Biotechnologia
wykłady 2009 - część 1
Made by: Magdalena Zielińska
Biotechnologia ogólna
Biotechnologia (biologia + technika) jest to zmiana materii żywej i nieożywionej poprzez
stosowanie metod naukowych i technologii z wykorzystaniem organizmów żywych bądz
ich
części, bądz
pochodzących od nich produktów w celu tworzenia wiedzy, dóbr i usług.
Wykorzystanie organizmów, tkanek, komórek i enzymów do otrzymania użytecznych
produktów.
Wykorzystanie organizmów naturalnych lub zmienionych genetycznie ich tkanek, komórek
lub enzymów dla celów biosyntezy i biotransformacji.
Regulacja procesów biologicznych metodami technicznymi.
Otrzymywanie produktów metodami biotechnologicznymi.
Biotechnologia klasyczna - wykorzystuje organizmy występujące naturalnie bądz
zmieniane
w wyniku mutacji (wirusy, bakterie, grzyby, rośliny, zwierzęta).
Biotechnologia nowoczesna (biotechnologia molekularna) - wykorzystuje organizmy
zawierający celowo wprowadzony materiał genetyczny (organizmy transgeniczne).
Komórki  bioreaktor
Biosynteza
geny
enzym enzym enzym
Substraty:składnik
i pożywki
produkt
Biotransformacja
gen
enzym
Substrat:zwiÄ…zek
egzogenny,ksenobi
produkt
otyk
Biotechnologia klasyczna
Biotechnologia stara jak cywilizacja, produkcja piwa (Sumer, 3000 r. p.n.e.), wina, chleba,
serów, kiszonek  fermentacja mikrobiologiczna.
W 1870 r. Louis Pasteur stwierdził, że za fermentację odpowiedzialne są drobnoustroje.
Podstawy biochemiczne
Potencjał produkcyjny żywych komórek
Substraty: Biosynteza: Produkty:
woda czas 20-60 minut 3500 białek
glukoza 1000 związków RNA
sole mineralne E. coli 50 polisacharydów
tlen 500 produktów pośrednich jak
37ºC PodziaÅ‚ co 20-60 min koenzymy, kwasy dikarboksylowe
Fermentacja
- beztlenowa (właściwa)  glikoliza + redukcja np: fermentacja alkoholowa
Saccharomyces cerevisiae
glukoza 2 CO + C H OH + 21 kcal (2 ATP)
2 2 5
- tlenowa  niepełne utlenianie np: fermentacja octowa
C H OH + O CH COOH + H O + 118 kcal
2 5 2 3 2
Acetobacter
Fermentacja alkoholowa
fermentacja
diestaza maltaza
skrobia --------------- > maltoza ----------- > glukoza ----------- > kwas pirogronowy ----- >
destylacja
etanol -------------- > etanol 96 º
Otrzymywanie bioetanolu
Rozpuszczenie hemicelulozy Hydroliza enzymatyczna
biomasa celuloza glukoza dalszy tok j.w.
Usunięcie ligniny
oddychanie tlenowe i beztlenowe  porównanie
glukoza glukoza
1 glikoliza, 2 ATP 1 glikoliza, 2 ATP
kwas pirogronowy kwas pirogronowy
Cykl Krebsa, łańcuch redukcja
oddechowy, CO , 36 ATP
2
woda etanol lub kwas mlekowy
produkty: 38 ATP, H O i CO produkty: etanol, CO , 2ATP
2 2 2
W fermentacji elektrony nie mają gdzie zostać przeniesione (brak O ), dlatego utleniają
2
-
produkt pośredni: kwas pirogronowy lub NO (biodegradacja).
2
Biotechnologia z udziałem mikroorganizmów
Stosujemy: prokariotyczne eubakterie i eukariotyczne rośliny, grzyby, zwierzęta.
Bakterie
Ze względu na budowę ściany komórkowej bakterie Gram + wydzielają białko do podłoża, a
Gram  do przestrzeni periplazmatycznej.
W biotechnologii promieniowce sÄ… inaczej traktowane!
Sposoby pozyskiwania energii życiowej:
- autotrofy
- heterotrofy: saprofity, symbionty, komensale, pasożyty
Grzyby  morfologia
Drożdżaki  grzyby jednokomórkowe
Grzyby strzępkowe komórczakowe i wielokomórkowe.
Stosowane w biotechnologii:
- Mucom (enzymy)
- Rhisopus (enzymy)
- Saccharomyces cerevisiae (etanol, transgeniczne szczepionki i hormony)
- Aspergillus (enzymy, kwas cytrynowy)
- Penicilinum (antybiotyki)
- Claviceps purpura (alkaloidy lizergowe)
- Claviceps paspali (alkaloidy lizergowe)
Hodowla komórek mikroorganizmów
1. Warunki fizyczne i fizyko-chemiczne
A. uwodnienie środowiska
B. temperatura
C. pH
D. utlenienie
2. Warunki pokarmowe (skład podłoża)
A. pierwiastki (mikro- i makroelementy) i ich z
ródła
B. z
ródła węgla i energii (glukoza)
3. Czynniki wzrostowe i prekursorowe
Warunki fizyczne i fizyko-chemiczne
A. uwodnienie środowiska
aktywność wodna
a = p /p = 0,95 do 0,99
w w w
p  prężność pary nad roztworem
w
p  prężność pary wody
w
B. pH
alkalizacja  CaCO lub NH , (NH ) CO, NaOH
3 3 2 2
zakwaszanie  H SO
2 4
C. temperatura
25  35 ºC penicylina: wzrost 30-35 ºC, produkcja antybiotyku 24 -25 ºC
D. natlenienie
zużycie tlenu (w mmol/l*h, lub mmol/g*h suchej masy) np.:
bakteria zużycie tlenu mmol/l*h zużycie tlenu mmol/g*h
Acetobacter sp. 90 35
Penicilinum chrysorenum 30 4
Aspergillus niger 50 3
Rozpuszczenie O w podłożu 0,15-0,20 mmol/l
2
Warunki pokarmowe
A. pierwiastki i z
ródła
- węgiel do 50%
- tlen do 30%
- azot do 14%
- wodór do 8%
- potas do 3%
- siarka do 1%
- potas, magnez, wapń, chlor, żelazo (0,1-1 mmol/l)
- cynk, magnez, miedz
, kobalt (0,1-100 µM/l)
Podłoża mineralne  niezbędne pierwiastki
Podłoża organiczne  wyciąg mannozowy kukurydzy, melasa, serwatka, mąka sojowa
B. z
ródła węgla i energii
- skrobia i ich hydrolizaty
- celuloza i ich hydrolizaty
Czynniki wzrostowe i prekursory wzrostowe
- witaminy (B , B , B , kwas nikotynowy, kwas pantotenowy)
1 2 6
- prekursory:
kwas 2-ortomasłowy + l-tryptofan => alkaloidy sporyszu
Cl- => chlorotetratrypsyna
Cl- => gryzeofulwina
propanol => erytromycyna
fenylooctan => penicylina benzylowa
metabolit liczba genów strukturalnych
dekstran 1
gramicydyna S 2
penicyliny, cefalosporyny, tetracykliny kilkanaście
antybiotyki animoglikozydowe powyżej 20
Wzrost drobnoustrojów
Metody pomiaru
a. przyrost świeżej masy
b. przyrost objętości lub wysokości warstwy świeżej biomasy
c. gęstość optyczna hodowli
d. pomiary liniowe: średnica kolonii, długość nitek grzybni
e. szybkość oddychania komórkowego
f. ilość wydzielanego ciepła
g. bioluminescencja
Fazy wzrostu komórek w hodowli:
1. faza lag  faza początkowa po pasażu komórek nie dzielą się
2. faza log  faza logarytmicznego wzrostu (podziały mitotyczne)
3. faza stacjonarna (plateau)  komórki przestają się dzielić
3
1 2
Relacja między wzrostem a tworzeniem produktu
faza 1  trofofaza  faza intensywnego wzrostu biomasy
faza 2  idiofaza  faza produkcji (faza idiolitu)
Produkcja biomasy i produktu nierozgraniczona
biomasa produkt
masa
masa
biomasa
produkt
czas czas
Produkcja biomasy i produktu rozgraniczona
biomasa produkt
masa
masa
biomasa produkt
czas czas
Schemat procesu biotechnologicznego
1. Sterylizacja
2. Namnażanie
3. Biosynteza w bioreaktorze
4. Wydzielanie produktu
5. Otrzymanie formy hodowlanej produktu
Biosynteza  proces powstania z produktu ze składników pożywki przy współudziale
enzymów komórkowych (metabolity pierwotne i wtórne).
Biotransformacja (biokonwersja)  proces modyfikacji chemicznej substancji obcej
wprowadzonej z zewnątrz (ksenobiotyk) przy udziale najczęściej 1 enzymu (produkcja bez
funkcji metabolicznej).
Produkty bakteryjne (bez paciorkowców): antybiotyki, aminokwasy, enzymy, nukleotydy,
kwasy organicznne, bioinsektycydy.
Promieniowce: antybiotyki, enzymy, inhibitory enzymów, witaminy.
Grzyby: antybiotyki, enzymy, witaminy i inne substancje aktywne biologicznie, inne
produkty.
Mikrobiologiczne biotransformacje w produktach glikokortykosteroidów:
hydroksylacja, odwodornienie, hydroksylacja.
Produkcja witaminy C:
D-glukoza  (Ni+, ciÅ›nienie 80-125 atm, temperatura 140-150 ºC)Ä…ð D-sorbitol  (fermentacja,
gluconobacter suboxydans)Ä…ð L-sorboza  (CH COCH , stężony H SO )Ä…ð diacetonid L-
3 3 2 4
sorbozy  (Fe+2)Ä…ð kwas 2-keto-L-glukonowy  (HCl, CH OH)Ä…ð metyloester kwasu 2-keto-L-
3
glukonowego  (C H OH, temperatura)Ä…ð kwas L-askorbowy
2 5
Biokatalizatory unieruchomione (immobilizacja)
Biokatalizator  enzym lub kaz
zawierająca też enzym stosowany jako katalizator roztwór
biochemiczny lub chemiczny są stosowane in vitro w roztworze lub na stałym nośniku.
Wydajność
Enzymy
immobilizowane
Enzymy
wolne
Czas
Otrzymywanie:
1. adsorpcja na nośniku (DEAE, sefadeks)
2. związane z nośnikiem wiązaniem kowalencyjnym (azydek celulozy)
3. zamknięcie enzymu w nośniku żelowym (poliakrylamid, skrobia)
4. mikrokapsuÅ‚kowanie (otaczanie ciężkÄ…, ok. 200 µm bÅ‚onÄ… półprzepuszczalnÄ…)
5. sieciowanie czÄ…steczek enzymu ( polimeryzacja grup funkcyjnych)
Ä…ð puÅ‚apkowanie w membranie, kuleczkach żelu, we włóknach
kapsułkowanie
sieciowanie przestrzenne
kuleczki i kłaczki biomasy
Roztwór ekstraktu
Kolumna z enzymem immobilizowanym
Roztwór produktu
Enzymy immobilizowane:
-> amylaza  produkcja penicylin i cefalosporyn półsyntetycznych (cefalosporyna  enzym
cefalosporynaza, penicylina G  enzym ß-aminopenicylanaza + fenyloataza)
-> ß-aminoacylaza  produkcja L-aa (acylo-D,L-aa -> L-aa + acylo-D-aa)
-> galaktozydaza  usuwanie laktozy z mleka (laktaza -> galaktoza + glukoza)
-> izomeraza glukozowa  produkcja cukru słodszego od glukozy (Gly -> fruktoza)
Komórki immobilizowane:
sorbitol  ( Gluconobacter sp.)-> sorboza (do produkcji wit C)
kwas fumarowy + NH  ( E. coli)-> kwas asparaginowy
3
etanol  (Acetobacter)-> kwas octowy
ß-metylodigitoksyna  (D. lanata)-> ß-metylodigoksyna
Fuzja protoplastów
Otrzymywanie:
Rozpuszczenie ściany komórkowej:
1. bakterie Gram+ - lizozym
2. bakterie Gram - -lizosym, EDTA, warunki jałowe
3. grzyby  sok żołądkowy Helix pomatica (ślimaka)
4. rośliny  enzymy celulolityczne i pektynolityczne
komórka(ściana i błona komórkowa) -> protoplast
Fuzja:
Komórka dobra produkcja
SÅ‚aba produkcja
Słabe namnażanie
Dobre namnażanie
Protoplast + protoplast
fuzja
hybryda
Regeneracja ściany komórkowej
Komórka hybrydowa  dobra
produkcja i namnażanie
-> szczepy do produkcji antybiotyków
Fuzja protoplastów zwierzęcych
Przeciwciała:
" poliklonalne  mieszanina cząsteczek przeciwciał produkowana w odpornych na
inwazję obcego białka  każde z nich reaguje z różnymi częściami tego białka
" monoklonalne  każde z odrębnych przeciwciał mieszaniny poliklonalnej reagujące z
1 częścią białka (epitopern)
Struktura przeciwciała: H - ciężki łańcuch, L  lekki łańcuch, C  stały, V  zmienny
Produkcja przeciwciał monoklonalnych
Podanie antygenu myszce -> limfocyty śledziony produkują przeciwciała  słabo się
namnażają + komórki szpiczakowi (rakowe) -> hybrydy, które się rozwijają jako
indywidualne kolonie -> selekcja hybryd produkujących swoiste przeciwciała ->
wyselekcjowane hybrydy namnażane w kulturze na dużą skalę
Ciała monoklonalne
Elisa  test immunosorbcyjny
Przciwciało połączone z
Przeciwciało
Bezbarwny
enzymem, Å‚Ä…czÄ…ce siÄ™ z
antygen
substrat barwny
każdym przeciwciałem
produkt
monoklonalnym
Oczyszczanie przeciwciał monoklinalnych  chromatografia powinowactwa
Mieszanina przeciwciał monoklonalnych i białek jest wprowadzona do kolumny
chromatograficznej. Eluacja wodą a następnie roztworem soli. Otrzymujemy rozdzieloną
mieszaninę białek i przeciwciała monoklonalne.
Produkcja przeciwciał monoklonalnych metodą rDNA
mRNA przeciwciała wyizolowanego z immunizowanej myszy lub ludzkich limfocytów B
odwrotna transkryptaza
cDNA (odwrotnie dla H i L)
połączenie cDNA z wektorem
fagi lub plazmidy z cDNA
selekcja
transfekcja, transformacja
E. coli z genami (cDNA) przeciwciała monoklonalnego
produkcja
przeciwciało monoklonalne
Podstawowe rodzaje:
- mysie  100% mysie (zbyt często immunogenne u ludzi)
- chimeryczne  mysi region zmienny Fr, ludzkie domeny stałe Fc (25% mysie)
- humanizowane  ludzkie, z wyjątkiem mysich regionów hiperzmiennych LDE, które
decydują o specyficzności antygenowej
- ludzkie  całkowicie ludzkie
Zastosowanie:
" środki diagnostyczne: testowanie żywności, oznaczenie leków, enzymów,
identyfikacja markerów leukocytów i limfocytów, oznaczanie ilościowe podczas
immunologizacji
" produkcja leków: oczyszczanie interferonów, insuliny, wokinazy
" leki: inaktywujÄ…ce tkankowy aktywator plazminogenu, przeciwrakowe, zapobiegajÄ…ce
odrzutom przeszczepów, zapobiegające agregacji płytek krwi, zapobieganie
zakrzepom naczyń wieńcowych, perspektywicznie  przeciwalergiczne, usuwanie
toksyn z krwi
Biotechnologia molekularna
- Wprowadzenie nowych genów do komórek
- Unieczynnianie istniejących, niepożądanych genów
Etapy inżynierii genetycznej
1. Rekombinacja DNA  in vitro
a. otrzymywanie genu  metody
- synteza chemiczna
- izolacja z genomu za pomocÄ… endonukleaz
- synteza na matrycy mRNA za pomocÄ… odwrotnej transkryptazy
- hybrydyzacja DNA z komplementarnym mRNA
- powielenie DNA za pomocÄ… reakcji PCR
b. połączenie genu z DNA przenośnikowym (wektorem)
- plazmidowym
- fagowym
- wirusowym
2. Transformacja in vivo
c. wprowadzenie genu do komórki
- wektorowe
* transformacja (wniknięcie DNA lub plazmidu)
* transdukcja (za pomocÄ… faga)
* transfekcja (za pomocÄ… wirusa)
* zakarzenie bakteriÄ… z plazmidem
-bezwektorowe
* mikroiniekcja
* mikrowstrzeliwanie
d. replikacja automatyczna lub połączenie z genomem komórki
e. klonowanie komórek ze zrekombinowanym DNA
f. ekspresja wprowadzonego genu czyli synteza odpowiadającegomu mRNA i białek
kosztem maszynerii komórki
Struktura DNA (na poziomie związków chemicznych)
Typy DNA (A, B i Z) wynikają z konformacji pierścienia dezoksyrybozy 2 -endo i 3 -endo
Konformacje zasad względem dezoksyrybozy (anti lub syn)
Dogmat biologii molekularnej:
DNA <=(transkrypcja)=> RNA  (translacja)-> białko  spełnia funkcje strukturalne lub
funkcyjne jak enzym prowadzÄ…cy do metabolitu
Synteza chemiczna DNA:
1. Metoda fosfodiestrowa  mało wydajna historyczna
2. Metoda fosfotriestrowa  mało wydajna
3. Metoda amidofosforynowa  wydajność ok. 90% z kapslowaniem
4. Metoda H-fosfonienowa  wydajność 99,3  99,7% bez kapslowania
Kapslowanie  substancje które nieprzereagują -> usunięcie ze środowiska
A
ączenie fragmentów DNA w reakcji ligacji za pomocą enzymu ligazy.
Enzymy restrykcyjne: lepkie końce, EcoRI, Pst I, Taq I, Hinf I, tępe końce: Hae III
GAATC GGCC
Eco RI  E. coli CTTAG Hae III CCGG w Haemophilis aegyptius
Endonukleaza restrykcyjna Eco RI:
E - Echerichia
co - coli
R - serotyp
I - numer enzymu
Izolacja odpowiednich genów z genomu następuje za pomocą endonukleaz.
Otrzymywanie c-DNA na matrycy m-RNA
m-RNA
Odwrotna
transkryptaza plazmid
m-RNAc-
Enzym restrykcyjny
DNA
RNA-aza
polimeraza
transferaza
terminalna
nukleaza S1
transferaza
terminalna
T
T
T
T
AAA
T
T
AAA
AAA
TTT
AAA
TTT
Hybrydyzacja DNA z komplementarnym mRNA
mRNA
DNA
Nikleaza S1
RNAaza
polimeraza DNA
CiÄ…g dalszy taki sam
A
ańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)
Jedna dwuniciowa czÄ…steczka DNA
Denaturacja, temp. 95 ºC
Pojedyncze nici DNA
1 cykl
przyÅ‚Ä…czenie primerów 35 ºC
Primery przyłączone do nici DNA
Budowanie nici komplementarnej 72ºC
Dwie dwuniciowe czÄ…steczki DNA
denaturacja 95ºC
Enzymy stosowane w inżynierii genetycznej
Endonukleaza restrykcyjna Hydrolizuje DNA o specyficznej sekwencji
Kinaza polinukleotydowa 5' fosforylacja DNA i RNA; znakowanie fosforanem P32
Ligaza DNA A
ączy lepkie lub tępe końce fragmentów DNA
Polimeraza DNA Buduje komplementarną nić DNA do jednej nici, wymaga
2-niciowega DNA jako startera
Nukleaza G Hydrolizuje 1-niciowy DNA (pętla DNA)
1
Rybonukleaza A Hydrolizuje RNA za nukleotydami pyrimidynowymi
Wektor  DNA przenośnikowe, służące do przenoszenia genów biorcy: plazmidy, kosmidy,
wirusy.
Plazmid  np. pBR322, 2 źm, Ti, Ri, transformanty: bakterie, grzyby, rośliny dwuliścienne i
nagonasienne.
Fag np. fag  (baterie E. coli).
Kosmid np. plazmid colE1 z sekwencjÄ… cos faga  transformant  bakterie.Wirusy np. SV40,
bakulowirus, wirus krowianki, transformanty: komórki ssaków, komórki owadzie, komórki
ludzkie.
Mapa restrykcyjna
Transformacja
Plazmid z
genem X
genofor
Komórka bakterii ze
zrekombinowanym
plazmidem
Transdukcja (cykl lizogeniczny)
Transfekcja
Etapy replikacji obcego genu w komórkach bakterii:
- Mikroiniekcja (jak przy zapłodnieniu in vitro)
- Namnażanie genu (replikacja plazmidów i komórek z obcym genem)
- Klonowanie genu (sekwencja transformantów)
Ekspresja genów u Eucariota:
DNA
translacja
mRNA
transkrypcja
Białka ekspresyjne
Tworzenie mostków S-
obróbka
SFoldingN-
potranslacyjna
glikozylacjaO-
glikozylacjaSialylacja
Białka w pełni funkcjonalne
Schemat glikozylacji białek  najważniejsze: w reticulum endoplaznatycznym i aparacie
Golgiego, wiele enzymów.
Regulacja ekspresji genów
Procariota  operony
Eucariota  czynniki transkrypcyjne, antysensy i RNAi
Operon laktozowy:
Zamiast genów enzymatycznych można wstawić to, co chcemy, żeby komórka produkowała
np.: kodon metioniny-gen strukturalny białka terapeutycznego, wtedy produktem jest białko
fuzyjne: ²-galaktozydaza-metionina-biaÅ‚ko terapeutyczne
Operon tryptofanowy
Działa podobnie jak laktozowy, tylko, że represor jest nieaktywny i dopiero po połączeniu
represora z tryptofanem ulega aktywacji i po połączeniu z operatorem prowadzi do
wytworzenia enzymów.
Ekspresja genów
Schemat ekspresji genów u Eucariota
U Procariota schemat jest prostszy  nie ma intronów dzięki czemu po transkrypcji nie ma
etapu wycinania ich, a na drodze transkrypcji można otrzymać z mRNA DNA.
Organizmy stosowane w inżynierii genetycznej:
Procariota
Bakterie
- E. coli  szczep K-12  nie może żyć poza laboratorium
genofor: 4000-10000
par zasad
Plazmidy: kilka-kilkadziesiÄ…t w 1
komórce ok. 4000 par zasad
Białka wyprodukowane są:
- transportowane do przestrzeni periplazmatycznej
- wytrącane jako ciałka ankluzyjne
- rozpuszczane w cytoplazmie (wariant niekorzystny)
- Bacillus subtilis
nie ma plazmidów, genofor 4000 kilo par zasad
Eucariota
- Grzyby np. Saccharomyces cerevisiae
DNA jądrowy 16 chromosomów
14000 kilo par zasad
Plazmid 2 um (ok 6 kilozasad)
60-100 kopii w komórce
- Rośliny np. Licopersicum esculentum (pomidor)
DNA jądrowy 12 chromosomów
714000 kilo zasad?
DMA mitochondrialny(mtDNA ok
270 kilo par zasad)
DNA chloroplastowy (clDNA ok.
160 kilo zasad) dziedziczony tylko
w linii żeńskiej!
Systemy ekspresyjne
Bakterie: E. coli K12* Lactococcus lactis, Bacillus subtilis
Eucariota:
- drożdże (Saccharomyces cerevisiae*, Pichia pastoris, Hansensula polyriorpha)
- grzyby (Aspergillus)
- zwierzęta
- owady: kultury komórkowe lub całe organizmynp. Bombyx mori* (jedwabnik),
Spodoptera frugiporda*
- ssaki: kultury komórkowe np. CHO* - chinise hamster ovary, BHK* - baby hamster
kidney; zwierzęta transgeniczne: owce, kozy, krowy, króliki
- rośliny: Nicotiana babacum, Zea mays (*), Brassica napus
* - stosowane komercyjnie do produkcji biotransfarmaceutyków
Leki biotechnologiczne  biofarmaceutyki
Rekombinowane białka terapeutyczne: hormony, enzymy, interferony, interleukiny,
substancje wzrostowe, przeciwciała monoklonalne, szczepionki.
Rekombinowane kwasy tłuszczowe:
- RNA antysensowny
- iRNA (interferencyjny RNA)
Hormony:
- somatostatyna
- somatotropina
- insulina
Synteza somatostatyny metodą inżynierii genetycznej
Gen ²-
Nukleotydy
galaktozydazy
Synteza
chemiczna
Gen somatostatyny 52 kz
Plazmid pBRB22, przecięty
(gen 3*14 + 10 lepkie
enzymami restrekcyjnymi
ligacja
końce)
Gen ²-galaktozydazy
Kodon metioniny
Gen somatostatyny
E. coli
E. coli z genem
Gen
somatostatyny
chimeryczny
²  galaktozydaza-metionina-somatostatyna
białko chimeryczne
Bromek cyjanku BrCN
Fragmenty ²-galaktozydazy + aktywna SOMATOSTATYNA
(14 aminokwasów z mostkiem disiarczkowym
Somatotropina  191 aminokwasów rhGh - 2 łańcuchy połączone dwoma mostkami
disiarczkowymi
1. Synteza cDNA na matrycy mRNA somatotropiny izolowanego z przysadki ludzkiej
2. Połączenie cDNA somatotropiny z plazmidem
3. Transformacja komórek E. coli lub komórek ssaków (myszy  linia komórek C127)
4. Produkcja somatotropiny
rhGh
r - rekombinowany
h  human - ludzki
Gh  grow hormon  hormon wzrostu
Metody otrzymywania insuliny
1. Metoda enzymatyczna
2. Metoda rDNA syntezy łańcuchów A i B insuliny
3. Metoda rDNA syntezy proinsuliny
Naturalna insulina
Gen insuliny  1430 par zasad
transkrypcja
mRNA
translacja
H2N-peptyd L-łańcuch B-peptyd C-łańcuch A-
COOHpreproinsulina
obróbka
potranslacyjna
B-CA proinsulina
enzymy
B-A insulina
A
ańcuch A składa się z 21 aminokwasów, a łańcuch B z 30 aminokwasów.
Syntetyczna insulina
Metoda rDNA syntezy łańcuchów A i B insuliny
Plazmid pBR322 wykorzystany w tej metodzie z genem A łańcuca insuliny.
Gen ²-galatkozydazy
Kodon metioniny
Gen łańcucha A insuliny
Plazmid z genem B łańcuca insuliny wygląda tak samo, tylko ma odpowiednio gen łańcucha
B insuliny.
Nukleotydy
Nukleotydy
Synteza chemiczna
Synteza chemiczna
Gen łańcucha A
Gen łańcucha B
Plazmid z genem A
Plazmid z genem B
transformacja
transformacja
Komórka E. coli z plazmidem
Komórka E. coli z plazmidem
²-galaktozydaza-metionina-polipeptyd A
²-galaktozydaza-metionina-polipeptyd B
bromek cyjanu
bromek cyjanu
Polipeptyd B
Polipeptyd A
Å‚Ä…czenie in itro
INSULINA
Metoda rDNA syntezy proinsuliny
mRNA preproinsuliny z komórek ² wysp Langerhansa
Odwrotna transkryptaza
cDNA (gen) preproinsuliny
Gen sekwencji sygnaÅ‚owej ²-laktamazy (gen proinsuliny)
Plazmid z genami
transformacja
Komórki E. coli z plazmidem
Wydzielanie proinsuliny do przestrzeni
periplazmatycznej komórek E. coli
proinsulina
Trawienie trypsynÄ…
Insulina
Plazmid pMB9
promotor
gen ²-laktamazy
gen proinsuliny
Polska insulina rekombinowana
Metoda wykorzystuje komórki E.coli
Gen minioproinsuliny
Fragment dysmutazy ponadtlenkowej
plazmid
Etapy:
1. biosynteza
2. wydzielanie i rozbicie komórek E. coli
3. izolacja ciałek infuzyjnych i ich rozpuszczenie
4. prekursor insuliny przyjmuje właściwą konformację dla insuliny
Enzym II: trypsyna
Enzym I:dipeptyd Lizyna-Arginina
Peptyd A
Peptyd B
Mostki
disiarczkowe
Enzym I:
karboksypeptydaza B
dysmutaza
Po wytrÄ…ceniu, HPLC, krystalizacji, suszeniu, nadaniu formy farmadeutycznej otrzymujemy
gotowy lek: Gensulin.
Analogi insuliny ludzkiej
- Zmiana niektórych aminokwasów prowadzi do otrzymania insuliny o lepszych
właściwościach od insuliny naturalnej:
* działające szybciej:
- Humalog: zamiana w pozycji B28 i B29 (prolina-lizyna na lizyna-prolina)
- Noworapid: zamiana w pozycji B28 proliny na kwas asparaginowy
* działające dłużej:
- Lantus: zamiana w pozycji A21 kwasu asparaginowego na glicynÄ™
- Lavemir: usunięto z pozycji B30 treoninę, a do lizyny w pozycji B29 dołączono
kwas tłuszczowy
Analiza jakości wyprodukowanego biofarmaceutyku na przykładzie Gensuliny
Oznaczenie zawartości Metoda
Insuliny ludzkiej HPLC z detekcjÄ… UV
Białek pokrewnych HPLC
Zanieczyszczeń o masie cząsteczkowej HPLC
powyżej rekombinowanej insuliny
Pozostałości E. coli i białek Immunosorbcyjna ELISA za pomocą
nieenzymatycznych specyficznych przeciwciał poliklonalnych
Pozostałości DNA Nieizotropowa hybrydyzacja i ilościowe PCR
(limit 10 pg/mg)
Enzymy:
Asparaginoza  rozkłada asparaginę, terapia ostrej białaczki limfoblastycznej}
Penicylinaza  selektywnie rozszczepia pierścień laktamowy penicyliny, do reakcji
alrgicznych
Tkankowy aktywator plazminogenu (TPA)  selektywnie rozpuszcza skrzep blokujÄ…cy
naczynia wieńcowe
DNAza I  hydrolizuje DNA występujący w śluzie chorych na mukowiscydozę
Komórki układu odporniściowego i ich produkty
Leukocyty
Agranulocyty
Granuocyty
Limfocyty Neutrofile
Monocyty
Eazynofile
Bazofile
T B
makrofagi
fagocytoza
przeciwciała
Interleukiny(IL-2,
fagocytoza
(immunoglobuliny)
IL-7)
wolne rodniki
(O2, H2O2)
interferon Ä…
interferon Ä…
interferon Å‚
Cytokiny są to substancj biorące udział w interakcjach komórek układu odpornościowego,
glikoproteiny wytwarzane przez limfocyty T
Interferony Ä…, ², Å‚.
Interleukiny od IL-1 do IL-25.
Erytropoetyna (EPO).
Czynnik nekrotyczny nowotworów  ILF ą
Czynnik wzrostowy skóry  EGF.
Czynnik wzrostowy fibroblastów  FGF
Inne.
Przeciwciała  struktura
Miejsce Å‚Ä…czenia z antygenem
NH2
NH2
NH2
NH2
A
ańcuch ciężki
A
ańcuch lekki
Fab F(ab)2
COOH
HOOC
CH2 CH2
Rejon zawiasowy N-glikan
połączony z drugim
CH3 CH3
mostkiem
disiarczkowym
HOOC COOH
Fc
Fab  fragment wiążący antygen
Fc  fragment krystalizujÄ…cy
Immunoglobulina A (sIgA)  10 łańcuchów + łańcuch J i białko wydzielnicze są dodatkowe
Zainteresowanie naukowców immunoglobulinami zwierząt odpornych z rodziny Camelidae 
wielbłądy, któr są bardzo proste, jednocześnie zapewniając ochronę zwierzętom.
Najprostrze z nich  nanobody.(nanociało).
VHH
Enzymatyczne rozszczepienie przeciwciał
pepsyna
papaina
Fab
Fab
F(ab)2
A
Ä…czy siÄ™ z
A
aczy siÄ™ z
antygenem, ale nie
antygenem i strÄ…ca
strÄ…ca go in vitro
go in vitro
Fc
Fc
Jednołańcuchowy fragment zmienny (scFv)
VL
VH
Jednołańcuchowy fragment zmienny (scFv) z białkiem sygnałowym
LP
VL
VH
Jednołańcuchowy fragment zmienny (scFv) z białkiem sygnałowym i sekwencją sygnałową
KEDL
LP
LP
VL
VH VL
VH
KEDL CH
Dimery scFv
VH
VL
VL
VH
Linker dipeptydowy  bispecyficzne scFv (Bi-scFv)
VL
VL
VH
VH
Formy przeciwciał:
- przeciwciała rekina  charakterystyczne
- bispecyficzne
- trispecyficzne
- tetraspecyficzne
Przeciwciała nomoklonalne- rodzaje:
- mysie  100% mysie, immunogenne dla ludzi, oznaczenie: momab
- chimeryczne  mysi region zmienny Fr, ludzkie domeny stałe Fc, w 25% mysie, oznaczenie:
ximab
- przeciwciała humanizowane  ludzkie z wyjątkiem mysich regionów hiperzmiennych
(CDR), które decydują o specyficzności antygenowej, oznaczenie: zumab
- przeciwciała ludzkie  całkowicie ludzkie
Terapia przeciwciałami monoklonalnymi
antygen
X radioizotop
Komórka
Komórka
X
docelowa
docelowa
Przeciwciało monoklonalne
Radioizotop lub lek/toksyna
(prolek nie wnika do komórki)
Komórka
Enzym
docelowa
Lek (wnika do komórki)
Kliniczne zwalidowane przeciwciała terapeutyczne:
Nazwa handlowa Nazwa zwyczajowa Miejsce działania Zastosowanie
Ortohoclone Muromomab CD3 limfocytów Ostre odrzucenie
przeszczepionej nerki
Zenepax Daclizumab CD25 (IL-2)
Simulect Basiliximab Rec. IL-2
ReoPro Abciximab GPIIb/IIIa Ostre objawy wieńcowe
fragment Fab2 chineryczne
wieprzowo-ludzkie
Herceptin Transuzumab PI85 Rak piersi z przerzutami
Remicade Infliximab TNFÄ… Choroba Crohn'a +
artretyzm reumatoidalny
Campath Alemtuzumab CDS2 Przewlekła białaczka
limfocytarna
Interferony
Rodzaj, Forma Struktura Metoda Preparat Zastosowanie
symbol produkcji
ą-interferon IFN-ą-2a 165 aminokwasów E. coli Roferona białaczka
IFN-Ä…
IFN-ą-2b 165 aminokwasów E. coli Introna Mięsak
(leukocyty)
Kaposiego
(AIDS) Wepatitis
B i C
IFN-ą-n3 Mieszanina IFN-ą Leukocyty Alferon Mięsak
każdy ma 166 ludzkie Kaposiego
aminokwasów zaktywowane (AIDS) Wepatitis
wirusem B i C
sendai
IFN-ą-n1 Mieszanina Leukocyty Wellferon Mięsak
ludzkich ludzkie Kaposiego
interferonów zaktywowane (AIDS) Wepatitis
wirusem B i C
sendai
²-interferon IFN-²-Ib 165 aminokwasów E. coli Betaseron Sclerosis
IFN-² multiplex
(fibroblasty) (stwardnienie
rozsiane)
IFN-²-Ia 143 aminokwasów E. coli Avonex Sclerosis
multiplex
(stwardnienie
rozsiane)
ł-interferon IFN-ł-Ib 140 aminokwasów E. coli Actimmune Chroniczne
IFN-Å‚ interakcje
(limfocyty pobudzanie
T) fagocytów
Produkcja IFN-²  betafeton
Otrzymywanie cDNA INF-² i transformacja E. coli
Fermentacja E. coli
Zbiór komórek i ich homogenizacja
Wyodrębnienie ciał inkluzyjnych (wirowanie)
Ekstrakcja butanolem
Refaleling
Chromatografia żelowa (wykluczanie)
Dodanie środka pomocniczego, przeniesienie do fiolek
liofilizacja
Interleukiny (IL-1 do IL-33)
I  cytokiny (substancje biorące udział w interakcjach komórek układu odpornościowego),
glikoproteiny, wytwarzane przez limfocyty T
Interleukina (IL-2) rekombinowana (aldesleukin), w odróżnieniu od naturalnej nie zawiera
części cukrowej. Dzialanie: aktywacja limfocytów T. Zastosowanie: rak nerek.
Erytropoetyna (EPO)  czynnik hemopoetyczny.
Działanie: stymuluje i reguluje erytropoezę. Zastosowanie: leczenie anemii.
Gen EPO: 4 introny, 5 egzonów, w 7 chromosomie. Struktura: glikoproteina, 166
aminokwasów, masa cząsteczkowa 36kDa, 40% glikany: 3N-glikany i 1O-glikany.
Produkcja biotecznologiczna gen EPO komórki CHO rhEPO
N-glikan max 4 reszty kwasu sialowego
O-gilkan max 2 reszty kwsu sialowego
Szczepionki:
1. klasyczne
2. antygenowe produkowane metodÄ… rDNA
3. hybrydowe (wirusowe i bakteryjne)
4. DNA
5. komórkowego
Szczepionki klasyczne: odzjadliwione patogenne wirusy lub bakterie
Szczepionki antygenowe produkowane metodÄ… rDNA:
A. Izolacja lub chemiczna synteza DNA kodującego syntezę antygenowych peptydów
otoczki wirusów lub bakterii, łączenie DNA z plazmidami.
B. Klonowanie plazmidów z genami antygenów w komórce E. coli, Saccharomyces
cerevisiae.
C. Wytwarzanie cząsteczek antygenów przez transformowane komórki
D. Przygotowanie formy farmaceutycznej wytworzonych antygenów na rynek
Szczepionki hybrydowe:
Gen antygenu powierzchniowego wirusa chorobotwórczego
+
DNA wirusa bezpiecznego np. wirus krowianki
=
Wirus bezpieczny z genem antygenu wirusa chorobotwórczego (szczepionka hybrydowa)
Szczepionki DNA: nagi DNA kodujący białka wirusowe i bakteryjne może pobudzić system
odpornościowy do produkcji przeciwciał
Szczepionki komórkowe: komórki z genami cytokinin lub antygenów nowotworowych
Modyfikacje białek terapeutycznych:
- wydłużanie okresu półtrwaniabiałek terapeutycznych
* PEGylacja  kowalencyjne połączenie glikoli polietylenowych do białek
terapeutycznych
* fuzja białek  połączenie białka terapeutycznego z albuminami lub przeciwciałami
(całymi lub fragmentami)
* N-glikozylacja  dołączenie do białka terapeutycznego N-glikanu z kwasami
sjalowymi nadajÄ…cymi Å‚adunek ujemny
Przykłady:
1. PEGylowana L-asparaginaza (Oncopar)  terapia ostrej białaczki limfoblastycznej
 PEG-Intron (Pegintron  PEG interferon INF-Ä…-2b)  terapia chronicznego WZW typu C
(1 raz w tygodniu zamiast trzy razy)
2. INF-ą-albumina (Albuferon)  terapia ostrej białaczki limfoblastycznej
Somatotropina-albumina (Albutropin)  hormon wzrostu
Białko fuzyjne X-F TNF-F
c c-immunoglobuliny (Enbrel)  terapia schorzeń
autoimmunologicznych
WyglÄ…d
Białko
terapeutyczne
Przeciwciało
Fragment FC
przeciwciała
Białko
terapeutyczne
3. EPO (glikoproteina EPO)  pposiada 3N-glikany i 1O-glikan
EPO II generacji (Arnasep, Darboprotein Ä…) posiada dodatkowo 2N-glikany (raz w tygodniu
zamiast trzy razy)  terapia anemii u leczonych chemioterapiÄ….
Struktura EPO
N
N
N
O
N
N
N
O
N
N
Terapia genowa
- wprowadzenie brakujÄ…cego genu
- blokowanie wadliwego genu
1. Wprowadzenie brakujÄ…cego genu
Gen
DNA wirusa bezpiecznego
Wirus z DNA zawierajÄ…cym gen
Transfekcja (in vivo lub
ex vivo)
Komórki ludzkie z działającym genem
Wektory:
- adenowirusy
- retrowirusy
- liposomy
2. Blokowanie wadliwego genu
c-DNA
Wadliwy gen
Nić sensowna
Nić antysensowna
Oligomer (DNA)
antysensowny
Brak
transkrypcji
m-RNA sensowny
m-RNA
antysensowny
Brak
translacji
3. Blokowanie onkogenów
DNA (2 geny onkogennej
bcr
abl
kinazy tyrozynowej)
m-RNA sensowny
Kinaza tyrozynowa BCR/ABL
białaczka
Eliminacja: syntetyczny oligomer antysensowny, komplementarny do złącza genów bcr/abl
na etapach transkrypcji i translacji  nie do końca działa, wyłącza ekspresję, ale nie na 100 %.
Terapia genowa
Dwuniciowy krótki RNA  dsRNA o sekwencji komplementarnej do danego genu jest w
stanie spowodować całkowite zahamowanie ekspresji tego genu
iRNA  inaktywuje gen poprzez degradację odpowiadającego mu RNA, nowa klasa leków
genowych
Biotechnologia zwierzÄ…t
Do produkcji białek terapeutycznych można zastosować:
1. Hodowle komórkowe zwierząt np.:
- komórki ssacze: CHO, BHX
- komórki owadzie: Bombyx mori (jedwabnik), Spodoptera fugiperda
- hybrydoma: hybrydy limfocytów śledziony myszy i komórek szpiczakowych
- limfocyty ludzkie
2. Zwierzęta transgeniczne
- owady: jedwabniki, Spodoptera fugiperda
- ssaki: krowy, owce, kozy, świnie, króliki
Można też otrzymać tkanki i organy do transplantacji
Kultury komórkowe ssacze:
Skład podłoża do hodowli:
- Ä…-aminokwasy
-sole: NaCl, Kcl, CaCl
2
- z
ródło węgla: często jest to glukoza
- osocze zastępcze: bydlęce, syntetyczne
- Srodek buforujący (często oparty na CO )
2
Zastosowanie: otrzymanie przeciwciał monoklonalnych do celów terapeutycznych
Produkcja przemysłowa a kulturach komórkowych i hodowlach owadzich
Otrzymywanie szczepionki
Otrzymywanie interferonu Ä…  Vibragen
weterynaryjnej przeciw gorÄ…czce
Omega
świńskiej
Kultura komórkowa owadów
Hodowla owadów (jedwabników) w
(spondoptera fugiperda) w
gablotach na pożywkach przez 2 dni
bioreaktorze 500-1000 l
Dodanie rekombinowanego
Inokulacja owadów rekombinowanym
wirusa (bakulowirus)
wirusem
Oddzielenie komórek od płynu
Hodowla przez 5 dni
pozakomórkowego zawierającego
produkt
Dodanie środka inaktywującego
Rozdrobnienie owadów
wirusa (²-propiolakton)
Dodatek środków pomocniczych
Ekstrakcja produktu i jego oczyszczenie
chromatografiÄ… powinowactwa
Produkt handlowy
Produkt handlowy
Schemat uzyskania transgenicznych zwierzÄ…t hodowlanych
Superowulowana samica 
Gen sklonowany w
dawczyni zarodków
plazmidzie bakteryjnym
Nukleaza
krycie
restrykcyjna
Zapłodnione oocyty (zygoty)
Gen wycięty z plazmidu
z widocznymi przedjÄ…drzami
Mikroiniekcja DNA
do zygoty
Pseudo ciężarna samica
poród
Analiza urodzonego potomstwa
metodÄ… Soutern-Blot, mbPCR
Transgeniczne potomstwo
Zastosowanie transgenicznycjh zwierząt gospodarskich do otrzymania biofarmaceutyków
Gruczoł mleczny  idealny do syntezy obcych białek
Pęcherz moczowy  urzyteczny przed osiągnięciem zdolności do laktacji
Ekspresja na poziomie 1g/l mleka do produkcji 4 kg biofarmaceutyku np. czynnika
krzepliwości X (szacunkowe roczne zapotrzebowanie dla USA):
1 krowa = 13 owiec = 7 kóz = 10 świń = 714 królików
Embrionalne komórki macierzyste życie za życie
Naturalne poczęcie
Klonowanie terapeutyczne
organy
embrion
embrion
Kultury in vitro
Dziecko naturalnie poczęte
Klon, klonowanie reprodukcyjne
Biotechnologia roślin wyższych
1. Mikrorozmnażanie
2. Biosynteza metabolitów metabolitów w kulturach in vitro
3. Biotransformacja metabolitów w kulturach in vitro
4. Transformacja genetyczna roślin i jej zastosowanie do biosyntezy metabolitów
Warunki prowadzenia kultur in vitro roślin
Kultury in vitro  kultura roślin, organów roślinnych, części organow, tkanek lub komórek w
naczyniach sztucznych pożywkach w warunkach aseptycznych.
Pożywki (np. Murashinga-Skoog'a): makroelementy, mikroelementy, witaminy, aminokwasy,
regulator wzrostu, sacharoza, agar (dużo!)
Rodzaje kultur: organów- ukorzenione pędy, korzenie transformowane; tkankowa  tkanka
kalusowa; kultury zawiesinowe  kultura komórkowa; kultury protoplastów
Mikrorozmnażanie  klonalne rozmnażanie somatyczne w jałowych warunkach in vitro (w
szkle)
- może przebiegać
* z istniejących merystemów
* w drodze organogenezy
* w drodze embriogenezy somatycznej
Organogeneza może przebiegać na fragmencie rośliny (organogeneza bezpośrednia) lub na
kallusie (organogeneza pośrednia).
Szczególnymi przypadkami embriogenezy somatostatycznej jest androgeneza (z mikrospor) i
gynogeneza (z zalążka).
Regulatory wzrostu roślin (fitohormony)
Auksyna Cytokinina Efekt
+ - Wydłużenie komórek bez podziałów
+++ + Rozwój korzeni
+++ ++ Rozwój tkanki kallusowej
+ +++ Rozwój pędów
- + Rozwój pędów
Schemat kultur
auksyna
cytokina
Merystemy
Fragment rośliny
Pędy
Roślina
pierwotne
- eksplantat
cytokina
auksyna
Merystemy
Kalus
wtórne
Kalus
Embrioidy
(zawiesina)
Protoplasty
Rośliny mateczne eksplantanty: pylnik, zalążnia, szypułka, pąk, liść, węzeł, organ
podziemny
Mikrorozmnażanie z merystemów pierwotnych: wycięcie z rośliny pojedynczego węzła,
hodowla łodygi po rozwoju dlaszych merystemów następuje cięcie.
Organogeneza bezpośrednia (bez wytworzenia kalusa):
Organogeneza pośrednia (z wytworzeniem kalusa): podobnie jak wyżej, tylko po pobraniu
fragmentu rośliny najpierw rozwija się tkanka kalusowa, z której to rozwijają się organy.
Biosynteza w kulturach in vitro
Typy procesów
Typ Rodzaj kultury Przykład rośliny Przykład produktu
Produkcja biomasy kallus Panax ginseng Biomasa o dużej
zawartości
ginsenozydów
Produkcja enzymów korzenie Raphanus Perokydaza
Biosynteza de novo zawiesina komórkowa Lithospermum Szikonina
erythrorhizon
Biosynteza z zawiesina komórkowa Coleus blumei Kwas rozmarynowy z
prekursorów fenylalaniny
biotransformacje korzenie, transformowane Digitalis lanata ²- metylodigoksyna z
komórki immobilizowane, ²-metylodigotoksyny
mikrosomy
immobilizowane, enzymy
immobilizowane zawiesina
komórkowa
Opracowanie kultur in vitro roślin wyższych do przemysłowej produkcji metabolitów
Eksplant kultura pędów kultura tkanki kallusowej kultura zawiesinowa w kolbie
kultura komórkowa w bioreaktorze (komórki naturalne lub transgeniczne)
Roślina naturalna w gruncie
Agrobacterium
Agrobacterium
Tumefaciens
Agrobacterium
rhizogenes
Tumefaciens
szczep
Szczep
dziki
rekombinowany
kalus
Korzenie
Narośl
transformowane
Narośl
transgenicz
tumorowa
Zawiesina
Pole uprawne -
kalus
Korzemie
komórkow
bioreaktor
transformowane
a
- bioreaktor Korzenie
Pędy
tumorowe
tumorowe
Zawiesina
komórkowa -
Shooty
Rooty
bioreaktor
tumorowe
tumorowe
produkt
produkt
produkt
produkt
produkt
Premysłowo otrzymywane:
- szikonina-> przeciwbakteryjne a kosmetyce z Lithospermum erythrorhizon
- berberyna
- biomasa (ginsenozydy)
- kwas rozmarynowy
- purpuryna
- taksel
Proces otrzymywania szikoniny: 2 etapy
1. produkcja biomasy komórki białe (bez szikoniny)
2. synteza barwnika komórki czerwone (z szikoniną)
Biosynteza alkaloidów: winkamina, winkrystyna
Otrzymywanie paklitakselu: 20 etapów
Biotransformacja w kulturach in vitro:
np.: ²-metylodigoksynÄ™ z ²-metylodigiksyny produkowanej przez roÅ›liny, skopolaminy z
hioscyjaminy za pomocą zrekombinowania genów
Rodzaje biotransformacji:hydroksylacja, glikozydacja, kondensacja, estryfikacja,
demetylacja, redukcja.
Inżynieria genetyczna rośliny
1. Transformacja genomu jÄ…drowego
2. Transformacja genomu plazmidowego
Rodzaje genomu: jÄ…drowy, chloroplazmowy, mitochondrialny
Metody:
- Transformacja trwała  gotowa po kilku miesiącach
Agrobacterium  aagroinfekcja
Działo genowe  wstrzeliwanie plazmidów na cząsteczkach metalu
- Transformacja przejściowa  po kilku dniach
Agrobacterium
Agrobacterium z fargmentem genomu wirusa roślinnego  infilbracja
- Zakorzenienie wirusem roślinnym - po kilku dniach
Wirus roślinny  wirus mozaiki tytoniowej
Wprowadzenie genu do rośliny
nukleotydy
m-RNA
cDNA biofarmaceutyku
Plazmid binarny Plazmid Wirus roślinny
Genom
Agrobacterium
Organy roślinne
plazmidowy
tumefaciens
Genom jÄ…drowy
Ukierunkowana ekspresja obcych genów w roślinach:
komórki: cytosol, reticulum endoplazmatyczne, błona komórkowa, chloroplast, apoplast
organy: cała roślina, bulwy, liście, liście  gutacja, korzenie, korzenie  ryzosekrecja
Transformacja roślin za pomocą Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes.
plazmid Ti, region wirulacji Vir
odcinek pomiędzy lewą i prawą granicą można wziąć i wstawić inną
wstawianie genu do bakterii
Rośliny transgeniczne:
Liść zraniony ludzkie DNA wprowadzone przez Agrobacterium rozwój pędów na
kalusie pędy przeniesione na pożywkę ukorzenione pędy rośliny przeniesione do
gleby
Produkcja biofarmaceutyków: 100 razy taniej rośliny transgeniczne niż zwierzęta.
Rośliny używane do produkcji biofarmaceutyków: przenica, ryż, kukurydza.
Próba stworzenia jadalnych szczepionek np.: transgeniczna sałata (Polska)
Problem glikozylacji białek:
1 etap taki sam, 2 etap inny (brak kwasu sialowego, obecność węglowodorów)
Chloroplastowy system transgeniczny: można wstawić wiele plazmidów np.: tytoń  gen
somatotropiny, albuminy.
Odzysk białek rekombinowanych:
1. Ekspresja białek w określonych tkankach
2. Pominięcie chromatografii w oczyszczeniu białek
3. Pominięcie wyodrębniania  rośliny jadalne
Na rynku: trypsyna, apoproteiny.
Porównanie systemów terapeutycznych
Bakterie - brak mostków disiarczkowych Możliwa w dużej skali,
- nienaturalna konformacja konieczna obróbka
- białka są nieglikozydowane produktu in vitro
Grzyby - obecność mostków disiarczkowych Możliwa w dużej skali,
- prawidłowa konformacja białka heterologiczne
- białka są nieglikozydowane wydzielone do podłoża
Rośliny - obecność mostków disiarczkowych Możliwa w dużej skali,
- prawidłowa konformacja tańsza w bioreaktorze
- glikozylacja cukrami nie występującymi u ssaków
(immunogenne po podaniu pozajelitowym)
- brak kwasu sjalowego
- w plastydach brak glikozylacji
Owady - glikozylacja niekompletna lub znacznie odmienna Mała skala
Ssaki - produkt często identyczny z naturalnym Droga w małej skali
Hirudyna  najsilniejszy Srodek przeciwzakrzepowy
* Pochodzenie: niskocząsteczkowy peptyd wydzielany naturalnie z gruczołów ślinowych
pijawki
* Struktura: 3 białka o symbolach HV-1, HV-2, HV-3, 65-66 aminokwasów, 3 mostki
disiarczkowe, sulfonowana tyrozyna w pozycji 63 lub 64
* Działanie: inhibitor trombiny
* Zastosowanie: Srodek przeciwzakrzepowy
* Otrzymywanie genu  synteza chemiczna lub odwrotna transkrypcja
1. Synteza cDNA hirudyny na matrycy mRNA lub chemicznie
2. Połączenie DNA hirudyny z plazmidem
3. transformacja komórek Saccharomyces cerevisiae
4. Biosynteza hirudyny i wydzielanie do podłaża
5. Chromatografia jonowymienna HPLC
6. Dezsulfohirudyna
7. Enzym sulfotransferaza tyrozyloproteinowa z pijawek lub cielÄ…t
8. hirudyna sulfonowana w pozycji 63
System rekombinowania hirudyny:
- Bakterie: E. coli, Streptomyces lividans
- Drożdże: Saccharomyces cerevisiae  zastosowanie lecznicze, Hansenula polymorpha i
picchia pastoris  duża wydajność
- Grzyby: Acremonium, Chrysogenum
- Komórki owadów i ssaków
- Rośliny: Brassica napus  rzepak, tytoń
Otrzymywanie hirudyny w transgenicznym rzepaku
1. Konstrukcja chimerycznego genu deozyny
2. Transformacja rzepaku
3. Wzrost roślin i zbiór nasion
4. Ekstrakcja nasion wodÄ…
5. Wydzielanie ciał olejowych
6. Rozszczepienie enzymem proteolitycznym
7. Wirowanie
8. Wydzielanie hirudyny
Preparaty farmaceutyczne
- Lepiruin N-koniec lecytyna-treonina
- Desirudin N-koniec walina-walina
Oba produkowane przez transgeniczny Saccharomyces cerevisiae
- Bivalirudin  peptyd syntezowany chemicznie
Biotechnologiczna synteza dekstranu
Etap 1 Otrzymywanie surowego dekstranu
* Metoda I  fermentacja
- 1etap  hodowla Leconostoc mesenteroides w podłożu 10-20% sacharozy,
ekstraktów z drożdży, zarodki zbożowe temp.23-25 °C, pH 5-6, 1-2 doby, namnażanie
komórek, synteza enzymu  dekstranosacharozy
- 2 etap  wydzielony roztwór stosuje się w roztworze sacharozy
wytrÄ…canie metanolem, etanolem lub acetonem
Etap 2 Otrzymywanie dekstranu o pożądanej wielkości cząsteczek
- hydroliza kwasowa: roztwór wodny surowego dekstranu 5-8%, temperatura
80-100 °C, pH 2, czas odpowiednio dobrany
- hydroliza enzymatyczna: roztwór surowego dekstranu temp. 45-50 °C, pH 5-6,
enzym dekstranaza(wytwarzana przez Penicilinum funiculosum, Penicilinum
liliacinim, Aspergillus verti), czas 2 godziny
Farmaceutyki wyprodukowane w roślinach w zaawansowanych stadiach opracowania
Lista na stronie www.molecularfarming.com