Genom jądrowy. Typy mutacji DNA
Genom to całkowity DNA komórki lub organizmu, obejmujący zarówno wszystkie geny, jak
i odcinki międzygenowe.
Genom człowieka zawiera około 25 000 genów, ale odcinki kodujące stanowią tylko
ok. 1-3% całego genomu.
Około 30% stanowią sekwencje ulegające transkrypcji oraz sekwencje związane z genami.
Pozostała część genomu to pozagenowy DNA który stanowi 70-80%.
Budowa fizyczna genomu człowieka
Genom jądrowy
zbudowany z około 3 Gb (3000 Mb)
złożony z 24 rożnych liniowych cząsteczek  chromosomów
zakres wielkości cząsteczek (chromosomów) od 55 Mb do 250 Mb
wśród chromosomów wyróżniamy autosomy i heterosomy
Genom mitochondrialny
zbudowany z około 16 kb
kolista cząsteczka DNA
występuje w komórce w wielu kopiach
obecny we wszystkich mitochondriach
wykazuje wyższą częstość mutacji niż DNA jądrowy
Geny i sekwencje związane z genami
eksony
introny
pseudogeny
fragmenty genów
sekwencje regulatorowe
sekwencje początkowe i końcowe genów
Dwa przykłady niezwykłej organizacji genów:
Geny nakładające się
W niektórych regionach chromosomów, w których zagęszczenie genów jest duże, a
sekwencja jest bogata w pary GC mamy do czynienia ze zjawiskiem nakładania się genów
(ang. overlapping genes). Zwykle sekwencje aminokwasowe białek kodowanych przez kilka
genów zachodzących na siebie nie są podobne. Przykładem mogą być geny kompleksu HLA
w chromosomie pary 16 (lokalizacja 16p21.3).
Geny wewnątrz genów
Jeden gen znajduje się wewnątrz intronu innego genu  stosunkowo powszechna cecha
genomów jądrowych. Gen NF1 (neurofibromina 1) zawiera w obrębie swojej sekwencji
intronowej trzy inne, mniejsze geny: OGMP, EVI2B i EVI2A. Geny te ulegają transkrypcji
w kierunku przeciwnym niż gen NF1.
Gęstość genów
Średnia gęstość występowania : 1 na 450 pz w genomie mitochondrialnym
1na 40-45 kpz w genomie jądrowym
Klasyczne rodziny genów
Geny należące do klasycznych rodzin genów wykazują wysoki stopień homologii sekwencji
nukleotydowych. Geny te kodują białka zawierające wysoce konserwatywne domeny lub
motywy.
Rodzina genów Liczba genów Motywy/domeny konserwatywne
Geny homeobox 38 Homeodomena składająca się z 60 aminokwasów
Geny PAX 9 Domena składająca się ze 128 aminokwasów
Geny SOX 8 Domena składająca się z 69 aminokwasów
Superrodziny genów
Geny należące do superrodzin kodują produkty o podobnym znaczeniu funkcjonalnym
i wykazują jedynie niewielki stopień homologii sekwencji nukleotydowych. Przykłady
superodzin genów to: superrodzina immunoglobulin i superrodzina globin.
Pozagenowy DNA
% sekwencje unikatowe
% sekwencje powtórzone (repetytywne): rozproszone i tandemowe (zwarte)
Sekwencje powtórzone tandemowe (zwarte)
Satelitarne  większość powtórzeń występuje w regionach centromerowych chromosomu,
odgrywając tam prawdopodobnie funkcję strukturalną; powtórzenia dochodzą do setek
tysięcy par zasad:
- minisatelitarne  fragmenty długości sięgającej 20 kb, z powtarzająca się
jednostką długości około 10-100 bp; występują najczęściej w telomerach
lub w pobliżu końców chromosomu; funkcja nieznana
- mikrosatelitarne  powtórzenia krótkie, zwykle poniżej 150 bp, a jednostka
powtórzona to najczęściej 2 - 4 bp; funkcja nieznana, ale powtórzenia tego
typu znalazły zastosowanie jako marker molekularny (np. ustalanie profilu
genetycznego  kryminalistyka).
Sekwencje powtórzone rozproszone (transpozony i retrotranspozony)
- Długie LINE (ang. long interspersed nuclear element) - długie rozproszone
sekwencje jądrowe; sekwencje o długości około 6 kb. Najbardziej znana to
sekwencja LINE-1 powtórzona ok. 800 tys. razy, zajmująca 21% ludzkiego DNA.
- Krótkie SINE (ang. short interspersed nuclear element) - krótkie rozproszone
sekwencje jądrowe o długości około 100-400 bp. Najbardziej znana to sekwencja
Alu o wielkości 300 bp, która powtarza się ok. miliona razy i tworzy 10%
ludzkiego DNA.
Mapowanie genomu
Mapowanie polega na opracowaniu szczegółowych map chromosomów, które
odzwierciedlają położenie znanych genów, jak również sekwencji DNA o nieznanej funkcji
w genomie. Mapowanie genomu opiera się na dwóch metodach:
- mapowaniu fizycznym
- mapowaniu genetycznym
Mapowanie fizyczne:
Mapy fizyczne tworzy się za pomocą sklonowanych odcinków DNA, których funkcja
w organizmie nie musi być znana i w odróżnieniu od map genetycznych uwzględniają takie
szczegóły molekularne, jak: eksony, introny, sekwencje regulatorowe itp.
Jednostką mapowania fizycznego jest para zasad (ang. base pair)  bp.
Mapowanie genetyczne:
Opiera się na stosowaniu technik genetycznych do konstruowania map pokazujących
względne położenie genów i innych charakterystycznych sekwencji w genomie na podstawie
częstości rekombinacji. Mapowanie genetyczne wykorzystuje zjawisko sprzężenia, czyli
tendencję genów do wspólnego dziedziczenia. Jeżeli geny lub sekwencje leżą blisko siebie,
to będą przekazywane razem, czyli będą ze sobą sprzężone.
Jednostką mapowania genetycznego jest centymorgan 1cM=1% rekombinacji
(1 crossing-over na 100 mejoz)
Sekwencjonowanie genomu człowieka
Cele programu poznania genomu człowieka (ang. HGP  Human Genome Project):
skonstruowanie szczegółowych map fizycznych i genetycznych całego genomu
człowieka,
zlokalizowanie wszystkich genów w obrębie genomu człowieka,
wypracowanie metod przechowywania i udostępniania uzyskanych danych; ulepszenie
metod sekwencjonowania,
uzyskanie wiedzy na temat skutków społecznych, ideologicznych i etycznych nowych
technologii genetycznych.
Fakty:
2003  kompletna sekwencja genomu człowieka
2007  opublikowano sekwencję genomu Craiga Ventera
2007 - James Watson - pierwszy  osobisty genom (1 milion dolarów, 2 miesiące,
sekwencja opublikowana: http://jimwatsonsequence.cshl.edu/cgi-
perl/gbrowse/jwsequence/, za wyjątkiem genu ApoE)
2008  pierwszy zsekwencjonowany genom osoby pochodzącej z Europy oraz
pierwszy genom kobiety, Holenderki dr Marjolein Kriek (40.000 Euro, 6 miesięcy)
2008  opublikowano sekwencje genomu Azjaty (Chińczyka Han) oraz Nigeryjczyka
(plemię Yoruba)
11 marca 2009 - Personal Genome Project   Osobiste Genomy
- cel - zsekwencjonowanie genomów 100 000 ochotników
 PG-10  pierwszych 10 ochotników, których dane są ogólnie dostępne
http://www.personalgenomes.org/mission.html
Sekwencjonowanie genomu - przyszłość
The Personal Genome Sequencing Service
10 czerwca 2009 - Illumina - amerykańska firma z obszaru life-science, zajmująca się
sekwenjonowaniem, genotypowaniem i ekspresją genów, zaoferowała możliwość
komercyjnego sekwencjonowania genomu za kwotę mniejszą niż 50 000 dolarów
(dane zawierałyby informacje o polimorfizmach typu SNP oraz CNV)
 Dr Jay Flatley (President of Illumina) - przewiduje, że w 2019 roku
sekwencjonowanie genomu będzie rutynową techniką wykonywaną tuż po urodzeniu
dziecka, a cena sekwencjonowania genomu spadnie poniżej 1000 dolarów
Mutacje
Mutacją nazywamy utrwaloną zmianę w materiale dziedzicznym. Zmiany w DNA mogą być
różnego typu (w zależności, jakiej części genomu dotyczy).
Typy chorób genetycznych (w zależności od rodzaju oraz obszaru uszkodzenia
materiału genetycznego):
1. Spowodowane aberracjami chromosomowymi
2. Spowodowane mutacją pojedynczego genu (choroby jednogenowe)
3. Spowodowane mikrodelecją (zespoły mikrodelecji)
4. Uwarunkowane wieloczynnikowo
Choroby uwarunkowane jednogenowo
Zmiany materiału genetycznego są submikroskopowe, dostępne do badania jedynie metodami
biologii molekularnej
- Mutacje dotyczą tylko jednego genu
- Około 1% populacji ogólnej dotkniętej jest chorobami uwarunkowanymi jednogenowo
- Znanych jest około 16 000 różnych chorób uwarunkowanych jednogenowo
Mutacje genowe  etiologia chorób jednogenowych
Mutacje genowe - zmiany normalnej sekwencji DNA organizmu, spowodowane błędami
w replikacji DNA (mutacje spontaniczne) lub działaniem czynników chemicznych i
fizycznych (mutacje indukowane).
Zachodzą w zygocie, płodzie, komórkach somatycznych i rozrodczych w ciągu całego życia.
Mutacje w komórkach somatycznych nie są przekazywane potomstwu, w odróżnieniu od
mutacji w komórkach rozrodczych, które mogą zostać potomstwu przekazane. Mutacje
somatyczne odgrywają dużą rolę w rozwoju nowotworów u ludzi. Mutacje w komórkach
rozrodczych mogą być odziedziczone lub powstają de novo w procesie oogenezy lub
spermatogenezy.
Mutacje spontaniczne powstają w wyniku:
" błędów replikacyjnych
" poślizgu replikacyjnego
" powstawania struktur trzecio- i czwartorzędowych
Częstość mutacji jest niejednakowa dla różnych miejsc w genie (loci). Mutacje spontaniczne
mogą powstać z większą częstością w charakterystycznych miejscach genu zwanych
gorącymi miejscami (z ang. hot spots).
Mutacje indukowane:
Mutageny chemiczne
Mutageny fizyczne
Typy mutacji genowych:
- duże zmiany genowe
- mutacje punktowe
- mutacje transkrypcyjne
- mutacje splicingowe
- mutacje dynamiczne
- negatywne mutacje dominujące
Duże zmiany genowe:
- delecje
- duplikacje
- insercje
Delecje:
Utrata części sekwencji DNA (alfa-talasemia, rdzeniowy zanik mięśni, rodzinna
hipercholesterolemia, dystrofia mięśniowa Duchenne a i Beckera, mukowiscydoza, zespół
Pradera Willi ego).
Delecja małego fragmentu eksonu 44 genu dystrofiny powoduje ciężką formę DMD,
natomiast duża delecja, która zajmuje ponad połowę całego genu, powoduje łagodniejszą
chorobę  BMD. Efekt mutacji zależy więc nie od wielkości delecji, ale od tego czy delecja ta
zaburza ramkę odczytu, czy też nie.
Duplikacje:
Powielenie sekwencji DNA (rodzinna hipercholesterolemia, dystrofia mięśniowa Duchenne a,
zespół Westa).
Insercje
Wbudowanie dodatkowej sekwencji DNA (np. hemofilia, mukowiscydoza).
Przykład: W obrębie wstawionego insertu może znajdować się kodon stop, co w
konsekwencji spowoduje syntezę skróconego białka, które okaże się być niefunkcjonalne.
Mutacje transkrypcyjne:
Występują w regionie genu związanym z regulacją procesu transkrypcji, czego efektem jest
spadek produkcji białka (np. polidaktylia - mutacja w rejonie regulatorowym genu SHH).
Mutacje splicingowe
Położone na złączach intron - ekson, zakłócające proces wycinania intronów (np.
fenyloketonuria, beta-talasemia, mukowiscydoza).
Mutacje punktowe
Dotyczą tylko jednego nukleotydu i są najczęstszymi mutacjami w genomie ludzkim.
Typy mutacji punktowych:
" insercje - wbudowanie dodatkowego nukleotydu
" delecje - wypadnięcie nukleotydu (głuchota wrodzona; 35delG, zespół Marfana)
" tranzycje - zamiana puryny na purynę lub pirymidyny na pirymidynę
(achondroplazja, mukowiscydoza)
" transwersje - zamiana puryny na pirymidynę lub odwrotnie (achondroplazja, anemia
sierpowata)
Przykład:
Achondroplazja - substytucje w genie FGFR3 (ang. Fibroblast Growth Factor Receptor 3) w
pozycji nukleotydu 1138:
- tranzycja  G>A u 98% pacjentów
- transwersja - G>C u 1% pacjentów
Mutacje dynamiczne:
Pierwszą mutację dynamiczną odkryto w 1991 roku.
Mutacje dynamiczne stwierdzono tylko u człowieka.
Mutacje dynamiczne wykazują dużą zmienność populacyjną.
stanowią podłoże molekularne 14 jednostek chorobowych
mutacje polegające na wzroście liczby powtórzeń (3-, 4-, 12- nukleotydowych)
 ilość powtórzeń może wzrastać w kolejnych pokoleniach
istnieje korelacja miedzy ciężkością choroby oraz wiekiem pojawienia się objawów,
a ilością powtórzeń
objawy mogą nasilać się lub występować wcześniej w kolejnych pokoleniach
(antycypacja)
premutacja  wzrost ilości powtórzeń poniżej wartości granicznej  nie powoduje
wystąpienia choroby  bezobjawowi nosiciele.
Choroby: choroba Huntingtona (CAG), zespół łamliwego chromosomu X (CGG), ataksje
módżkowo-rdzeniowe, rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni, dystrofia miotoniczna.
Zespół łamliwego chromosomu X (FraX)
- Mutacja dynamiczna w genie FMR1 w długim ramieniu chromosomu X
- Wzrost ilości powtórzeń sekwencji CGG powyżej 200
- Osoby zdrowe - do 54 powtórzeń, nosiciele bezobjawowi - do 200 powtórzeń
(tzw. premutacja)
Negatywne mutacje dominujące:
zmutowany allel wytwarza produkt, który interferuje z produktem allelu
niezmutowanego
geny kodujące białka strukturalne  geny kolagenu, elastyny
Choroby: osteogenesis imperfecta, zespół Marfana.
Skutki mutacji genowych:
mutacje missens (zmiany sensu)  zmiana nukleotydu w pierwszej lub drugiej
pozycji kodonu powoduje zmianę kodowanego przez triplet aminokwasu. Zmienia się
aminokwas w białku
mutacje neutralne (ciche, synonimiczne)  nie powodują zmiany kodowanego
aminokwasu, ponieważ zmiana nukleotydu następuje w trzeciej pozycji tripletu lub też
mutacja nie dotyczy sekwencji kodujących lub z nimi związanych.
 mutacje nonsens (stop)  w wyniku mutacji (delecji, insercji lub substytucji
nukleotydu/ów) powstaje przedwcześnie kodon terminacyjny  stop , czego efektem
jest białko skrócone i pozbawione funkcji
mutacje zmiany ramki odczytu - delecja lub insercja w rejonie kodującym (nie
będąca wielokrotnością trzech nukleotydów) genu zmienia wszystkie występujące za
mutacją kodony; następuje zmiana sekwencji aminokwasowej  zmienia się kodowane
białko
mutacje transkrypcyjne  występują w obszarze regulującym proces transkrypcji
czego efektem jest spadek lub wzrost produkcji białka (np. polidaktylia - mutacja w
rejonie regulatorowym genu SHH)
mutacje splicingowe  zaburzenia w składaniu RNA (np. beta-talasemia).
Skutki mutacji ze względu na funkcję białka:
Utrata funkcji  mutacja znosi lub zmniejsza aktywność białka; większość mutacji
tego typu jest recesywna, ale zdarzają się sytuacje, w których mutacja ma charakter
dominujący (np. zespół Marfana, geny supresorowe nowotworów  BRCA1).
Nabycie funkcji  mutacja nadaje białku nietypową aktywność, często niepożądaną
lub toksyczną, albo aktywność w niewłaściwej tkance czy okresie rozwoju; mutacje
tego typu występują rzadziej i mają najczęściej charakter dominujący (np.
protoonkogeny).
Mutacje znoszące
Istnieją takie mutacje, które znoszą działanie innych, wcześniejszych mutacji. Na przykład
pierwsza mutacja powoduje utratę funkcji kodowanego białka, a kolejna znosi tę pierwszą
mutację i przywraca wytwarzanie funkcjonalnego białka lub maskuje jego brak. Obie mutacje
mogą zachodzić w tym samym regionie DNA lub w zupełnie odległych od siebie miejscach.
Zespoły mikrodelecyjne (z. przyległych genów):
Cechy zespołów mikrodelecyjnych:
Szerokie spektrum zmienności objawów
Opóz
nienie rozwoju umysłowego
Zaburzenia wzrastania
Dysmorfia twarzoczaszki
Objawy jednej lub wielu chorób jednogenowych
Ciężkie wady wrodzone uniemożliwiające prokreację, najczęściej występowanie
sporadyczne
Przyczyną rodzinnego występowania są translokacje
Wielkość delecji < 3 mln par zasad