Mikrobiologia przemysłowa ćw 12
BIOSYNTEZA KWASU CYTRYNOWEGO
Charakterystyka kw. cytrynowego:
- trójkarboksylowy
- M = 192 g
- T topnienia = 150 st. C
- Wyizolowany po raz pierwszy z cytryn (zawierają 7  9 % kwasu cytrynowego)
- Produkowany w niewielkich ilościach przez wszystkie organizmy żywe (powstaje w
cyklu Krebsa = cyklu kwasu cytrynowego)
- Posiada walory organoleptyczne  dobry smak, ładny zapach
- 80% produkcji kw. cytrynowego zużywana w przemyśle spożywczym
- dobra rozpuszczalność w wodzie
- mała toksyczność (może być dodawany do produktów spożywczych w
nielimitowanych ilościach)
- produkcja głównie we Włoszech (z 40 kg cytryn  1 kg kwasu)
- jest to metabolit pierwotny!!!
Metody mikrobiologiczne  pierwszy raz zastosowane w Belgii, w latach 20 XX wieku
Metody chemiczne  są mało opłacalne finansowo. Zbyt złożony proces biosyntezy, mała
wydajność.
PRODUCENCI kw. cytrynowego (produkujący go w większej ilości niż zwyczajne
organizmy)
- pewne gatunki pleśni, głównie z rodzaju Aspergillus (jako substrat : cukier)
o Aspergillus niger
o Aspergillus wenti
o Penicillum luteum
o Trichoderma viridae
- Drożdże z rodzaju Candida
o Candida tropicalis
o Candida lipolytica  badana potem przez Yarrowa  który odkrył szczep
zdplny do procesu płciowego i nazwał go Yarrowia lipolytica (jako substartu
wymaga n  alkanów lub n-parafin)
- Bakterie z rodzaju Arthrobacter
Głównie wykorzystywany jest Asergillus niger. Dlaczego?
- powszechny w przyrodzie, występuje w glebie, wodzie, na owocach
- szczepy do produkcji łatwo pozyskać ze środowiska naturalnego
- kwas cytrynowy  jest zw. pierwotnych, produkowanym w niewielkich ilościach
Pobieranie i przygotowanie:
- izolacja
- ulepszanie szczepu : dwie możliwości : (mutageneza lub rekombinacja)
o aktywacja przez mutagenezę (metodami fizycznymi  UV, chemicznymi lub
kombinacja obu )
Mikrobiologia przemysłowa ćw 12
selekcja szczepu po działaniu czynnika mutagennego według
warunków, w jakich będziemy potem prowadzić hodowlę
mutanty głównie w poszczególnych enzymach z cyklu przemian,
otrzymamy szczep z zaburzonymi szlakami metabolicznymi
" 1. dehydrogenaza akonitynowa
" 2. dehydrogenaza izocytrynianowa
" 3. dehydrogenaza 2  ketoglutaranowa
o rekombinacja genetyczna (wykorzystanie cyklu paraseksualnego) na drodze
fuzjo protoplastów. Mogą być też fuzje między różnymi rodzinami (np. A.
Niger z Trichoderma). Fuzjant otrzyma :
od Aspergillus  duża wydajność procesu produkcji kwasu
od Trichoderma : nie jest czuły na obecność glukozy (normalne
działanie : produkcja kw. cytrynowego  powstają analogi glukozy 
hamują produkcje kw. cytrynowego)
CECHY DOBREGO SZCZEPU PRZEMYSA
OWEGO
- nie patogenny (ale Aspergillus jest /może być patogenny, powoduje tzw. aspergilozę 
ale przy zbyt częstym kontakcie przy jednocześnie obniżonej odporności organizmu)
- niskie koszty (w sensie składu podłoża)  łatwo pozyskiwalne i łatwo dostępne
surowce
- wysoka wydajność procesu syntezy przy niezbyt obfitym wytwarzaniu grzybni
- duża stabilność genetyczna szczepu
o odpowiednie przechowywanie (stosowania liofilizacja)
o przechowywanie konidiów w jałowych pojemn. z cytrynianem wapnia
o otrzymywanie konidiów w odpowiedni sposób (pożywki sporulacyjne)
- nie wytwarzać / wytwarzanie w niewielkich ilościach inne kwasy organiczne (np.
szczawiooctan  obniżają one wydajność produkcji)
BIOSYNTEZA
Działają dwa szlaki 
- EMP (glikoliza) (głównie gdy grzybnia jest w fazie stacjonarnej)
- Lub / i pentozofosforanowy (dominuje przy intensywnym rozwoju grzybni)
Szybkość biotransformacji reguluje fosfofruktokinaza (jednocześnie reguluje glikolizę i
biotransformację kwasu cytrynowego), hamowana jest przez cytrynian i ATP (więc jest
korzystne ich  obejście w mutagenezie) czyli poprzez skład podłoża (parametr) możemy
manipulować aby zahamować / wzmocnić działalność enzymów.
Hodowla na odpowiedniej pożywce wyłączającej dehydrogenazy :
- dla dh. Akonitowej : deficyt jonów manganu i żelaza
- dla dh. Izocytrynianowej : wysokie stężenie cytrynianu
- dla dh. 2  ketoglutaranowej : wysokie stężenie cukrów i jonów amonu
Cykl glioksolowy  reakcje pomocnicze, wzmacniające (prowadzi do powstania m.in.
szczawiooctanu  metabolit bezpośredni cytrynianu)
Mikrobiologia przemysłowa ćw 12
METODY PRODUKCJI
1. powierzchowna LSF (liquid surface fermentation)
Stosowane płytkie tace jako kadzie (taca o odpowiednio napowietrzonej, jałowej
komorze), inokulum to konidia, wzrost 2-3 dni, potem synteza w odp. Warstwie grzybni
stykajacej się z pożywką. Fermentacja trwa 8  9 dni, Aspergillus rośnie jako zwarta grupa
komórek, w postaci kożucha (na powierzchni zarodnikuje  czarne konidia).
Wady : duze prawdopodobieństwo zanieczyszczenia hodowli (mimo jałowosci powietrza
np. zakażenie gatunkiem Penicilium  które hydrolizują grzybnię, możliwa obecność
bakterii Bacillus, E. Coli w melasie )
2. wgłębna SmF (submerged fermentation)
Efektywniejsza. Stosowane duże fermentory wypełnione pożywką. Grzybnia jest rozbita 
występuje w postaci grudek / strzępek (dzięki ciągłemu mieszaniu przez turbiny, lub
systemowi napowietrzania air lift), tak, że są zawieszone w obrębie pożywki. Bioreaktory
są zautomatyzowane, jako substrat stosowana Sacharoza. Aspergillus rośnie w całej
pożywce równomiernie.
Problemem jest dość trudne oddzielenie kwasu cytrynowego od biomasy.
Spływ pofermentacyjny : najpierw oddzieleni grzybni (w małych ilościach  np. u nas na
ćwiczeniach przesączenie) proces wieloetapowego strącania (dodanie Ca(OH)2 
otrzymujemy strącony cytrynian wapnia. Dodajemy to do kwasu siarkowego
(przeprowadza kwas cytrynowy z osadu do roztworu), przeprowadzamy filtrację ). Przy
okazji powstaje nam gips  CaSO4, ale niestety nie jest na tyle czysty, by mógł być użyty
 wymaga oczyszczenia.
Mikrobiologia przemysłowa ćw 12
3. na stałych pożywkach SSF (solid state fermentation)
w ten sposób produkuje się 20 % kwasu cytrynowego w Japonii (500 ton). Ekologiczna 
jako substrat stosowane odpady głównie z przemysłu spożywczego, cukrowni (np.
otręby). Wymaga 70 % wilgotności, proces fermentacji trwa 90 h, niska wydajność, kwas
oddziela się od podłoża przez ekstrakcję z ciepłą wodą.
PROWADZENIE HODOWLI
- z
ródło węgla i energii to cukry (stężenie 10  22 % w zależności od szczepu
Aspergillusa i wybranej metody)
o przy metodzie powierzchniowej  melasa buraczana (produkt odpadowy,).
Wady : melasa może być zanieczyszczona bakteriami które mogą hamować
proces stymulując enzymy (co w met. Powierzchownej nie przeszkadza)
o Metoda wgłębna  sacharoza ( melasa hamuje wydajność)
- kwasowość pożywki (2, 3 pH), powyżej 3 wydajność spada, produkowane są inne
kwasy
- eliminacja jonów metali, głównie Fe, Zn, Mn (np. dodając żelazocjanek potasowy
stymulujemy syntezę kwasu cytrynowego i wzrost grzybni)
- niskie stężenie soli fosforanowych i amonowych
- intensywne napowietrzanie podłoża
ZASTOSOWANIE KWASU CYTRYNOWEGO
- przemysł spożywczy (jako E330)
o regulator kwasowości (produkcja cukierków, różnych słodyczy, owoców
kandyzowanych, napojów)
o antyutleniacz (inaktywator oksydaz  hamuje utlenianie kwasów
tłuszczowych, zapobiega psuciu się żywności)
o dżemy, marmolady, galaretki, miód sztuczny
o stabilizacja barwy, smaku i zapachu produktów przechowywanych w chłodni
(ryby, owoce morza, warzywa)
o wino
- przemysł farmaceutyczny
o w preparatach krwi, aby zapobiec krzepnięciu, wytwarza cytrynian trójsodowy
i trójpotasowy
o zapewnia musujący charakter tabletek
- przemysł kosmetyczny
- wyrób błon fotograficznych, papierów światłoczułych
- chemia gospodarcza (dodawany do proszków do prania aby ograniczyć ilość
fosforanów,), łatwo degraduje
- oczyszczanie kadzi mlekowych (w których powstaje kamień mleczanu  oczyszcza z
niego)
- środki czyszczące przewody z rdzy
- estry kwasu cytrynowego stosowane jako plastyfikatory w masach plastycznych
- folie do pokrywania żywności