zjawisko
quorum sensing:

� bioluminescencja

� wzrost

� biosynteza antybiotyków

� transfer plazmidów

� wytwarzanie biofilmu

� wirulencja
Elektroporacja
(elektrotransformacja)

�
��Proces polegający na traktowaniu komórek
czynnikiem fizycznym jakim jest prąd o
dużym napięciu, rzędu kilowoltów, przez
kilka milisekund.
��W błonie komórek powstają wpuklenia, które
przekształcają się w małe hydrofobowe pory,
które następnie przechodzą w duże
hydrofilowe pory zdolne do przepuszczania
cząsteczek DNA. Zamykają się one gdy
skończy się działanie impulsu
��Jest to skuteczny sposób na wprowadzenie
DNA do różnych typów komórek

�
Elektroporacja

�
��Metoda pozwala transformować komórki bakteryjne,
które trudno wprowadzić w stan kompetencji,
stosowana również w przypadku komórek
drożdżowych, roślinnych i zwierzęcych
��pozwala wprowadzić duże cząsteczki DNA, rzędu
setek kpz i charakteryzuje się bardzo dużą
wydajnością.
��Wadą jest to że komórki traktujemy wysokim
napięciem i w ten sposób możemy bardzo łatwo je
uśmiercić
Transdukcja

�
��Jest to wymiana DNA między bakteriami za
pośrednictwem wirusów bakteryjnych
��Wyróżniamy dwa rodzaje transdukcji:
1. Niespecyficzną (ogólną)- fagi P1, P22
2. Specyficzną np. fag 
Bakteriofag, fag - wirus atakujący bakterie. Przeważnie
dany bakteriofag zdolny jest do infekcji tylko jednego
gatunku (a czasem tylko szczepu) bakterii.
Transdukcja

�
Przebieg transdukcji
bakteriofagiem

�
1. bakteriofag zakaża komórkę
2. kwasy nukleinowe, zarówno bakteryjne, jak i bakteriofagowe
zostają pocięte na mniejsze części pod wpływem enzymów
wirusowych
3. kompletne wiriony opuszczają komórkę bakteryjną; niektóre
kapsydy zostały błędnie "załadowane" bakteryjnym DNA
(kolor zielony)
4. bakteriofag niosący bakteryjny DNA zakaża kolejną bakterię
5. DNA z komórki bakterii-dawcy zostało wstrzyknięte do
komórki bakterii-biorcy (krzywa koloru zielonego zakończona
kuleczkami)
6. DNA z komórki donora zastąpiło fragment DNA akceptora
Transdukcja specyficzna

�
��Przeprowadzana przez fagi przenoszące odcinki
DNA o ściśle określonej długości, mające na obu
końcach sekwencje cos rozpoznawane przez fagowe
terminazy
��Przenoszony fragment DNA jest połączony
wiązaniami kowalencyjnymi z DNA bakteriofaga
��Replikacja w cyklu lizogennym oraz litycznym
Transdukcja ogólna

�
��Przenoszenie odcinków DNA o wielkości
niezdeterminowanej (ważne aby odcinek mieścił się
w główce fagowej)
��Długość fragmentu DNA komórkowego, jaki zostaje
zapakowany do główki fagowej, odpowiada długośi
pakowanego DNA fagowego, co w przypadku faga
P22 wynosi ok. 40 kpz, zaś faga P1- 100 kpz.
��Proces rozpoczyna się w miejscu sekwencji pac
rozpoznawanej przez endonukleaze
Cykl lizogenny a lityczny

�
��Cykl lizogenny- odmiana replikacji wirusów,
polegająca na wnikaniu materiału genetycznego
wirusa do komórki gospodarza i jego replikacji wraz
z DNA gospodarza, która nie prowadzi do lizy
komórki.
��Cykl lityczny  cykl życiowy bakteriofaga polegający
na zakażeniu bakterii, produkcji nowych cząstek
fagowych, rozpadzie bakterii i uwolnieniu nowych
bakteriofagów.

�
Transfekcja kom. euk.

�
�� Transformacja komórek eukariotycznych DNA plazmidowym lub
bakteriofagowym
�� Wyróżniamy różne metody transfekcji:
1. chemiczna
a) transfekcja kompleksami DNA z fosforanem wapnia
b) lipofekcja - transfekcja liposomami zawierającymi DNA lub RNA
2. elektroporacja - transfekcja za pomocą krótkotrwałego szoku
elektrycznego w roztworze zawierającym kwas nukleinowy. Szok
elektryczny powoduje przejściowe utworzenie w błonie komórkowej
mikroporów, przez które może się dostać DNA lub RNA.
3. pocisk genowy - transfekcja balistyczna - wstrzeliwanie do wnętrza
komórki mikrokulek złota opłaszczonych DNA
4. mikroiniekcja  roztwór DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra
komórkowego, lub w przypadku RNA do cytoplazmy, za pomocą
specjalnie spreparowanej szklanej kapilary.