ROZRÓD I BIOTECHNOLOGIA ZWIERZT by prof. Barbara Reklewska
W 1 ZNACZENIE ROZRODU W HODOWLI ZWIERZT
ROZRÓD:
Ciągłą aktywność jajników jest konieczna do produkcji jaj
Przedłużenie funkcji gruczołu mlekowego warunkuje dostarczanie dodatkowej produkcji mleka
do konsumpcji
Podobnie użytkowanie mięsne zależy od regulacji urodzin młodych zwierząt
Głównym celem poszczególnych sektorów produkcji zwierzęcej jest wytworzenie mleka - mięsa jaj
najbardziej opłacalną drogą
Decydującym czynnikiem warunkującym efektywność produkcji zwierzęcej jest Rozród
CZYNNIKI DECYDUJCE O EFEKTYWNOŚCI ROZRODU:
Sezonowość
Częstotliwość rui
Liczba owulacji
Czas trwania ciąży
Wielkość miotu
Okres ssania
Wiek dojrzewania
Okres reprodukcji
GATUNEK CYKL RUJOWY (DNI) DA. CIŻY WIELKOŚĆ MIOTU
OWCA 17 148 1-3-5
KOZA 21 148 1-3
ŚWINIA 19-20 113 10-12-16
KROWA 21-22 282 1
KLACZ 19-25 150 1
KRÓLIK 29 3-10
MYSZ 4-5 19 4-8
Czynniki decydujące o efektywności rozrodu. Wyniki reprodukcji każdego gatunku zwierząt mogą być
niskie wskutek niedostatecznych znajomości procesów fizjologicznych danego gatunku
EFEKTYWNOŚĆ ROZRODU MOŻE SI OBNIŻYĆ W WYNIKU:
Sezonowości
Środowiska
Genetycznych czynników
Żywieniowych czynników
Anatomicznych
Hormonalnych
Patologicznych
CZYNNIKI NEGATYWNIE DZIAAAJCE NA WYNIKI ROZRODU:
Nadmierne intensywna selekcja na cechy produkcyjne
Wczesne zamieranie zarodków
Opózniona dojrzałość płciowa
Stresujące ekstremalne zmiany temperatury i fotoperiodu
Produkcja nasienia słabej jakości
Obniżony pociąg płciowy
1
MOŻLIWOŚCI ZWIKSZENIA EFEKTÓW REPRODUKCJI
METODY HODOWLANE:
Przyspieszanie dojrzałości
Skracanie okresu PP (po porodzie)
Wczesne odłączenie
Ograniczenie strat w okresie ciąży i odchowu
Eliminowanie chorób
Eliminowanie ciężkich porodów i stresów
Poprawa kwalifikacji obsługi
ZWIKSZENIE PLENNOŚCI POPRZEZ:
Selekcje
Krzyżowanie z rasami plennymi
Introdukcja genów wysokiej plenności
flushing
Żywienie
ROZRÓD WSPOMAGANY
Metody hormonalne superowulacja
Poprawa wykrywania rui u zwierząt
Wczesna diagnoza ciąży
Poprawa pomocy obsługo (porady)
Zapewnienie zdrowa i dobrostanu
METODY ZWIKSZENIA EFEKTÓW REPRODUKCJI:
BIOTECHNIKI:
Sztuczne unasienianie (SU, AI)
Transfer zarodków (ET)
Zapłodnienie in vitro (IVF)
Seksowanie nasienia
Seksowanie zarodków
Klonowanie
Produkcja zarodków in vitro IVP
TRANSGENEZA PRODUKCJA ZWIERZT TRANSGENICZNYCH
ORGANIZACJA ROZRODU
Właściwa organizacja i zarządzanie stadem wytw. między genetyką i biologią rozrodu
Organizacja rozrodu i zarządzanie stadem decyduje w 90% o efektach użytkowania
rozpłodowego. Toteż organizacji rozrodu należy poświęcić odpowiednio dużo uwagi.
DOBRY PROGRAM ORGANIZACJI ROZRODU OBEJMUJE:
Stałe obserwowanie wskazników płodności (baza danych)
Regularne obserwacje zwierząt
Analiza i interpretacja danych
GAÓWNE CELE WYKORZYSTANIA ROZRODU:
ę! genetycznej potencji stada przez wykorzystanie wysokiej jakości rodziców
Optymalizacja użytkowości rozpłodowej przez skrócenie okresów międzyciążowych
Minimalizacja błędów zarządzania i zaburzeń zdrowia i rozrodu
Minimalizacja brakowania z powodu niepłodności
2
W-2 ETAPY DETERMINACJI PACI
Płeć genetyczna determinowana w momencie zapłodnienia
Płeć fenotypowa determinowana jest u płodu,
Płeć behawioralna zdeterminowana po osiągnięciu dojrzałości płciowej zachowanie płciowe.
CHROMOSOMY PACIOWE:
SSAKI - samiec XY; samica XX
PTAKI samiec ZZ; samica ZW
Chromosom X jest większy niż Y, zawiera więcej DNA
GENY DETERMINUJCE PAEĆ
Na krótkim ramieniu chromosomu Y jest gen SRY warunkujący wykształcenie jąder.
Na chromosomach XX zidentyfikowano locus DSS - w podwójnej dawce warunkują wykszt. jajników.
MECHANIZM DETERMINACJI PACI
Prawidłowa segregacja gamet w efekcie genet. prawidłowa samica i samiec.
CHROMOSOMY PACIOWE
X Y
koń DS MA //mk: skróty => np Duży Submetacentryczny
bydło DS MM Mały Akrocentryczny, etc
kozy DA MM
owca DA mM
świnia ŚM MM
INTERSEKSY U ZW. GOSPODARSKICH
CHROMOS DROGI ZEWN.
SYNDROM GONADY
. PACI WYPROWADZAJCE GENITALIA
FRYMARTYNIZM
XX/XY jajnik/maskulinizacja m/f f
obydwie gonady /
OBOJNACTWO
XX/XY m/f m/f
ovotestis
PSEUDOHEMAFRODYTA M
XY XX jądra m/f m/f
PSEUDOHEMAFROD. F
XX jajniki m/f m
NIEPRAWIDAOWOŚCI KARIOTYPU U BYDAA
translokacje robertsonowskie są efektem fuzji centromerowej chromosomów
akrocentrycznych autosomów
FRYMARTYNIZM U BYDAA
Opisany też u owiec, kóz i świń.
Jałówka pochodz. z różnopł. blizniąt jest intersexem, jest bezpłodna.
Stwierdza się chimeryzm limfocytarny 60XX/60XY i przerost łechtaczki
BUCHAJ Z CHIMERYZMEM LIMFOCYTARNYM 60XX/60XY
nasienie buhaja XX/XY odznacza się nieznacznie gorszą zdoln. zapładniającą od prawidł.
osobników.
FUZJE CENTROMEROWE, TRANSLOKACJE ROBERTSOCSKIE
Polegają na połączeniu centormerami 2 akrcentr. autosomów i powst. formy meta- lub
submetacentrycznej.
Następuje zmniejsz. liczby chromosomów.
Fuzja 1:29 występuje najczęściej u bydła płd. syberyjskiego (91%) i u barrosa w Portugalii (69%)
3
LICZBA CHROMOSOMÓW I ZDOLNOŚĆ DO ROZWOJU
HYBRYDÓW MIDZYGATUNKOWYCH
GATUNKI I LICZBA CHROMOS. (2N) HYBRYDY
OJCIEC MATKA LICZBA CHROMOS. (2N) ZDOLN. DO ROZRODU
osioł (62) klacz (64) muł (63) sterylne
samce sterylne
koń (54) oślica (62) osłomuł samice zdarzają się
rzadkie wyjątki
zarodki resorbow./
koza (60) owca (54) (57)
poronione -6tyg. ciąży
bizon ameryk. (60) bydło (60) bufalo (60) samce F1 sterylne
METODY OKREŚLANIA PACI SEKSOWANIE
METODY CYTOGENETYCZNE
analiza chromatyny płciowej (ciałko Barra) w jądrach interfazowych
analiza obrazu chromosomowego w stadium metafazy podziału mitot. i identyfik. chromos.
płciowych X i Y
Podstawa: ustalenie kariotypu następuje po zapłodnieniu i nie zmienia się (z wyjątkiem frymartyn.)
CHROMATYNA PACIOWA
grudki chromatyny płciowej pochodzą z unieczynionego jednego z chromosomów X
obecność 2 grudek chromat. płciowej w jądrach kom. oznacza wystąpienie trisomii.
SEKSOWANIE ZARODKÓW METOD PCR
Dna jest wyekstrahowane z kom. met. elektroforezy.
ELEKTORFOREZA DNA ZARODKA
Elektofor. embrionalnego DNA na żelu umożliwia diagnozow. płci.
Próbki z dwoma paskami to samce, z jednym to samice (3, 5, 6, ...) [www.ciz.it/index.aspx?m]
SEKSOWANIE ZARODKÓW
met. inwazyjna pobieranie biopsji komórek trofobrastu zarodka, ekstrakcja DNA
SEKSOWANIE NA PODSTAWIE OBECNOŚCI GENU SRY
fluorescencja genu SRY oznacza samce, brak fluoresc. samice
EFEKTY ROZRODU WARUNKUJE:
Plenność poziom owulacji/wczesna śmiertelność zarodków
Wiek dojrzewania płciowego
Długość ciąży
Aatwość porodów
Zachowanie płciowe
Zachowanie matki
GENETYCZNA ZMIENNOŚĆ WSPÓACZYNNIKA REPRODUKCJI => warunkuje możliwości
doskonalenia /Hafez, 1980/
POTENCIALNE WIELKOŚCI ZMIANY GENETYCZNEJ W ODPOWIEDZI NA SELEKCJ
WIELKOŚĆ MIOTU TEORETYCZNA DOŚWIADCZALNA
owce 2.1 1.2
świnie 4.5 1.0
produkcja jaj 2.1 1.1
4
POZIOM OWULACJI BYDAO
Przeciętnie: 1.02-1.08
Bliznięta u ras mlecznych 1,9%
Bliznięta u ras mięsnych 0,4%
Śmiertelność embrionalna ~ 15%
POZIOM OWULACJI OWCE
najwyższy 1-5 ale plenność 1-3
Duże różnice rasowe:
karakuł 1,10 plenność ok. 0,90
merynos 1,35 plenność 1,14
wrzos. 2,0 plenność 1,80
Booroola W 5,04 plenność 2,14
POZIOM OWULACJI KONIE
Zwykle 1
częstość blizniaczych owulacji 3-30%
ciąże blizniacze 1-5%
W-3 GAÓWNE EFEKTY ŚRODOWISKOWE NA PROCESY REPRODUKCJI
CZYNNIKI ŚRODOWISKOWE
1. klimat strefa sezon
2. żywienie
3. utrzymanie użytkowanie
4. stresory
5. zanieczyszczenia
6. higiena
STREFA KLIMAT - SEZON
Większość ssaków żyjących w strefie umiark. i tropik. wykazuje sezonowe zmiany w rozrodzie.
W strefie tropikalnej są one związane z porą dżdżystą i suchą limitującą dostępność wody i paszy.
W strefie umiark. związ. jest to z fotoperiodem i temp.
KLIMAT TEMP. I WILGOTNOŚĆ
W klimacie umiarkow. normalny zakres temp. nie wywiera ujemn. wpływu na reprodukcję.
Przekroczenie wysokiej temp. krytycznej, zwłaszcza przy wysokiej wilgotn., może prowadzić do
hypertermii, działającej negatywnie na funkcje rozrodcze zarówno samic i samców.
SEZON
W klim. umiark. poszczególne gatunki dopasowują sezon rozrodczy zależnie od dł. ciąży tak, by
narodziny młodych wypadły w opt. terminie, tj. w okresie ciepłych m-cy.
ZWIERZTA DAUGIEGO DNIA przejawiają aktywność płciową wiosną i latem.
klacz (330 dni ciąży)
oślica (365 d.)
fretka (42 d.)
ZW. KRÓTK. DNIA sezon aktywn. pł. występuje najczęściej jesienią.
owce (ciąża 147 dni)
kozy (150 dni)
CZYNNIKIEM ODPOWIEDZIALNYM ZA RYTM REPROD. ZW. JEST FOTOPERIOD
Ekspozycja na długi dzień świetlny hamuje funkcje reprodukcyjne u zw. z sezonem pł. w okresie
krótkiego dnia i odwrotnie.
Głównym mediatorem efektów fotoperiodu na reprodukcję jest szyszynka
5
FUNKCJA SZYSZYNKI
Reguluje zmiany funkcji rozrodczych poprzez sekrecję melatoniny.
Synteza i sekrcja melatoniny jest najwyższa w okresie ciemności.
ŻYWIENIE
SYSTEM - pastwiskowe / alkierzowe
POZIOM ekstensywne intensywne
ad libitum, TMR dawkowane
GRUPOWE INDYWIDUALNE (transpondery)
PASZE:
udział białka i energii
udział pasz treściwych
udział włókna
niedobory witamin i skł. mineralnych
POWIZANIE ŻYWIENIA I PROCESÓW REPRODUKCJI
Wpływ żywienie na dojrzewanie płciowe
Efekt żywienia na proces spermatogenezy
Efekt żyw. na poziom owulacji
Żywienie a wczesna ciąża
Pózniejszy okres ciąży
Laktacyjne anoestrus
yYWIENIE DOJRZAAOŚĆ PACIOWA
dojrzałość płciowa jest ściślej powiązana z masą ciała niż wiekiem,
występuje przy osiągnięciu:
30-40% mc dorosłej u mlecznego bydła
45-55% u mięsnego bydła
Intensywne żywienie przyśpiesza osiągnięcie dojrzałości płciowej
ŻYWIENIE SPERMATOGENEZA
Wysoka zawartość białka w diecie zwiększa spermatog.
ŻYWIENIE OWULACJE
Flushing polega na zwiększeniu zawart. białka w diecie przed stanówką /King, 1993/
*/MK: wg profesorów: Sokoła (ZiP), Rekiel i Kulisiewicza (HTCh) => to poziom energii ma kluczowe znaczenie.../
NIEDOBORY SKAADNIKÓW ŚMIERTELNOŚĆ MAODYCH
SCHORZENIA GATUNKI PRZYCZYNY OPIS
BIAAYCH MIŚNI cielęta, jagnięta niedobór Se degeneracja mm
HIPOMAGNEZEMIA cielęta mleczne niedobór Mg zaburzenia nerwowe
ANEMIA prosięta niedob. Fe słabość
WOLE jagn., zrebięta niedob. I przerost tarczycy
HIPOGLIKEMIA prosięta noworodki niski poziom Glc upadki, brak apetytu
INTENSYWNOŚĆ ŻYWIENIA ROZRÓD
kryterium dawka/8 kg mleka dawka/18 kg mleka
I ruja dzień PP 46 59
Ciche ruje (%) 54 67
Okres między ciąż. 86 105
KORELACJE między produkcją mleka i :wynikami rozrodu 0,27
:schorzeniami wymienia 0,18
:chorobami metabolicznymi 0,44
6
Nowy indeks sel. dla rasy holsztyńskiej w RFN
Cechy cechy
produkcyjne reprodukcyjne
wydajności
mleka 50%
łatwość
Długość
wycielenia,
użytkowania
cechy budowy
zdrowe
martwe porody
25%
i typu 15%
wymiona 5%
płodność 5%
/schem./ Wzrost zapotrzebowania na energię do prod. mleka + wzrost pobrania energii w paszy
powodują ujemny bilans energetyczny, co wpływa na:
=>zahamowanie funkcji jajników => obniż. wskazników płodności,
=> upośledzenie funkcji układu odpornościowego i zaburzenia metaboliczne => zwiększenie częstości
zachorowań
NIEDOBORY ENERGII ZABURZENIA ROZRODU
U wysoko mlecznych krów we wczesnej ciąży wysoka EEM
Niedobory energii w końcu ciąży opózn. inwolucja macicy przedłuż. okr. PP
Hipokalcemia wypadanie macicy, zaleganie PP, zatrzymanie łożyska
Słabe żywienie jałówek niski % zapłodnień
PRZEKARMIANIE KRÓW ROZRÓD
Otyłość predyspozycja do wypadania pochwy i szyjki macicy
Syndrom tłustej krowy trudne porody
zaburzenia metaboliczne
-karoten zwiększa wskazniki płodności (więcej % cieląt po AI, krótszy okr. m.ciąż., mniej przypadków
jałowości, krótsza liczba dni PP do 1 rui)
PRZYCZYNY PORONIEC
pasze zawier. trujące rośliny,
toksyczne związki: azotyny, mykotoksyny, goitrogeny,
nadmiar białka w diecie,
stres termiczny,
substancje terapeutyczne: PG F2ą, kortykosterydy, estrogeny.
LAKTACYJNE ANESTRUS
u krów ras mlecz. lakt. nie wywołuje anoestrus.
wysoka prod. mleka opóznia wznowienie cykli rujowych
podobnie działa częsty dój.
krowy mięsne lub nursuring cows - utrzymanie prawidłow. rozrodu wymaga odpow. zabiegów
u świń w okr. karmienia prosiąt ruja nie występuje
po odłączeniu prosiąt 80% loch wznawia aktywność jajników w ciągu tygodnia.
u pierwiastek nawet 50% loch może nie wykazywać rui w ciągu tygodnia po odsadzeniu
u owiec dane kontrowersyjne z uwagi na różnice rasowe
szereg autorów sugeruje, że lakt. i lakt. + ssanie nie opóznia wznow. aktywn. jajników po
porodzie u owiec prawidłowo żywionych.
7
ZABURZENIA SPERMATOGENEZY
kadm
kolchicyna
insektycydy (np. DDT)
detergenty
Warunki intensywnej produkcji mleka upodabniają się we wszystkich krajach rozwiniętych
Cechami dominującego systemu są:
Duże stada utrzymywane systemem bez-uwiązowym,
Malejący udział pastwiska w żywieniu krów,
Dawki pokarmowe z dużym udziałem pasz treściwych,
Wysoka obsada kojca,
Dla zachowania higieny trzeba bardzo dużo ściółki!!!
Zapobieganie niekorzystnym konsekwencjom jednostronnej selekcji na wydajność:
Włączenie cech reprodukcyjnych płodności i zdrowotności do indeksów selekcyjnych
Niestety krajowy program oceny buhajów w dalszym ciągu uwzględnia jedynie cechy
produkcyjne
Dobór buhajów pod względem cechy łatwych porodów ograniczają śmiertelność młodych
ROZRÓD W SYSTEMIE EKSTENSYWNYM I INTENSYWNYM
Obora głęboka:
Komfort
Wyższe koszty ściółki
Pracochłonność korekta racic
Higiena?
Wymię?
Schorzenia gruczołu mlekowego przenoszą się łatwo na narządy rodne i odwrotnie
MMA noworodek !macica !gruczoł mlekowy !Noworodek
Obory ściółkowe zapewniają komfort leżenia, racice wymagają jednak częstej korekty
Kulawizna - rozród
Stres skutecznie hamuje aktywność jajników
ZABURZENIA ZACHOWANIA SEKSUALNEGO I MATCZYNEGO
Nieprawidłowo prowadzone:
Dój
Transport
Strzyża
Przegrupowanie
Przepędy
Wykorzystanie od wypasu ostrego psa
Dostarczają zwierzętom silnego stresu i negatywnie działają na wyniki rozrodu
Amoniak...
Ulatniając się z kanałów gnojowych i przez szczeliny podłogowe uszkadzają receptory węchowe
i blokują działanie feromonów płciowych
Czyste powietrze
Uwarunkowane jest:
Dobrą wentylacją
Niską koncentracją bakterii
Rozwój bakterii hamują:
Niska wilgotność powietrza
Niska temperatura
8
Woda
Przyczyną schorzeń może być brak ujścia czystej wody
Do niezabezpieczonych studni mogą penetrować wody gruntowe, wypłukujące pestycydy,
insektycydy, nawozy, gnojówka
Przy braku szczelnych zbiorników na gnojówkę zawiera azotyny i bakterie Coli
Toksyczne substancje w paszach pochodzących ze skażonego środowiska
Metale ciężkie
Pestycydy
Ochratoksyny
Mogą powodować niepłodność lub poronienia
PROFILAKTYKA TO HIGIENA
Pomieszczeń/żłobów
Doju/hali udojowej
Gruczołu mlekowego
Skóry/pasożyty
Dezynfekcja racic/baseny do płukania
Zabiegu SU
Porodu
Muchy/gryzonie/pasożyty skóry
ORGANIZACJA ROZRODU
Wykrywanie rui obserwacje
Stosowanie metod wspomagających
Sterowanie hormonalne
Sterowanie fotoperiodu
Wykorzystywanie efektu samca
KONTROLA ROZRODU
Badanie ciąży
=> Metoda palpacyjna
=> Metoda USG
Badania okresowe
=> Krowy 14 po porodzie
=> 6 tyg. po porodzie
BIOLOGICZNY CYKL ŻYCIOWY ZWIERZT GOSPODARSKICH
Spotkanie gamet i zapłodnienie
Rozwój prenatalny i wzrost
Narodziny i rozwój postnatalny
Pokwitanie i dojrzałość płciowa
Brakowanie?
Kopulacja i reprodukcja
Zanik zdolności do rozrodu
Śmierć
W ODNIESIENIU DO REPRODUKCJI WYRÓŻNIA SI 5 OKRESÓW ŻYCIA
Okres poprzedzający dojrzałość płciową
Okres dojrzałości płciowej (pokwitania)
Okres dojrzałości do rozrodu (zootechniczny)
Okres reprodukcyjny
Okres post reprodukcyjny
9
CYKL REPRODUKCYJNY
Zależnie od gatunku obejmuje:
Sezony aktywności płciowej
Cykle płciowe
Kojarzenia
Ciąże
Okresy ssania / odsadzania
Okres braku aktywności anoestrus
CYKLE RÓŻNICE GATUNKOWE
Policykliczne sezonowe: klacz, owca, koza
Policykliczne typowe: krowa , świnia
Monocykliczne: suka
ANOESTRUS
Okres poprzedzający dojrzałość płciową
Okres ciąży
Okres post partum do wznowienia cykli
Anoestrus laktacyjne
Anoestrus sezonowe
Anoestrus patologiczne (przetrwałe ciałko żółte, nimfomania, cysty jajnikowe)
PODSTAWOWE HORMONY REPRODUKCJI
Regulują różne aspekty rozrodu:
Spermatogeneza ejakulacja
Oogeneza owulacja
Zachowanie płciowe
Zapłodnienie implantacja
Utrzymanie ciąży
Poród
Zachowanie mateczne
Laktacja
HORMONY DRUGORZDOWE DLA REPRODUKCJI
Są to hormony kompleksu metabolicznego niezbędne do przebiegu:
Metabolizmu
Wzrostu
Dobrostanu
GAÓWNE HORMONY REPRODUKCJI
PODWZGÓRZE:
Gn-GR gonadoliberyna warunkują uwalnianie gonadotropin
LH-RH luliberyna FSH i LH
PRZEDNI PAAT PRZYSADKI (PPPM):
FSH stymuluje wzrost pęcherzyków
LH Warunkuje owulacje
PRL prolaktyna pobudza CL, zachowanie mateczne i laktacje
REGULACJA PITROWA
Ukł. Limbiczny
Podwzgórze
Przysadka
Jajniki, jądra
Mózg !neurotranspodwzgórzeGnRHprzysadkaFSH, LHgonadyestrogeny, progesteron
androgenymózg, podwzgórze, Przysadka
10
ROLA PODWZGÓRZA:
Supraoptic nukleus i Suprachiasmatic nucleus => kontrolują toniczne uwalnianie LH i FSH
Arcuate nucleus i Paraventricular nucleus => kontrolują przed owulacyjny wyrzut LH i FSH
REGULACJA FOTOPERIODU - REGULACJA PODWZGÓRZA
Fotoreceptor (zrenica) zegar (SCN) Przekaznik (szyszynka, melatonina) efektor (podwzgórze, PM)
MELATONINIA DZIAAANIE
Melatonina dociera do jądra SCN (suprachiasmatic) w podwzgórzu i do przedniej części przysadki i
hamuje sekrecje podwzgórzowych hormonów uwalniających gonadotropiny oraz gonadotropin z PM
EFEKT PRZYSADKI U ZWIERZT Z SEZONEM DAUGIEGO DNIA
Główny hamujący efekt szyszynki dotyczy sezonu krótkich dni jesień i zima
W miarę wydłużania się dni aktywność szyszynki obniża się
Wydaje się ze wywiera jednak hamujący efekt na sekrecje hormonów podwzgórzowych również
u zwierząt z sezonem długich dni wiosną i latem
Relacja sezon rozrodczy dojrzewanie
Dojrzewanie płciowe u owiec sterowane częściowo przez sezon rozrodczy
Jeżeli system regulacji hormonalnej jest dostatecznie rozwinięty u jagniąt dojrzewanie może
wystąpić wcześniej
Marzec wrzesień = 150 dni
Maj/czerwiec 1 ruja w następnym sezonie = ok 500 dni
CYKL PACIOWY
W cyklu występują 3 fale dojrzewania pęcherzyków
Ulegają one atrezji z wyjątkiem pęcherzyka dominującego
Luteoliza CL
PGF2ą z żyły macicznej przenika do tętnicy jajnikowej wywołując regresje ciałka żółtego
FOLIKULOGENEZA ROLA
Rekrutacja zachodzi każdego dnia, czynnik ???
Wczesne stadia mogą zachodzić u hypofyzektonizowanych samic bez udziału gonadotropin tylko
tempo jest zwolnione
Końcowy wzrost i wytworzenie jamki zależnie od FSH i LH
TYPY OWULACJI
Owulacja spontaniczna: wszystkie zwierzęta gospodarskie
Owulacja prowokowana: królica, kotka
UWARUNKOWANIE OWULACJI
Hipotetyczny sygnał z ukł. Limbicznego centralnego systemu nerwowego są przekazywane
neurotransmitery do jądra nadwzrokowego SON i jądra nad skrzyżowaniem SCN
?
!
Stymulacja pulsów GnRH
!
Stymulacja impulsów LH
!
Receptory pęcherzyków pobudzenie wzrostu
!
Utworzenie jamki
!
Zwiększona sekrecja E2
!
Wyrzut gonadotropin
!
OWULACJA
11
OWULACJA PCHERZYKA
Wzrost ukrwienia
Enzymy lityczne
PGF2ą stigma
PGF2ą skurcze
Pęknięcie pęcherzyka
Ot skurcze wyrzut oocytu
Hormony jajnika CL (corpus lutheum)
Duże komórki lutealne produkują progesteron (P) i oksytocynę (Ot)
Zawierają większość receptorów prostaglandyny F2ą (PGF2ą), a niewiele receptorów LH
Małe komórki lutealne produkują progesteron i zawierają większość receptorów LH
Ciałko żółte (dojrzałe)
Ciałko żółte krwiste
CL ulegające regresji
CL przetrwałe
Stare CL CL białawe
CL ciążowe
Cysta ciałka żółtego
CL najlepszy wskaznik funkcji jajnika (zmiany progesteronu)
W - 6
HORMONY JAJNIKA PCHERZYKI
Komórki osłonki (theca) przodują androgeny. Przenikają one do komórek ziarnistych (granulosa) i przy
udziale aromatazy są przekształcane w estrogeny.
PRODUKTY SEKRECYJNE KOMÓREK ZIARNISTYCH
Estrogeny
warunkują zachowanie mateczne
skurcze macicy
Progesteron
hamuje sekrecje gonadotropin
warunkuje utrzymanie ciąży
Oksytocyna
wywiera efekt luteolityczny
powoduje skurcze pęcherzyka (owulacja)
Inhibina kontroluje sekrecje FSH
Gonadotropina kontroluje receptory LH komórek Theca
Relaksyna rola w cyklu nie wyjaśniona, w ciąży rozluznia kanał rodny
OMI inhibitor dojrzewania oocytów pierwotnych
MIH inhibitor przewodów Mullera
MACICA
Śluzówka macicy jest głównym miejscem syntezy PGF2ą (luteolizyna) ponieważ jest
odpowiedzialna za luteizę CL
Zmiany śluzówki macicy zależne od stadium cyklu sekrecji progesteronu i estrogenów
Skurcze macicy wywołują prostaglandyna F2ą, oksytocyna estrogeny
Szyjka macicy w cyklu
Najkorzystniejsze dla plemników przejście przez szyjkę zapewnia wysoki poziom estrogenów
HORMONY JDRA
Komórki Leydiga Interstycjalne produkują androgeny, końcowym produktem jest testosteron
12
Znaczenie komórek Sertoliego
Syntetyzują białko wiążące androgeny ABP
Pod kontrolą FSH i aromatazy dokonują konwersji testosteronu do estradiolu 17
Dzięki całkowicie zamkniętym szczelnie ciasnym przejściom zabezpieczają plemniki przed
zmianami chemicznymi składu krwi tworząc barierę krew jądra
PRODUKTY SEKRECYJNE KOMÓREK SERTOLIEGO I GAÓWNE EFEKTY
ABP białko wiążące androgeny transport T
Estrgeny, estradiol 17 kontrola FSH
Gonadocrina kontrola LH i R-LH
Inhibina kontrola FSH
IGF-1 wzrost i zróżnicowanie się k. Zarodkowych
IGF-2 obecność ???
MIH (jądra płodu) hamuje rozwój przewodów Mullera
DZIAAANIE ANDROGENÓW
Androgeny testosteron oraz dehydrotestosteron (DHT) warunkują:
Spermatogenezę,
Zachowanie płciowe,
Rozwój gruczołów dodatkowych.
ZMIANY FUNKCJI JDER
Przebiegają równolegle zmiany aktywności płciowej samic u gatunków z rozrodem ciągłym
i sezonowym
Przejawiają się zmianami masy jąder, objętość ejakulatu i jakości plemników
LEPTYNA NOWO ODKRYTY HORMON
Produkowany przez tk. Tłuszczową
Główny narząd docelowy to podwzgórze poprzez które wywiera specyficzny wpływ na:
Apetyt
Metabolizm energii
Reprodukcję
Rola leptyny w procesie reprodukcji
1. Niedostateczne żywienieniedostateczne otłuszczenieniski poziom
leptynyobniżona płodność
2. Myszy otyłeotyłość leptyna nieobecnaniepłodność
3. myszy otyłeegzogenna leptoryna (terapia zastępcza)wysoki poziom leptyny
lub obfite żywienie dostateczne odtłuszczenie wysoki poziom leptyny
a) samice ę!LH ę!masa jajników i macicyprawidłowa płodność
b) samce ę!FSH ę!masa jąder i gruczołów dodatkowych ę!liczba plemników prawidłowa płodność
Działanie leptyny
Leptyna hamuje pobieranie pokarmu poprzez działanie na centrum sytości
Hamuje sekrecje insuliny zarówno bezpośrednio przez działanie na komórki i osłabia jej
działanie w mięśniach z tk. tłuszczowej
Działa na aktywność płciową modulując uwalnianie GnRH z podwzgórza
DOJRZAAOŚĆ OOCYTU DO ZAPAODNIENIA
Przed owulacją oocyt I rzędu zatrzymany w stadium profazy I podziału mejotycznego przechodzi
dojrzewanie do zapłodnienia
1. Obejmuje to zanik otoczki jądrowej = rozpad pęcherzyka zaprdkowego GVBD
2. Utworzenie płytki metafazalnej nierówny podział cytoplazmy: oocyt II rzędu i PbI
3. Oocyt ma haploidalną liczbę chromosomów
4. Rozpoczyna się metafaza II
13
Jak odróżnić oocyt dojrzały od zapłodnienia?
Wyrzucenie PbI
Oocyt posiada haploidalną liczbę chromosomów
Transport plemników
U bydła plemniki docierają do jajowodu w 2 godziny po kopulacji
Do bańki jajowodu docierają do 8 godzinach
Na miejsce zapłodnienia dociera tylko niewielko frakcja ejakulatu
Jak odróżnić jajo zapłodnione od nie zapłodnionego?
Po wniknięciu plemnika następuje wyrzucenie PbII
Transport zarodka do macicy
Po zapłodnieniu bruzdkowanie i transport do macicy
W macicy wylęganie blastocysty
Bruzdkowanie
W procesie bruzdkownia blastocysta nie rośnie
Zwiększa się jedynie liczba komórek
W rezultacie ulega niekorzystnym zmianom (zmniejszeniu) stosunek cytoplazmatyczno/jądrowy
Wylęganie blastocysty
Osłonka przejrzysta ulega przecienieniu
Po opuszczeniu osłonki blastocysta zaczyna szybko rosnąć
Jak zarodek daje znać o swojej obecności w macicy?
Zarodki wszyst. gat. w okresie przed implantacją syntetyzują białka, polipeptydy i sterydy
U przeżuwaczy utrzymanie CL warunkują polipeptydy produkowane przez trofoblast.
Białka te typu oTP-1. bTP-1... Zidentyfikowane jako interferon-t są sygnałem obecności zarodka
MATECZNE ROZPOZNAWANIE CIŻY POCZTEK (DNI)
GATUNEK POCZTEK SYGNAAÓW
BYDAO 16-17
OWCE 12-13
ŚWINIE 10-12
KONIE 14-16
SYNCHRONIZACJA ZARODEK MACICA
Sygnały biochemiczne uwalniane przez zarodek do systemu matecznego:
Przeprowadzają luteolize
Warunkują immunotolerancje między matką a zarodkiem działanie immunosupresyjne
Modyfikują sekrecje białek produkowanych przez macicę
W-8
RÓŻNICOWANIE SI KOMÓREK ZARODKA
Komórki trofoblastu produkują specyficzne białko bTP-1 = interferon-tbliok PGF2ą = blok luteolizy
Hamowanie luteolizy
U świń PGF2ą we wczesnej ciąży nie jest zahamowana, ale skutek jest osiągany poprzez
reorientacje uwalniania PGF do światła macicy
Zarodki muszą być jednak w obydwu rogach (minimum 2 w każdym rogu)
14
ZNACZENIE MIGRACJI
U gat. wielopłodowych migracja prowadzi do równomiernego rozmieszcz. zarodków w macicy
Zapewnia przekazywanie sygnałów w obydwu rogach macicy
Zapewnia utrzymanie wysokiego poziomu progesteronu
MIGRACJA - RÓŻNICE ZARODKOWE
U owiec migracja jest zjawiskiem rzadkim
Nie występuje u krów, brak migracji stanowi problem przy hormonalnej produkcji blizniąt
w przypadku mnogich owulacji na jednym jajniku
U świni od 5 do 9 dnia zarodki przemieszczają się w macicy i mieszają się z zarodkami
z przeciwległego rogu
U klaczy zarodki migrują z jednego rogu do drugiego 13 razy na dobę
Zanik migracji wydłużenie i początek zagnieżdżenia (dni)
GATUNEK ZAGNIEŻDŻENIE
BYDAO 28-32
OWCE 14-16
ŚWINIE 12-13
KONIE 35-40
STOPIEC WYDAUŻANIA SI BLASTOCYSTY RÓŻNICE GATUNKOWE
Bydło Nieznacznie
Owce 10 -20cm
Świnie Do 1m
Konie 6-7 cm
Pod wpływem czynników wzrostowych blastocysta szybko się wydłuża
Blastocysta świnie długość >150cm
SEKRECJA ENDOMETRIUM DO ŚWIATAA MACICY WARUNKUJE:
Odżywianie się zarodka
Stymuluje wzrost zarodka
Preimplantacyjny rozwój zarodka
IMPLANTACJA - AOŻYSKO
Z trofoblastu otaczającego węzeł zarodkowy wytwarzają się błony płodowe
Zespolone bł. kosmókowa i omoczniowa pokryte kosmkami wnikają w ścianki endometrium
tworząc łożysko
Warunkuje ono transport gazów, wody i składników odżywczych pełni rolę bariery
immunologicznej, a także działa jako gruczoł dokrewny
IMPLANTACJA RÓŻNICE GATUNKOWE (DNI)
GATUNEK IMPLANTACJA
BYDAO 40-45
OWCE 28-35
ŚWINIE 25-36
KONIE 95-105
ŚMIERTELNOŚĆ EMBRIONALNA I ŚWIC
Straty zarodków w ciągu jednej ciąży mogą wynosić od 25 do 40 %
U świń około 2/3 strat ma miejsce przed matecznym rozpoznaniem ciąży
Pozostałą część strat ma miejsce przez 40 dniem ciąży
W tym okresie zarodki są resorbowane
15
CIŻA BLIyNIACZA U KACZY
Ok. 20% cykli kończy się owulacją 2 pęcherzyków i w około 50% obydwa zostają zapłodnione
Zwykle zagnieżdżają się w endometrium blisko siebie w jednym rogu
Dostateczny kontakt do przeżycia ma tylko jeden zarodek
Nawet gdy obydwa urodzą się żywe nie udaje się utrzymać ich przy życiu
AOŻYSKO JAKO GRUCZOA DOKREWNY
PRODUKUJE:
Gonadotropiny łożyskowe
TSH, ACTH, STH
Hormony płciowe
Kortykosteroidy
Relaksynę
GONADOTROPINY AOŻYSKOWE
PMSG eCG blokują przysadkowe gonadotropiny
W ciąży przysadka nie wydziela gonadotropin
Sekrecja zaczyna się bezpośr. po implant., u klaczy przypada na okr. tworzenia się dodatk. CL
SOMATOMAMMOTROPINA LAKTOGEN AOŻYSKOWY
Stymuluje wzrost podobnie jak hormon przysadki mózgowej
Pobudza wzrost gruczołów mlekowych, a następnie laktacje
Pobudza metab. matki, wzmaga lipolizę poprzez co oszczędza Glc i AA wykorzyst. przez płód
HORMON KORTYKOTROPOWY PODOBNY DO PRZYSADKOWEGO ACTH
Produkowany przez łożysko w niewielkiej ilości
Działa na nadnercze płodu powoduje uwaln. kw. askorbinowego miejsce synt. kom. trofoblastu
RELAKSYNA
Aożysko bierze udział w wytwarzaniu relaksyny
Uwalniana przed porodem, powoduje rozluzn. więzadeł kanału miednicznego szyjki macicznej
HORMONY STEROIDOWE
Estrogeny, PRG, androgeny, kortykosterydy wykazano w łożyskach wielu gatunków ssaków
Hormony łożyska przechodzą do krwi matki
Kontrolują utrzymanie łożyska, rozwój doczesnej i metabolizm matki w czasie ciąży
ŚMIERTELNOŚĆ PRENATALNA
Przeciętnie odpowiedzialna jest za 30% nieudanych ciąży
Dzieli się je na:
Śmiertelność embrionalna przed lub bezpośrednio po implantacji resorpcje
Śmiertelność płodowa poronienia lub mumifikacje płodów
PRZYCZYNY ŚMIERTELNOŚCI
Laktacja wysoka wydajność
Aberracje chromosomowe
Hormonalne zaburzenia
Żywienie niedobory fitoestrogeny
Zaawansowany wiek matki
Nadmierna liczba zarodków w macicy
Stres termiczny
Jakość nasienia, czas przechowywania
Immunologiczne konflikty
PORONIENIA
Mogą być:
Spontaniczne vs. Prowokowane
Zakazne vs. Niezakazne
Spontaniczne poronienia są częstsze u bydła mlecznego niż u owiec i koni
Niezakazne spontaniczne poronienia mogą mieć przyczyny genetyczne, hormonalne lub żywieniowe
16
SYNDROM MUMIFIKACJI
Genetycznie uwarunkowany
Występuje często u bydła ras Jersey i Guernsey
ZACHOWANIA MATECZNE (BM)
Determinanty behawioru matecznego
Krytyczny okres pierwsze godziny post partum: separacja noworodka po porodzie wywołuje zanik
behawioru matecznego
Czas potrzebny do wytworzenia więzi
Po upływie 24 h od porodu odłącznie noworodka od matki nie wywiera efektu na BM
Okres ten wystarcza by nastąpił imprinting
Imprinting wytworzenie więzi między obiektem widzianym przez noworodki po porodzie to
percepcyjne uczenie się
Lorenz 1955 etolog nagrodzony Noblem w słynnym doświadczeniu wykazała że: imprinting
może wystąpić między osobnikami obcymi gatunkowo
ZNACZENIE ZACHOWANIA MATECZNEGO
Zachowanie mateczne warunkuje utrzymanie noworodków przy życiu.
Uwarunkowania hormonalne BM
Głównym czynnikiem warunkującym zachowanie mateczne jest sekrecja oksytocyny (Ot)
Sekrecja Ot zwiększa się w czasie porodu, ssania/doju, po kopulacji
Iniekcje Ot wywołują BM u dziewiczych samic
Estrogeny są jedynie czynnikiem wspomagającym BM
BRAK BEHAWIORU MATECZNEGO
Występuje częściej u pierwiastek (nawet do 10%) niż u wieloródek
U pierwiastek sekrecja Ot jest niższa niż u wieloródek
Poziom braku doświadczenia w stosunku do wieloródek
KONTROLA SENSORYCZNA WIZI MATKA- MAODE
Węch silnie atrakcyjny zapach wód płodowych działa na samice, działanie na bliską odległość
Wycięcie receptorów węchowych zapach wód płodowych nie działa na samice, nie liżą
młodych, brak zachowania matecznego
Organ Jacobsona w jamie nosowej stanowi węchowy receptor zapachowy
Nos przy ustach dowodzi że substancje zawarte w ślinie działają jako feromony umożliwiające
wzajemne rozpoznawanie się
Wzrokowo najsilniejsze sygnały z głowy, inne partie ciała mniej ważne
Wokalizacja na dalszą odległość, w dużym stadzie
RÓŻNICE GATUNKOWE
Owce, kozy bydło konie silna kontrola sensoryczna
Świnie słaba kontrola tolerancja na podłożenie obcego noworodka
GAÓWNE FUNKCJE WIZI
Stymulacja
Karmienie
Ogrzewanie
Ochrona przed zagrożeniem
STYMULACJA LIZANIE NOWORODKA
Usuwa błony płodowe
Osusza pokrywę
Stymuluje krążenie, oddychanie, aktywność oddawanie kału i moczy, poprawia higienę
17
W-8 cd
Nauka postępując za matką zrebak uczy się pobierać inne pasze niż mleko
Karmienie umożliwianie ssania
Problemy: U pierwiastek
W stanach zapalnych gruczołu mlekowego
Ogrzewanie młodych
Konieczne u świń, gryzoni, ptaków, zw. futerkowych (brak okrywy opózniona termoregulacja)
Ochrona przed zagrożeniem matka zasłania sobą młode
MATECZNY BEHAWIOR SPECYFIKA GATUNKOWA
ZACHOWANIE OWCA KROWA KLACZ LOCHA
GNIAZDO - - - +
WYLIZYWANIE + + + -
ZJADA AOŻYSKO +/- +/- - +
UCIEKA PRZY SSANIU + + + -
ATAKOWANIE + + + -
KANIBALIZM - - - +
ZABURZENIA ZACHOWANIA MATCZYNEGO
Brak więzi - opuszczanie (owce)
Brak lizania (owce)
Brak karmienia (pierwiastki)
Kanibalizm (lochy, gryzonie, mięsożerne)
Agresja bicie (owce, krowy, klacze)
Adopcja wykradanie noworodków (owce)
Brak więzi brak karmienia
KONTAKT
Matka i młode są razem sygnały niskie i łagodne
Matka oddala się sygnały wysokie nawołujące
Ścisłą więz matka-młode wyraża się często kontaktem fizycznym
Adopcja wykradanie noworodka
PREFERENCJE SUTEK
Prosięta wybierają najliczniej przednie sutki
Preferencje sutka ustalają się wyraznej w dalszych miotach
UPADKI OKRESU OKOAO PORODOWEGO !Brak BM, bezmleczność przygniecenia
!Defekty genetyczne, środowiskowe
!Środowisko hipotermia drapieżniki
!Skutki dystokii ciężki poród, urazy niedotlenienie
POZIOM NEONATALNEJ ŚMIERTELNOŚCI
U bydła i koni 5-15% strat
U świń i owiec 20-30% strat
GAÓWNE KIERUNKI BIOTECHNOLOGII ROZRODU ZWIERZT
Biotechnologia rozrodu jest specjalnością obejmującą różne metody oparte głównie na osiągnięciach
z dziedziny fizjologii, endokrynologii, embriologii, gamet i zarodków
KIEROWANIE ROZRODEM W CELU ZWIKSZENIA EFEKTÓW REPRODUKCJI
Sterowanie sezonem płciowym
Cyklem rujowymsynchronizacja rui
Indukcja płodów
Ronień
Laktacji
18
PODNOSZENIE WYDAJNOŚCI ROZRODCZEJ SAMCÓW
Sztuczne unasienianie
Doskonalenie kriokonserwacji nasienia
Zapładnianie in vitro
Zapładnianie in vitro wspomagane mikrochirurgicznie
Automatyzacja oceny nasienia
PODNOSZENIE WYDAJNOŚCI ROZRODCZEJ SAMIC
Superowulacja MO
Wywołanie rui poza sezonem
Transfer zarodków - ET
Produkcja in vitro - IVP
Pozyskiwanie oocytów OPU
Dojrzewanie oocytów IVM
Zapłodnienie oocytów IVF
Hodowla oocytów - IVC
KRIOKONSERWACJA IZOLOWANYCH KOMÓREK ROZRODCZYCH
Mrożenie i witryfikacja zarodków i oocytów
Mrożenie nasienia
Magazynowanie gamet i zarodków
MIKROMANIPULACJE NA ZARODKACH
Dzielenie zarodków
Izolowanie blastomerów
Enukleacja zarodków i oocytów
Produkcja chimer
Klonowanie komórek zarodkowych i somatycznych
Uwalnianie zarodków od patogenów
Wprowadzanie do zarodków obcych genów transgeneza
DIAGNOSTYKA
Diagnostyka ciąży, USG
Ocena poziomu owulacji (laparoskopia)
Ocena jakości zarodków i oocytów
Ocena jakości plemników
Indukcja poronień
Indukcja porodów
Seksowanie zarodków
Seksowanie nasienia
Testy hormonalne (np. Ciąży, stanu funkcjonalnego jajników)
SZTUCZNE UNASIENIANIE HISTORIA
Najstarsza biotechnika rozrodu
1780 Spalanzani na psach
1914 Amantea psy
1922 Ivabov bydło Konie owce
1933 Nikołajew sztuczna pochwa
1933 Kuzniecowa rozcieńczanie żółtko
1940 Sorenson przechowywanie
1952 Polge mrożenie w ciekłym azocie
1960 wykorzystanie SU w szerokiej praktyce
SU OBECNIE
Biotechnika stosowana na całym świecie do rozmnażania wszystkich gatunków zwierząt gospodarskich,
drobiu, pszczół wielu ssaków mięsożernych w tym również dziko żyjących, zwłaszcza gatunków
zagrożonych wyginięciem
19
ZABIEG SU OBEJMUJE:
Kolekcje nasienia od samca
Ocenę jakości i koncentracji
Rozcieńczenie nasienia i konfekcjonowanie
Przechowywanie (kriokonserwacja)
Wprowadzenie do dróg rodnych samicy w odpowiednim okresie rui
KOLEKCJA
Nie należy nakładać sztucznej pochwy na prącie, tylko trzeba podstawić
SZTUCZNE UNASIENIANIE UMOŻLIWIA
OCEN:
Jakości nasienia
Gęstości ruchliwości
Zdrowotności, która warunkuje eliminacje chorób krycia
Można również ocenić ruch postępowy plemników pół automatycznie
CEL SU
Poprawa efektów rozrodu samca
Przyspieszenie efektów doskonalenia zwierząt
Zwalczanie chorób wenerycznych przenoszonych w trakcie kopulacji
LICZBA SAMIC NA 1 REPRODUKTORA W ROKU
SAMIEC KRYCIE NATURALNE SU Z 1 EJAKULATU
BUHAJ 150 krów 300 krów
OGIER 60 90 klaczy 30 klaczy
KNUR 40 loch 40 loch
TRYK 30 maciorek 100 maciorek
ZALETY SU
Umożliwia szeroki wykorzystanie najlepszych osobników;
Sunny Boy z Kalifornii dostarczył 2 000 000 dawek nasienia
Zwiększenie zasięgu efektu samca,
Umożliwia wprowadzanie nasienia najlepszych buhajów światowych na małe fermy,
Ułatwia transport,
Znikają bariery weterynaryjne,
Ułatwia ocenę na potomstwie.
DAUGOTRWALE PRZECHOWYWANIE UMOŻLIWIA
Wykorzystanie nasienia po uboju dawcy
Utworzenie rezerwy genetycznej
Rozród poza sezonem płciowym
UAATWIA TWORZENIE GRUP TECHNOLOGICZNYCH
UMOŻLIWIA:
Wykorzystanie nasienia samców niezdolnych do krycia
Unasienianie w jednym terminie dużej liczby samic
Ułatwia wykorzystanie synchronizacji rui
SKUTECZNOŚĆ ZABIEGU
Zależy od:
wysokiej jakości nasienia
Zdrowia i kondycji rozpłodowej samicy Inseminacja we właściwym momencie cyklu rujowego
Właściwe techniki rozmrażania nasienia i inseminacji
Efektu inseminatora
20
W-9 KLONOWANIE ZARODKÓW
NARZDZIA DO MIKROMANIPULACJI:
Igła
Pipeta podtrzymująca zarodek
Pipeta do przenoszenia, enukleacji i in
Utrzymanie zarodka pozycji nieruchomej jest warunkiem precyzyjnego wykonania manipulacji.
Pipeta służąca do tego celu jest tempo zakończona, krawędzie ma zaokrąglone, - bardzo mały otwór
służy do wytwarzania podciśninienia
Enukleacja oocytów, zygot i blastomerów metodą Mc Gratha i Soltera [1983]
PIONIERZY KLONOWANIA
Tarkowski [1959] uzyskał rozwój zarodka myszy z pojedynczego blastomeru
Wiladsen [1980] wykorzystał zarodki 2-8 komórkowe
NIE WIADOMO DOKAADNIE KIEDY NASTPUJE UTRATA TOTIPOTENCJI...
Wg proponowanej przez Tarkowskiego 1959 i Tarkowskiego&Wróblewską, [1967] hipotezy inside-
outside zewnętrznie położone blastomery ulegają zmianom prowadzącym do wytworzenia trofoblastu.
Natomiast te wewnętrzne nie mające kontaktu ze środowiskiem utworzą węzeł zarodkowy
KLONOWANIE METOD IZOLACJI BLASTOMERÓW
Willadsen [1979] uzyskał identyczne bliznięta metodą izolacji blastomerów, rekonstruowane zarodki
umieszczał w żywym inkubatorze
Izolowane blastomery umieszczał w zastępczej osłonce przejrzystejzatopiony w małych cylindrach
agarowych (0,15*0,5 1,0 mm)zatopiony w dużych cylindrach agarowych (0,7*2,0 2,5 mm)
przeszczepienie do pierwszej biorczyni, owcy z podwiązanym jajowodem wydobycie blastocysty po
3,5 4,5 dniach usunięcie cylindrów agarowych i przeszczepienie do owcy, ostatecznej biorczyni
w 5 dniu owulacji monozygotyczne bliznięta
PROCEDURA KLONOWANIA IZOLOWANYCH BLASTOMERÓW
Po opanowaniu techniki hodowli in vitro IVC metodą uproszczoną
Zastosowano różne metody fuzji:
Glikol polietylenowy
Pole elektryczne
Wirus Sendai
Klonowanie seryjne z wykorzystaniem izolacji blastomerów 8 komórkowych zarodków
Zarodki 8 kom. dezagregacjafuzja z enukleowanymi oocytamihodowlasklonowane blastocysty
PRODUKCJA IDENTYCZNYCH BLIyNIT PRZEZ PODZIAA MORULI/BLASTOCYSTY
Metoda ta jest dokładniejsza, pozwala na eliminacje 2 kłopotliwych procedur tj.
Zatapianie w agarze
Pośrednią biorczyni
Wykorzystana szeroko w produkcji identycznych blizniąt u zwierząt gospodarskich, zwłaszcza: owiec
kóz i bydła
1. Przygotowanie do bisekcji
2. Przecięcie osłonki przejrzystej
3. Wyjmowanie zarodka z osłonki przejrzystej
4. Bisekcja zarodków
5. Cięcie można wykonać igłą szklaną lub nożykiem wykonanym z ostrza żyletki
6. Pakowanie ołówki do osłonki
7. Osłonkę przejrzystą pozyskuje się z enukleowanego oocytu lub zarodka
8. Połówki w zastępczych osłonkach
9. Większy zarodek ma lepsze szanse na utrzymanie ciąży
21
PRZEŻYWALNOŚĆ ZARODKÓW W MACICY
Małe zarodki wprowadzone do dróg rodnych nie są zdolne do wysyłania dostatecznie silnych sygnałów
ciążowych (interferon T) warunkujących zahamowanie luteizy ciałka żółtego
BISEKCJA ZARODKA W PIPECIE
Bisekcja moruli jest b. skuteczna jeżeli jest przeprow. w stadium compact czyli moruli obkurczonej
Dzielenie blastocysty
Ważna jest prawidłowa oś podziału blastocysty
Hodowla komórek macierzystych do klonowania myszy
Klonowanie myszy z użyciem komórek węzła zarodkowego
Usunięcie ICMiniekcja ESCkonstruowana blastocystatransfer do biorczynimysz całkowicie
wywodząca się z ESC
BISEKCJA OSZCZDZAJCA
Nacięcie osłonki przejrzystej zarodka w stadium póznej blastocysty stymuluje wylęganie się przez
powstały otwór tworzy się ósemka przecięcia mostka wywołuje minimalne uszkodzenie komórek
BISEKCJA BLASTOCYSTY EKSPANDUJCEJ
Nacięcie w tym stadium daje gorsze wyniki
Osłonka jest przecieniona
Rosnąca blastocysta rozpycha, cięcie otwór robi się za szeroki
KLONOWANIE PRZEZ PRZESZCZEPY JDROWE
Izolacja jąder dawcy
Enukleacja oocysty biorcy
Przeszczepienie jądra do oocytu biorcy
Aktywacja oocytu
Wielokrotne klonowanie zarodków ssaków metodą seryjnej transplantacji jąder komórkowych 8
blastomerowych zarodków
PRODUKCJA IDENTYCZNYCH ZWIERZT DROG TRANSPLANTACJI JDER
A. technika produkowania identycznych zwierząt z blastomerów 32 komórkowych zarodków
Klonowanie doskonalono w celu praktycznego zastosowania na szeroką skalę w hodowli bydła
Technika ta nie została jednak dostosowana do praktycznej aplikacji z powodu:
1. niski poziom cielności, chociaż przebieg rozwoju rekonstruowanych z jąder zarodków był
udoskonalony
2. wysoki poziom wczesnej zamieral. rekonstruowanych zarodków raz poronień w póznej ciąży
3. wiele przypadków przedłuża okres ciąży i duże rozmiary cieląt pochodzących z transferu
zarodków rekonstruowanych z jąder
Przyczyny tych problemów nie są jeszcze w pełni wyjaśnione
KLONOWANIE KOMÓREK SOMATYCZNYCH Ian Wilmut [1997] dokonał epokowego osiągnięcia uzyskał
jagnię pochodzące z zarodka zrekonstruowanego z użyciem komórek wymienia 6 letniej owcy
Hipoteza zakładała, że:
... wyłączenie komórki dawcy jądra z określonej fazy wzrostowej cyklu komórkowego wywołuje
zmiany z chromatynie jądra ułatwiające przeprogramowanie ekspresji genów i wejście w fazę
spoczynkową G0 przed dokonaniem transferu jądra
PRZYGOTOWANIE KOMÓREK
Rozdzielone komórki wymienia były hodowane przez 3-6 generacji przy zmianie medium co tydzień
1 generacja = 1 pasaż = 1tydzień
Komórki te nie miały jednak totipotencji!!!
22
PROCEDURA UMOŻLIWIAJCA UZYSKANIE TOTIPOTENCJI
Kom. dawcy jąder były przygotow. przez redukcję koncent. skł. odżyw. w medium hodowlanym
Stężenie surowicy obniżono w ciągu 5 dni z 10% do 0,5%
głodzenie powodowało wyjście z cyklu wzrostu i zatrzym. ich w fazie G0 Campbell i wsp. 1993
FUZJA KOMÓREK DAWCY JDRA Z ENUKLEOWANYM OOCYTEM
W polu elektrycznym
Produkcja klonów przez transfer jąder komórek nabłonka wydzielniczego wymienia lub komórek
embrionalnych
KLONOWANIE CHIMEROWE
Usunięcie osłonki przejrzystej dezagregacja blastomery nośnikowe agregacja
MIDZYGATUNKOWA CHIMERA
Kozo-owca wyhodowana w IGHZ PAN Jastrzębiec Członkowska i wsp. [1988]
PERSPEKTYWY
Obecnie klonowanie jest nieudolną procedurą
Koszty są bardzo wysokie
Rzadko przeprowadzane
Jednak w niezbyt odległej przeszłości to samo można było powiedzieć o SU i ET
KOSZTY 2006
Koszt klonu (pierwsze zwierzę) 19 000$
W ubiegłym roku 25 000$
Każde dodatkowe zwierze 5 000$
Warto zauważyć w ciągu 1 roku nastąpiła znaczna obniżka kosztów
PRZEWIDYWANIA
Podobnie jak SU i ET z czasem klonowanie będzie się coraz lepiej udawało i koszty znacznie się
obniżą będzie coraz powszechniej stosowane,
Obecnie jest stos. jedynie do elitarnych krów lub buh. starych, wyeksploatow. i to wyjątkowo,
Wybiegając myślą w przyszłość można sobie wyobrazić, możliwość zatelefonowania do
genetycznej firmy z zamówienia 50 kopii samic/samców jednego wyjątkowego zwierzęcia
zamrożonych w słomkach tak jak to się obecnie robi z nasieniem
Pytanie tylko jak szybko będzie to możliwe???
W-10 TRANSFER ZARODKÓW
HISTORIA ET
1891 pierwszy udany zabieg Australia
1946 Polska pierwsze jagnięta
1951 pierwsze cielę Wisconsin
1976 frosty cabmridge
1976 bezkrwawe zabiegi ET
1978 Polska Pierwsze cielęta IGHZ PAN
1979 Chimera owco-koza IGHZ PAN
1980 Polski MOET Gajewo
GAÓWNE ETAPY ET
Synchronizacja cykli dawczyń i biorczyń zarodków,
Wywołanie superowulacji u dawczyń zarodków,
Zapłodnienie (SU) dawczyń,
Pozyskanie zarodków,
23
Ocena jakości ,
Dezynfekcja zarodków,
Kriokonserwacja,
ET świeżych zarodków do macicy biorczyń,
Diagnoza ciąży (USG)
Etap I przygotowanie
Synchronizacja cykli dawczyń i biorczyń
Konieczna jedynie przy ET zarodków świeżych
Najlepsze wyniki przy pełnej synchronizacji
Wykorzystanie mrożonych zarodków wyklucza ten etap
Etap II superowulacja
2 programy:
PMSG 1 iniekcja
Przysadkowe FSH iniekcje przez 5 dni 2 x dziennie
Etap III zapłodnienie dawczyni
5 dnia po iniekcji superowulacji przeprowadza się sztuczną inseminacje dawczyń
Etap IV płukanie zarodków
Nie chirurgiczne pozyskanie zarodków z macicy dawczyni przy użyciu trójdrożnego kateteru
Etap V ocena jakości
Do ET wybiera się na podstawie oceny morfologicznej bardzo dobre i dobre zarodki
Etap VI kontrola zakażeń
Etap VII dezynfekcja
Patogeny nie przechodzące przez osłonkę przejrzystą
U bydła:
Wirus białaczki bydlęcej BLV
Wirus choroby niebieskiego języka BTV
Wirus bydlęcej biegunki zakaznej BVDV
Wirus otrętu IBRV
Wirus pryszczycy i pałeczka brucelozy
U owiec:
Wirus BVDV
Wirus BTV
Campylobacter
Płukanie: przemywa. zarodków w 10 naczynk. Petriego sterylnym PBS z 2% surowicą (sterylne pipety)
Wirusy wymagają trawienie trypsyną:
5 narzynek roztwór PBS +0,4 % BSA
2 narzynka 0,25% roztwór trypsyny (w PBS)
4 naczynek PBS + 2% surowicy wypłukanie trypsyny
Etap VIII kriokonserwacja
Przechowywanie długotrwałe zarodków w ciekłym azocie
W 37C lub pokojowej przez 1 dzień
Etap IX transfer zarodka
Wprowadzenie zarodka do dróg rodnych biorczyni chirurgicznie lub nie chirurgicznie
Etap X diagnoza ciąży
Badania metodą palpacji per rectum 1-3 mies po ET
Badanie USG 15-21 dni
TECHNIKI POZYSKIWANIA ZARODKÓW
Z izolowanych narządów rodnych płukanie jajowodu i rogów macicy (wszystkie gatunki)
Chirurgiczne metody laparotomia
1. Płukanie od górnej części rogu jajowód w kierunku lejka 20 ml medium
2. Płukanie od lejka do górnej części rogu
3. Płukanie macicy od podstawy w kierunku jajowodu lub odwrotnie (wszystkie gatunki)
24
Niechirurgiczne metody:
Katetery (bydło, konie) 500ml medium
WYNIKI PAUKANIA ZARODKÓW
Nie przewidzialne co do ilości i jakości
Z jednego płukania można uzyskać od zera do kilkudziesięciu
Średnio 5-12
Rekord w USA 53 zarodki z jednego płukania
IVF CEL: ZBADANIE PROCESÓW KAPACYTACJI
PROCEDURA (1):
wyjściowym warunkiem do przeprowadzania IVF jest pozyskanie żeńskich i męskich gamet
plemniki mogą pochodzić z ejakulatu, najądrzy lub jąder (spermatydy)
oocyty mogą być pobier. z mater. rzeznianego lub przez punkcje jajnik. po MO, pod kontr. USG
SELEKCJA OOCYTÓW
Pozyskane oocyty poddaje się ocenie:
dojrzałości do zapłodnienia
pod wzgl. przydatności do dojrzew. in vitro
Uważa się, że powinny być otoczone podwójną warstwą komórek ziarnistych
ROLA WIECCA PROMIENISTEGO
mikro wypustki kom. ziarnist. wnikają przez osł. przejrzystą i stykają się z wypustkami oocytu.
umożliwia to transport potrzebnych produktów w obydwie strony
PROCEDURA (2)
dojrzałe oocyty zawierające wrzeciono podział. i Pb1 mogą być poddane zapłodnieniu od razu
oocyty pochodz. z małych pęcherz. muszą przejść proces dojrzewania
PROCEDURA (3)
kapacytacja plemników in vitro
inkubacja oocytów i w pożywce zawierającej 500 tyś. 1 mln. plemn. w 1 ml
czas inkubacji kilka do kilkutastu godz.
temp. 390C
PRZYGOTOWANIE PLEMNIKÓW
plemniki osiągają gotowość do penetracji komórek wzgórka jajonośnego i osł. przejrzystej
w proc. kapacytacji
polega on na enzymat. usunięciu z powierzchni plem. powłoczki stabilizującej utworzonej
z cholesterolu, glikoprotein i białek.
KAPACYTACJA W WARUNKACH POZAUSTOROJOWYCH IVF
długotrwała inkubacja (18-24 h)
kapacytacja w obecności kofeiny :)
inkubacja w płynie pęcherzykowym
inkubacja w podwyższonym, nie fizjologicznym pH
inkub. w płynie HIS
inkub. w heparynie
i inne
EFEKT KAPACYTACJI
Zwiększenie przepuszczalności błony cytoplazmat. plemn. dla Ca++
Proces ten jest odwracalny DF występuje w płynie najądrza
25
SKUTECZNOŚĆ KAPACYTACJI
Kapacytacja przy użyciu heparyny pozwala osiągnąć 70% zapłodnień
TECHNIKA SWEEM-UP CZYLI PODPAYWANIA
rozdział plemników techniką podpływania plem. ruchliwe podpływają w górne partie pożywki
i te frakcje używa się do zapłodnienia,
albo wirowanie plemn. w gradiencie Percollu. Ruchliwe plem. zbierają się w warstwie
o największym stężeniu tego związku
KONCENTRACJA PLEMNIKÓW
koncentr. plemn. stos. w IVF jest wyższa niż w miejscu fizjologicznego zapłodn.
mieści się w granicach od 1x105 do 1-5 x 106 plemników na ml pożywki
UNASIENIANIE
inkubację oocytów w pożywce zawierającej plemniki przeprowadza się w wiszących kroplach
pożywka TCM-199
czas inkub. 6-12h
im dłużej tym większa polispermia
OCENA WYNIKÓW ZAPAODNIENIA
segreguje się oocyty nie zapłodn. i zapłodn.
zapłodn. mają: => widoczne PbII,
=> zaznaczoną przestrzeń okołożółtkową
POLISPERMIA PRZY IVF
PRAWIDAOWO ZAPAODN. POLISPERMICZNE
OOCYTY
N
OOCYTY N/% OOCYTY N/%
DOJRZEWAJCE
IN VIVO 29 19/83 14/61
IN VITRO
118 27/54 45/90
ANOMALIE W PROCESIE IVF
polispermia
asynchroniczny rozwój przedjądrzy
mitotyczne podziały zarodka bez równoczesnego podziału cytoplazmy
fragmentacja cytoplazmy bez równoczesnego podziału jądra
rozwój części blastomerów zahamowanie rozwoju pozostałych
foto => stadium przedjądrzy, większe męskie
Cumulus oocyt kompleks foto prawidłowych, nieprawidłowych, etc
DOJRZAAY OOCYT do zapłodnienia otoczony zwartym, złożonym z kilku warstw komórek
ziarnistych wieńcem promienistym cumulus oophorus
STADIUM PRZEDJDRZY
zapłodniony oocyt bydlęcy w stadium przedjądrzy, utrwalony po 20h po IVF, zaznaczone Pb
ZYGOTA PO IVF, zarodek bydlęcy
ZARODEK BYDLCY, stadium 2 blastomerów
(... zdjęcia z kolejnymi fazami)
IVF WSPOMAGANE MIKROMANIPULACJ GAMET
Testowano metody zapłod. IV wykorzystując płazy, gryzonie i duże zw. lata 1962 -87
wykorzystując plemniki:
sortowane wg płci 1993
martwe 1991
martwe dzikich zw - 1994
26
METODY ZAPAODNIENIA WSPOMAGANEGO MIKROCHIRURGICZNIE
PZD Partial Zona Dissection - częściowe rozcięcie osł. przejrzystej
ZD Zona Drilling wytrawiene otworu kwaśnym płynem Tyrolda
SUZI Sub Zona Injection wprowadzenie plemników do przestrzeni około żółtkowej
ICSI Intra Cytoplasmatic Sperm Injection iniekcja plemnika bądz samej główki do cytozolu
ICSI
Plemnik musi być wciągnięty do pipety od strony witki
Zabieg wciągnięcia do pipety jest trudny techn.
ICSI Intra Cellular Sperm Injection
Schem. mikroiniekcji plemnika do wnętrza oocytu
Wykorzystanie ICSI
pierwsze cielę po ICSI Newcomb i wsp. [1978]
w latach 90-ych IVF wprowadzono na skalę praktyczną: w UK, Irlandii, Danii, Holandii, Francji,
USA, Kanadzie i Japonii.
ZNACZENIE IVF-ICSI
zwiększa potencjał rozrodczy samców
umożl. uzysk. potomstwa osobników z problemami płodności => samców z azospermią
=> zw. padłych
umożl. uzysk. zw. transgenicznych
poprawia możliwość hodowli zachowawczej
PRODUKCJA ZARODKÓW IN VITRO IVP
ETAPY IVP
OPU ovum pick up izolacja oocytów
IVM in vitro maturation dojrzewanie in vitro
IVF in vitro fertilization zapłodnienie in vitro
IVC in vitro culture hodowla in vitro
ET embryo transfer transfer zarodków
CEL IVP: Efektywne wykorzystywanie zasobów komórek rozrodczych u samic
POTENCJAA ROZRODCZY SAMIC
Jajnik w życiu płodowym zawiera miliony pęcherzyków pierwotnych w chwili narodzin liczba ta jest
zredukowana kilkakrotnie
U bydła przy urodzeniu może wynosić >700 tys z tego 0,05% osiąga stadium przed owulacyjne
POZYSKIWANIE OOCYTÓW
yRÓDAA:
Izolowane narządy z materiału rzeznego
Jajniki dojrzałych krów/również w ciąży
Jajniki jałówek i cieląt
POBIERANIE OOCYTÓW Z MATERIAAU RZEyNEGO
Izolowane jajniki przewozi się w termosie zawierającym medium stosowane do hodowli
i dojrzewania oocytów, np: TCM 199
Dotyczy to materiału o nieznanym pochodzeniu, komórki jajowe mogą być zapłodnione
nasieniem buhajów mięsnych/knurów
Jajnik krowy z pęcherzykami widocznymi na monitorze USG
Punkcja pęcherzyka pod kontrolą USG
Urządzenie do aspiracji oocytów
27
OPU
Polega na przyżyciowej izolacji oocytów przez punkcję pęcherzyków jajnikowych od dawczyni
Punkcje przeprowadza się pod kontrolą USG
Operator manipulacje jajnikiem przez prostnice umożliwiając dostęp do pęcherzyków z różnych
stron i ustawienie ich na osi biegu igły
SELEKCJA OOCYTÓW
Pozyskane oocyty ocenia się pod względem dojrzałości
Niedojrzałe oocyty selekcjononuje się pod względem przydatności do dojrzewania
Warunek zwarty kilku warstwowy wieniec promienisty
CUMULUS OOCYT KOMPLEKS POZYSKANY Z JAJNIKA BYDAA
Oocyty niedojrzały do zapłodnienia
Prawidłowy obraz wieńca promienistego oocyt ma szanse na osiągnięcie dojrzałości
DOJRZEWANIE OOCYTÓW IVM
O prawidłowości dojrzewania oocytów w warunkach poza - ustrojowych obok prawidłowego cumulus
oophorus, decydują proporcje miedzy:
Liczbą komórek ziarnistych
Objętością pożywki
I liczbą oocytów
CZAS DOJRZEWANIA OOCYTÓW
Oocyty owcze i bydlęce 24 godz.
Kozie 27 godz.
Świńskie 44 46 godz.
Klaczy 30 36 godz.
ZAPAODNIENIE IN VITRO OOCYTÓW IVF
IVF Metoda sweem up tzw. podpływania wg Brackett a
Selekcja zarodków i nie zapłodnionych oocytów
HODOWLA IN VITRO IVC
HISTORIA
1880 pierwsze obserwacje zarodków poza organizmem matki [Schenk I Onanoff]
1929 zarejestrowano na taśmie filmowej rozwój zarodka do 8 blastomerów [Castel i Gregory]
1949 rozwój zarodka zależny od stadium rozwojowego [Hammond Jr.]
1957 usunięcie glikozy i fosforanów z pożywek pozwala przełamać blok rozwojowy zarodka
[ Biggers i wsp.]
CHARAKTERYSTYCZNE CECHY BRUZDKOWANIA
Zarodek nie rośnie, nie zwiększa swej masy ani objętości ograniczenie osłonka przejrzysta,
Zarodek nie zmienia swojego zasadniczego kształtu,
Nie zmienia się istotnie skład chemiczny zarodka i jego metabolizm,
Składniki komórkowe nie przemieszczają się zostają natomiast rozgraniczone błoną komórkową,
Stosunek cytoplazmatyczno jądrowy bardzo niski, niekorzystny dla jądra, zbliża się w miarę
bruzdkowania do stosunek właściwego dla komórek somatycznych
PORÓWNANIE WARUNKÓW ŚRODOWISKOWYCH ZARODKA IN VIVO VS. IN VITRO
IN VIVO IN VITRO
Stałą temperatura Zmiany okresowo temp. otoczenia
Całkowita ciemność Okresowo światło mikroskopu, otoczenie
O2 i CO2 kontrolowane dyfuzją, Ekspozycja na gazy atmosferyczne,
produkcją matczyną stężenie mało kontrolowane
Niewiele płynu otaczającego Stosunkowo dużo płynu otaczającego
Stała dynamiczna wymiana substratów Okresowa wymiana medium, malejąca
i metabolitów płód - matka koncentracja substratów/metabolitów, zmiany pH
28
HODOWLA ZARODKÓW IN VITRO W WISZCYCH KROPLACH
Płytka Petriego krople pożywki pod warstwą mineralnego oleju
Wspomagające komórki Vero, BRL lub komórki ziarniste we współhodowli
10 20 zarodków w jednej kropli
Płyn do hodowli Dulbeco, TCM 1999 + 20% interaktywowanej surowicy płodowej
BLOK ROZWOJOWY IN VITRO
Gatunek Stadium bloku Przełamanie bloku
Mysz 2 komórki Glukoza, pirogronian, mleczan w pożywce
Szczur Morula Pożywka HECM -
Krowa 8 do 16 komórek Współhodowla z komórkami jajowodu
Świnia 4 komódki Brak pirogronanu w pożywce
WSPÓAHODOWLA - CO CULTURE Z KOMÓRKAMI SOMATYCZNYMI
K. wzgórka
K. endometrium
K. nabłonkowe jajowodu BOE
K. wątroby szczura Buffalo BRL
K. nerki małpy zielonej VERO
ZNACZENIE KOMÓREK WSPOMAGAJCYCH
Wspomaganie rozwoju zarodków dostarczanie czynników wzrostowych
Działanie zmniejszające cytotoksyczność tlenu
Pozyskiwanie komórek wspierających do współhodowli z materiału rzeznego
Pozyskiwanie komórek jajowodowych (płukanie jajowodu)
WARUNKI HODOWLI
Płytki Petriego z hodowlą oocytów
Trzymane w inkubatorze
W temp. 39C
W mieszaninie powietrza 5%CO2, 90% Azotu, 5% tlenu
Wilgotność 65%
pH 7,2 7,4
JAKOŚĆ WODY
Ma znaczenie kluczowe
Woda musi być dejonizowana na wysokiej czystości z ultrafiltracji system Mili Q
Nie uzyskano rozwoju zarodków w wodzie dejonizowanej
Zarodki muszą osiągnąć stadium póznej moruli lub blastocysty
OCENA JAKOŚCI I SELEKCJA ZARODKÓW
Zarodki morfologicznie prawidłowe
W stadium blastocysty lub moruli
Można wprowadzić do macicy biorczyń lub poddać kriokonserwacji
Do kriokonserwacji tylko dobrej jakości
Pozostałe transfer do biorczyń
ZNACZNIE IVP
OPU-IVP jest techniką zwiększającą wielokrotnie efektywność wykorzystania zasobów
komórek rozrodczych samicy
W porównaniu z programem MOET zwiększa znacząco współczynnik reprodukcji samicy
Zmniejsza odstęp między pokoleniowy i przyspiesza postęp w hodowli bydła
29
Biotechnologie wykorzystujące OPU-IVP
Największe znacznie technika ta ma w odniesieniu do:
Wytworzenia zwierząt transgenicznych
Klonowania osobników transgenicznych
Ochrony zasobów genetycznych
Wykorzystanie IVP w praktyce
Produkcja towarowa zwierząt
Uzyskanie potomstwa od samic z problemami płodności
Możliwość regulacji płci potomstwa w stadzie
Bank zasobów genetycznych kriokonserwacja oocytów I zarodków
Najwyższa efektywność wykorzystania gamet przy zastosowaniu ICSI
PODSTAWA ROZDZIAAU PLEMNIKÓW
Różnica zawartości DNA w plemnikach niosących chromosomy X i Y
U większości ssaków zawartość DNA w plemnikach żeńskich jest około 4% wyższa niż w męskich
Gatunkowe różnice w zawartości DNA w plemnikach niosących chromosomy X i Y
Buhaj 3,9%
Knur 7,7%
Tryk 4,2%
Szynszyla 8,0%
Człowiek nie ma różnicy
METODY ROZDZIAAU I.
Rozdział przeprowadza się przez wirowanie w gradiencie Perkoll u
na podstawie różnic w masie i ruchliwości plemników. Plemniki X jako cięższe podczas
wirowania szybciej sedymentują i osadzają się w cięższych warstwach Perkoll u
Dokładność do 94%
Odzysk plemników niski 17 do 30%
Metoda elektroforezy wolnoprzepływowej
Opiera się na podstawie różnic w ładunkach elektrycznych na powierzchni błon komórkowych
Plemniki X mają wyższy ład. ujemny i poruszają się szybciej w kier.u anody niż plemniki Y
Dokładność rozdziału 80-89%
Ruchliwość plemników jest jednak zmniejszona
Rozdział na podstawie antygenu H-Y
Ekspresja antygenu zgodności tk. samic i samców uwarunk. jest obecnością chromosomu Y
Immunizacja samic na antygen H-Y
Powoduje jednak niewielkie odchylenie stosunku płci potomstwa
Na podstawie różnicy w zawartości DNA
Analiza i sortowanie plemników w cytometrze przepływowym przeprowadzana jest na nasieniu
barwionym związkami fluorescencyjnymi swoistymi dla DNA:
Bromek etydyny, Jodek propydyny, Fluorochrom Hoeschst a 33342
ZASTRZEŻENIA:
Szkodliwość barwników, promieniowania laserowego oraz promieniowania UV dla:
Zdolności do zapładniania in vitro
Ruchliwość plemników
Żywotność plemników (knura)
Możliwość uszkodzenia genomu, aberracji chromosomowych (brak danych)
/schem./ Barwione plemniki przepuszczane są pojedynczo kapilarą
Laser wyzwala fluorescencje
Plemniki znakowane są ładunkiem -/+
Płytki o wysokim napięciu rozdzielają plemniki
Ograniczenia:
Stosunkowo niewielka wydajność sortowania ok. 107 komórek na godz.
Bardzo wysoki koszt aparatury
Koszt porcji nasienia sortowanego jest dwukrotnie wyższy od nie sortowanego
30
WYNIKI UNASIENIANIA KRÓLIKÓW SORTOWANYM NASIENIEM
Nasienie SI samice % (n) Samców % (n) Samic
Sortowanie Y 21 81 (17) 19(4)
Sortowanie X 16 6(1) 94(15)
WYNIKI ROZDZIAAU PLEMNIKÓW METOD CYTOMETRII PRZEPAYWOWEJ
Autorzy Gatunek Dokładność rozdziału X Dokładność rozdziału Y
Johnson i wsp. 1989 Królik 86% 81%
Johnoson 1991 Świnia 74% 68%
KORZYŚCI
Możliwość uzyskania potomstwa pożądanej płci
ZASTOSOWANIE
Najbardziej efektywne wykorzystanie sortowanych plemników zapewnia:
Zapłodnienie metodami wspomaganymi mikrochirurgicznie
Zwłaszcza metodą ICSI tj. Wprowadzenie pojedynczego plemnika do cytoplazmy oocytu
Praktyczne możliwości zastosowania w kraju sortowanego nasienia
W Polsce sortowaniem plem. metodą cytometrii przepływowej zajmuje się Instytut Zootechniki
Cena 1 porcji nasienia sort. ulega podwojeniu w stos. do nie sort. i wynosi średnio ok 200zł
W-13 TRANSGENEZA
Historia, met. wytwarzania zw. GM, wektory, aplikacje, aktualny status, kom. macierzyste.
ZWIERZ TRANSGENICZNE to takie któremu za pomocą 1 z technik wprowadzono
do genomu obcy gen tj. fragment DNA kodujący określone info genet.
HISTORIA
1950 pierwsze trasg. zw. uzysk. drogą mikroiniekcji transgenu do przedjądrza
1985 pierwsz TGS zw. gosp.
1987 ekspresja biofarmaceutyków w gr. mlecznym
1988 pierwsza owca bioreaktor
PIERWSZE PRÓBY
prowadzono na myszach
ZALETY:
asezonowy rozród,
wysoki wsp. reprodukcji,
duża liczba owulujących pęcherzyków,
db widoczne przedjądrza,
duża pojemność macicy,
krótki okres ciąży.
Wykorzystując promotor metalotioneiny wprowadzono do genomu myszy gen hGH
rys. Construction of a transgenic mouse
Palmiter, 1982 wytworzył super mysz
Konstrukcja genowa zawierała:
gen rGH szczurzego hormonu wzrostu
połączony z promotorem mysiej melatotioneiny mMT
31
NEGATYWNE SKUTKI
u zw trasgenicznych możliwość wystąpienia problemów zdrowotnych:
bezpłodność
artretyzm
wrzody żołądka
cukrzyca
podatność na infekcje
defekty stawów
Obecne zw. transgeniczne:
myszy, owce, bydło, świnie, króliki, ryby, szczury
Wizualuzacja przedjądrzy
rys.: wizualizacja przedjądzy => schemat mikroiniekcji DNA do przedjąd. męskiego zygoty
WYNIKI POWIKRZANIA TEMPA WZROSTU:
myszy tsg rosły 2x szybciej niż kontrolne
obcy gen przekazywały potomstwu samce
samice myszy niosące transgen rGH mMT są bezpłodne
PRÓBY ZWIKSZANIA PRODUKCJI MISA Z WYKORZYSTANIEM hGH, bGH, oGH
przeprowadzano na królikach, świniach, owcach i in.
z różnym powodzeniem
u świń występow. problemy z chodzeniem
Uzyskiwanie transgenicznych myszy z użyciem zmodyfik. kom. węzła zarodkowego ESC
DNA => selekcja na ekspresję transgenu np GFP => iniekcja transformowanej ESC do węzła
blastocysty => ET do myszy
elektroporacja ESC
przez powstałe otwory do blastocysty wnika wektorniosący transgen
STOSOWANE WEKTORY
Do transferu genów wykorzystyw. nośniki t.jak:
liposomy
transfekowane plemniki
bakteriofagi
wektory syntetyczne
chromosomy drożdżowe
retrowirusy => zmodyfikowane dla zminimalizowania ryzyka zakażenia tak, że zdolne
tylko do jednego cyklu replikacyjnego
STOSOWANE WEKTORY WIRUSOWE
wirus mięsaka Rousa (RSV)
wirus martwicy śledziony (SNV)
wirus siatkowicy (REV)
wirus białaczki drobiu (ALV) => kompetentny replikacyjnie stos. tyko u przepiórek
japońskich
Próba wprowadzenia do genomu krowy ludzkiego genu kodującego prod. czynnika martwicy
nowotworów:
hTNFą tumor necrosis factor
konstrukcja genowa zawierała promotor genu beta-lactoglobuliny promotor specyf. dla
kom. grucz. mlekowego oraz gen reporterowy GFP, którego produktem jest białko
świecące na zielono w UV
32
WYNIKI MIKROINIEKCJI
grupa n zarod. N blastocyst
IVP 124 30
mikroiniekcja 49 GFP 100% pozytywne, 1 blastocysta
Bydlęca blastocysta 100% GFP-pozytywna
Po wprowadzeniu blastocysty do macicy biorczyni uzyskano buhajka Dyzio
APLIKACJE TRANSGENEZY
produkowanie modeli zwierzęcych dla chorób ludzi,
model cukrzycy,
model nowotworowy,
humanizacja myszy do badań nad AIDS,
mysz bez syst. immunolog.
DOSKONALENIE ZW. GOSP.
zwiększanie prod. mięsa, mleka, jakości produktów
humanizacja mleka koziego
mleko dla alergików
bez, lub z obniżoną ilością laktozy
zwiększenie odporności i zdrowotności
WYTWARZANIE BIOREAKTORÓW DO PRODUKCJI FARMACEUTYKÓW
Zw. produkujące w mleku białka plazmy ludzkiej, np Białko C, Czynnik VII, Czyn. IX
organy do ksenotransplantacji produkowane przez zw. pozbaw. syst. immunol.
np. prosiętsg uzysk. w IZ Kraków
terapia genowa ESC
wykorzystanie kom. macierzystych
KSENOTRANSPLANTACJE
Idealnym dawcą org. i tk. są świnie
organy i tk. podobna morfologia i wymiary do ludzkich
płodność wysoka, mioty do 12 prosiąt, wczesne dojrzewanie
krótka ciąża
możliwa hodowla na dużą skalę, minimalne ryzyko infekcji stada SPF
WYDAJNOŚĆ REKOMBINOWANEGO BIAAKA
gatunek Lat od iniekcji do laktacji wydajn. za lakt [L] wyd. białka [G] za lakt.
owca 1,5 300 600
koza 1,5 600 1,200
krowa 2,8 10,000 20,000
POACZENIE TRANSGENEZY Z KLONOWANIEM OCENA RYZYKA
wysoki stopień aborcji ok. 40 dnia ciąży
zwieksz. śmiert. okołoporodowa
częsty brak spontanicznych porodów
zatrzymanie łożyska
zaburzenai metabol. np kwasica
niewydolność ukł. krążenia, oddechowego
PROBLEMY W BADANIACH NAD TRANSGENEZ
wys. koszy uzysk. zw. TSG zwłaszcza u bydłą
mała wydajność trangenezy
niska płodn. długi odstęp między wycielen.
brak lub mała ekspresja białka w mleku
ekspresja nieprawidłowa w innych tkankach
33
Wykład 14; KRIOKONSERWACJA ZARODKÓW I OOCYTÓW
Metody:
" zamrażanie
" witryfikacja
Nadają się tylko zarodki najlepszej jakości, żadna z metod nie jest doskonała, konieczne jest
w nich zastosowanie środków osłaniających.
U małych przeżuwaczy zarodki do kriokonserwacji pozyskiwane met. chirurgiczną,
przy minimalnej inwazyjności, pod ogólną narkozą.
LAPAROTOMIA BOCZNA minimalne cięcie umożliw. dostanie się do jajowodu/macicy.
Przed mrożeniem => posiewanie krystalizacji
WYPOSAŻENIE PRACOWNI:
lodówki, dwa kontenery na ciekły N2, mikroskop i stereoskop, komora mikrobiologiczna z przepływem
sterylnego powietrza, mikropipety do przygotowania roztworu osłaniającego, naczynka do hodowli,
słomki i ampułki, kateter i pipety, aparat do zamrażania freezer
ŚRODKI OSAANIAJCE:
A> przenikające do zarodka:
glikol etylenowy (GE)
glicerol
etanol
1,2-propandiol
DMSO sulfotlenekdwumetylu
SUKCES I WYGODA WYKORZYSTANIA GE
przenika przez bł. komórkowe łatwiej niż glicerol,
umożliwia bezpośredni transfer zarodka do dróg rodnych bez potrzeby usuwania ze słomki,
elimin. czasochłonne manipulacje z przepłukiwaniem
B> nie przenikające do zarodka:
glikol polietylenowy
poliwinilo-porolidyn (-m)
sacharoza (najpowszechniej używane)
inne cukry
GLIKOPROTEINY KRIOOCHRONNE (=> z ryb arktycznych)
zapobiegają krystalizacji wody przy zamrażaniu
obniżają pkt zamarzania
rekrystalizacja przy rozmrażaniu
METODY KRIOKONSERWACJI:
I. zamrażanie zrównoważone (kontrolowane)
II. zamrażanie jednostopniowe niezrównoważone
III. witryfikacja => najszybsza metoda
ad1> byl schemat, przepisałem tylko tekst
1. izolacja zardka do medium
2. dodawanie CPA, pasaże
3. aspirowanie do słomki/ampułki zatopienie
4. umieszczenie w temp. 00C
5. chłodzenie szybkie 20 na minutę do -60C
6. posiewanie inicjacja krystalizacji wody w 10 min.
7. ponowne chłodzenie 0,30/min do -350C
34
8.
ekwilibracja i zatopienie w N2
9. ...
10. rozmrożenie
11. usunięcie CPA
12. dodanie sacharozy
13. uwodnienie
ad2> zamrażanie jednostopniowe niezrównoważone
modyfikacja poprzedniej metody pominięcie etapu usuwania śrdka osłaniającego, zasada =>
umieszczenie w 1 słomce zarodka ... (wakat, zbyt szybko mignął slajd...)
ad III> witryfikacja (najważniejsza met.)
nie wymaga specjalnej aparatury,
wytworzenie jednorodnego zeszklenia (bez kryszt. lodu)
wymaga to zastostowania ultraszybkiego oziębienia i zastosowania śrdków zwiękrzających
lepkość roztowru
optymalizacja metody:
1) zwiększenie szybkości schładzania przez ograniczenie zawartości minisłomek
2) optymalizacja składu płynu witryfikacyjnego => max. łatwość tworzenia szkliwa i min.
toksyczność dla zarodków
witryfikacja umożliwia mrożenie zarodków i oocytów świń (vs do poprzednich metod)
KRIOKONSERWACJI MOG PODLEGAĆ:
płytki wrzeciona podziałowego MPII
przedjądrza
jądro
zarodki
komórki macierzyste
PROBLEMY KRIOKONSERWACJI OOCYTÓW
Oocyt to największa kom. organizmu => pełna wody, a u wielu gat. zw. tłuszczu, co utrudnia zamraż.
ROZMRAŻANIE PRZY WITRYFIKACJI
musi być b.szybko, by umożliwić rozcieńcz. i wypłukanie SO, działającej toksycz. na zarodki i oocyty.
Aspiracja zarodka morula ---po---> 10 minutach <= ???
i osłon transfer blastocyst po 60 min.
do kropli medium płukanie
witryfikacja
POZIOM PRZEŻYWALNOŚCI
zarodek w stadium przedjądrzy wykazuje przeżywalność zbliżoną do uzyskanej przez świeże
zarodek w stadium blastocysty 5-6dni po zapłodnieniu (bdb jakości) mają średnio 50%
przeżywalności, o 50% mniej od świeżych
CZYNNIKI PRZEŻYWALNOŚCI ZARODKÓW
fizjologiczne i biofizyczne właściwości, stadium rozwojowe zarodków
odstęp czasu od pozyskania zarodka do rozpoczęcia zamrażannia
typ frizier i program zamrażania
osmotyczny szok w trakcie różnych etapów kriokonserwacji
ilość zarodków w każdej słomce i zawartość albumin...
(tu skończył się czas, koniec wykładu)
35
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Metodologia nauk przyrodniczych wyk ady
Dynamika grup w organizacji Wyk éady
filozofia wyk ady
Ekonometria wyk éady S Barczak
Potencja é innowacyjny MSP Wyk éady
ZPKB wyk ady AK
Mi dzynarodowe stosunki gospodarcze wyk ady
Wyk ad 02
Mat Bud wyk
wyk(Ia) wstęp PBiID
Stan cywilny, wyk struktura ludnosci wg 5 str
si ownie wyk?
więcej podobnych podstron