MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne
Ćwiczenie 4 część teoretyczna
___________________________________________________________________________
ĆWICZENIE 4: NADPRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO
W KULTURACH ASPERGILLUS NIGER
Wstęp  kwas cytrynowy
Kwas cytrynowy (2-hydroksy-1,2,3-propanotrikarboksylowy) o Mcz = 192
i temperaturze topnienia 153�C po raz pierwszy został wyizolowany z soku cytryn. W postaci
krystalicznej kwas ten występuje w postaci bezwodnej lub jednowodnej. Jednowodna forma
jest otrzymywana przez krystalizację w temperaturze poniżej 36,6�C, powyżej tej temperatury
powstaje forma bezwodna.
Kwas cytrynowy występuje w przyrodzie w owocach cytrusowych i ananasach.
Owoce te do niedawna były głównym z
ródłem tego kwasu. Światowa produkcja kwasu
cytrynowego przekracza 300 00 ton rocznie, co jest podyktowane bardzo dużym
zapotrzebowaniem na ten kwas ze strony przemysłu spożywczego, farmaceutycznego,
chemicznego oraz metalurgicznego. Jego wykorzystanie wynika m.in. z działania
konserwującego na skutek obniżania wartości pH środowiska. Jednocześnie jest związkiem
nietoksycznym, o dobrych walorach smakowych i zapachowych.
Zastosowanie kwasu cytrynowego i jego pochodnych
" W produkcji i przetwórstwie żywności jest stosowany (za zgodą FAO/WHO) jako
inhibitor enzymów, głównie oksydaz powodujących utlenianie polifenoli, co objawia
się ciemnieniem owoców i warzyw.
" Wykorzystywany jest do produkcji napojów, słodyczy, owoców kandyzowanych i
win, jako środek zakwaszający i stabilizujący.
" Tworzenie połączeń kompleksowych z jonami metali (Fe, Cu, Zn) zadecydowało o
zastosowaniu jako stabilizatora olejów. Wiążąc metale katalizujące proces jełczenia
tłuszczów, kwas cytrynowy przerywa reakcję tworzenia nadtlenków i innych
produktów powstałych w wyniku utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych w
procesie autooksydacji olejów.
" Zdolność do wiązania metali ciężkich umożliwiła wykorzystanie kwasu cytrynowego
do oczyszczania powierzchni metali przed spawaniem lub pokrywaniem powłokami
ochronnymi.
" W mleczarstwie wodne roztwory kwasu cytrynowego są stosowane do usuwania z
aparatury kamienia mlecznego (osad z białka, tłuszczu i soli mineralnych mleka).
" W przemyśle farmaceutycznym stosowany jest jako środek dodawany do tabletek
powodujący efekt musujący.
" W stacjach krwiodawstwa pochodne kwasu cytrynowego są stosowane jako środki
zapobiegające krzepnięciu krwi.
" W chemii gospodarczej sole kwasu cytrynowego wypierają trudno biodegradowane
fosforany ze składu detergentów.
" Estry kwasy cytrynowego znalazły zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w
cienkich powłokach ochraniających żywność.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
1
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne
Ćwiczenie 4 część teoretyczna
___________________________________________________________________________
W 1893 roku Wehmer po raz pierwszy wykrył kwas cytrynowy w kulturach
pędzlaków i nazwał je Citromyces pfefferianus, a Curie w 1917 roku stworzył przemysłowe
podstawy produkcji tego kwasu dzięki odkryciu, że Aspergillus niger rośnie dobrze i wydziela
duże ilości kwasu cytrynowego w pożywkach płynnych o pH 2,5-3,5. Wzrost pH powoduje
przestawienie produkcji na kwas glukonowy, a dalej na szczawiowy. Niska wartość pH chroni
pożywkę przed zakażeniami, głównie bakteryjnymi.
Producentami kwasu cytrynowego są wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger, A.
wentii, A. clavatus oraz liczne drożdże z rodzaju Candida (C. lipolytica, C. tropicalis, C.
intermedia), które syntezują kwas cytrynowy w środowisku zawierającym n-alkany.
Wśród szczepów z gatunku C. lipolytica został wyselekcjonowany szczep, u którego
stwierdzono cykl płciowy (został nazwany na cześć odkrywcy Yarrowia lipolytica) i który
może wytwarzać kwas cytrynowy z n-parafin, dzięki czemu znalazł szybko zastosowanie w
przemyśle. Kwas cytrynowy wytwarzają także Penicillium citrinum, Mucor piriformis.
Jednak w praktyce przemysłowej największe znaczenie mają szczepy Aspergillus niger.
Proces produkcyjny
Produkcję kwasu cytrynowego prowadzi się kilkoma metodami. Na początku
najczęściej stosowano metodę powierzchniową, potem wgłębną, a ostatnio  szczególnie w
Japonii  stosuje się hodowlę na pożywkach stałych.
Metoda powierzchniowa (LSF  liquid surface fermentation)
Oczyszczony melas rozcieńcza się wodą do zawartości 15  17% cukru, zakwasza kwasem
siarkowym do pH 6,3, dodaje pewną ilość żelazocyjanku potasowego, sterylizuje, ochładza do
temp. 40�C i przetłacza do komór fermentacyjnych, odkażonych dwutlenkiem siarki lub
formaliną.
Komory fermentacyjne zawierają ok. 80 płytkich tac fermentacyjnych, które napełnia się
roztworem melasy buraczanej i szczepi zarodnikami kultury A. Niger, wyhodowanymi na
podłożu z ziemniaczanym w probówkach i przeniesionymi następnie do kolb z wodą
wodociągową. Wodna zawiesina grzyba jest pistoletem natryskowym równomiernie
rozprowadzana na powierzchnię tac. Po około dwóch dniach powierzchnia pożywki pokrywa
się białą grzybnią kiełkujących zarodników. W czasie fermentacji tworzy się duża ilość
dwutlenku węgla, który usuwa się poprzez nawiew jałowego powietrza. Nadmierne
przewietrzanie wzmacnia jednak procesy oddechowe pleśni i zmniejsza wydajność
fermentacji. Ponadto przyczynia się do nadmiernego parowania pożywki.
Proces fermentacji trwa 9  11 dni w temp. 30  34�C. Po zakończeniu procesu można spuścić
melasę a pozostałą warstwę kożucha grzybni podwarstwić świeżą pożywką.
Wydajność fermentacji wynosi 70  80% w stosunku do użytego cukru, przy czym obok
cytrynianu do podłoża wydzielany jest kwas szczawiowy i glukonowy oraz w śladowych
ilościach kwasy z cyklu Krebsa.
W zebranym płynie pohodowlanym strąca się kwas szczawiowy (jako szczawian wapnia) i
oddziela przez sączenie. Kwas cytrynowy jest wytrącany za pomocą węglanu wapnia (dając
cytrynian wapnia [Ca3(C6H5O7)2]), potem krystalizuje się go i uwalnia przy użyciu kwasu
siarkowego. Od wytrąconego gipsu oddziela się przez filtrację. Otrzymany produkt to
jednowodny kwas cytrynowy.
Taka metoda oczyszczania kwasu cytrynowego z podłoża hodowlanego, jak również sama
hodowla metodą powierzchniową jest bardzo uciążliwa dla środowiska: duże zużycie kwasu
siarkowego, wodorotlenku wapnia, wytworzenie dużych ilości gipsu, wytworzenie ścieków o
wysokim wskaz
niku BZT5. W tej chwili opracowywane są metody wykorzystania filtratu (po
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
2
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne
Ćwiczenie 4 część teoretyczna
___________________________________________________________________________
oddzieleniu cytrynianu wapnia) jako dodatku do pasz lub do produkcji drożdży paszowych.
Gips nadaje się na materiał budowlany dopiero po oczysczeniu. Po oddzieleniu grzybni w
roztworze hodowlanym obok kwasu cytrynowego znajdują się także liczne cenne enzymy
pektynolityczne, proteolityczne, glukanazy, co stwarza możliwości ich przemysłowego
pozyskiwania.
Materiał odpadowy jakim jest grzybnia pleśni (ok. 10 kg/1 m2 tac) może być wykorzystana
jako z
ródło mikroelementów, białka (nawet 20% białka w suchej masie) i enzymów
(proteinazy, amylazy, pektynazy, oksydaza glukozowa).
Metoda wgłębna (SmF  submerged fermentation)
W chwili obecnej główny sposób produkcji kwasu cytrynowego. Standardowo fermentacja
przebiega w kadziach o pojemności 50  100 m3 zaopatrzonych w mieszadła i systemy
napowietrzające, w temp. 30  32�C w ciągu około 7 dni. Jako surowca używa się cukru
handlowego, soków cukrowniczych, mączek cukrowych, hydrolizatów skrobiowych. Rzadziej
stosowana jest melasa buraczana. Wydajność tej metody liczona na kwas w stosunku do
użytego cukru może przekraczać nawet 90%.
Pożywkę szczepi się zawiesiną konidiów, po czym w ciągu 48 godzin grzybnia rozwija się w
całej objętości pożywki i rozpoczyna się produkcja kwasu cytrynowego. Zaletą tej metody
jest krótszy czas trwania procesu, mniejsze zagrożenie zakażeniami mikroflorą (niskie pH)
oraz możliwość wydzielania kwasu cytrynowego z pożywki na drodze krystalizacji i mniejsze
obciążenie ściekami.
Dość duże trudności napotkało przestawienie używanych szczepów z rozwoju na powierzchni
na rozwój wewnątrz cieczy z zachowaniem wydajności wytwarzania kwasu cytrynowego.
Obecnie nadal trwają badania nad dopracowaniem optymalnego składu pożywki i warunków
fermentacji. Do głównych problemów należą wysoka lepkość mieszaniny reakcyjnej,
spowodowana ciągłym mieszaniem i napowietrzaniem, powodującym występowanie grzybni
w formie kłębków lub rozgałęzionych strzępek. To z kolei powoduje że środowisko
hodowlane osiąga bardzo dużą lepkość, co utrudnia wymianę masy i dyfuzję tlenu. Powstałe
zawiesiny charakteryzują się właściwościami nienewtonowskimi i wymagają stosowania
specjalnie projektowanych bioreaktorów.
Metoda na pożywkach stałych (SSF  solid state fermentation)
Najpowszechniej rozwinięta w Japonii, gdzie 20% ilości produkowanego kwasu cytrynowego
pochodzi z hodowli na podłożu stałym. Surowcem w tej metodzie mogą być otręby, wytłoki z
trzciny cukrowej, wadliwa melasa buraczana lub trzcinowa i inne odpadowe surowce
roślinne. Technologia ta budzi też duże nadzieje ze względu na znacznie niższe obciążenie
produkcji ściekami oraz wyższą tolerancję A. niger na obecność jonów metali i
mikroelementów.
Hodowla ciągła i stosowanie immobilizowanych komórek grzybni A. niger  są metodami
przyszłości w fazie opracowywania.
W Polsce produkcję kwasu cytrynowego prowadzą fabryki w Raciborzu, Zgierzu, Pelpinie,
Luboniu, Janikowie.
Szczepy Aspergillus niger stosowane do produkcji kwasu cytrynowego
Szczepy A. niger stosowane w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego
otrzymane zostały w wyniku mutagenizacji oraz skriningowych selekcji szczepów
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
3
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne
Ćwiczenie 4 część teoretyczna
___________________________________________________________________________
naturalnych. Jako mutageny stosowane są czynniki fizyczne (promieniowanie UV o dł. =260
nm), chemiczne lub kombinacje obu. Wykorzystuje się także techniki rekombinacji
genetycznej. Selekcja szczepów o cennych właściwościach technologicznych prowadzona jest
pod kątem dalszego zastosowania w ściśle określonych warunkach produkcyjnych. Uzyskane
mutanty należy zabezpieczyć przed degradacją cech materiału biologicznego, np. poprzez
liofilizację, przechowywanie konidiów z jałowym piaskiem, węglem aktywnym lub
cytrynianem wapnia. Jednak mimo takich metod zabezpieczenia często dotychczasowy
metabolizm ukierunkowany na syntezę kwasu cytrynowego zmienia się na oksydacyjny, w
wyniku czego powstaje biomasa. Stąd konieczna jest ciągła selekcja odmian o pożądanych
cechach.
Biochemiczne uwarunkowania nadprodukcji kwasu cytrynowego u Aspergillus niger
Nadprodukcja kwasu cytrynowego u niektórych odmian Aspergillus niger jest
wynikiem zakłócenia cyklu Krebsa na skutek braku lub niskiej aktywności enzymów
odpowiedzialnych za jego dalszą konwersję. Efekt ten jest warunkowany genetycznie, ale
poprzez odpowiednie warunki hodowli można zintensyfikować aktywność produkcyjną
szczepów, zapewniając wysoką wydajność kwasu cytrynowego. Kwas cytrynowy jest jednym
z etapów cyklu Krebsa, którego głównym zadaniem jest utlenianie związków organicznych, a
nie wydzielanie ich do podłoża. Fermentacja cytrynowa, polega na gromadzeniu się
znacznych ilości kwasu cytrynowego wskutek zablokowania enzymu biorącego udział w
tlenowym rozkładzie cukrów. Jeśli wez
miemy pod uwagę, że niektóre metale (cynk, mangan,
żelazo) są aktywatorami pewnych enzymów, to ich brak w pożywce powoduje blokowanie i
powstają warunki, w których wytworzony kwas cytrynowy nie może być zmetabolizowany i
jest gromadzony w podłożu. Jest to korzystne z punktu widzenia mikrobiologii technicznej i
znalazło praktyczne wykorzystanie w przemyśle.
Produkcja kwasu cytrynowego jest w wysokim stopniu uzależniona od składu pożywki.
Korzystne warunki procesu:
" wysokie stężenie cukru (ok. 10% w hodowli wgłębnej i 16% w powierzchniowej)
" niedobór jonów metali: Mn+2, Zn+2, Fe+2 (< 0,1 mg/ 100 cm3)
" ograniczona ilość związków azotu i fosforu (limitacja wzrostu grzybni)
" niska wartość pH (ok. 2,4-2,6)
" dobre natlenienie środowiska (dot. procesu wgłębnego na pożywkach syntetycznych).
Kwas cytrynowy powstaje w początkowych przemianach cyklu Krebsa, w wyniku
kondensacji acetylo-CoA i szczawiooctanu, katalizowanej przez syntazę cytrynianową (rys.
1.). W procesie rozwoju grzybni (trofofaza), a następnie produkcji kwasu cytrynowego
(idiofaza) heksozy asymilowane są w dwóch szlakach metabolicznych EMP (glikoliza) i
penztozofosforanowym (HMP). Ten ostatni szlak uaktywnia się w fazie intensywnego
rozwoju grzybni, po czym ustępuje glikolizie w fazie produkcji kwasu cytrynowego (4:1 na
korzyść glikolizy). Zatem głównym szlakiem dostarczającym prekursorów do syntezy kwasu
cytrynowego jest glikoliza. Regulatorem szybkości glikolizy jest fosfofruktokinaza, która
staje się jednocześnie regulatorem biosyntezy kwasy cytrynowego. Enzym ten jest wrażliwy
na obecność cytrynianu w środowisku, ale u szczepów A. niger w procesie produkcji kwasu
cytrynowego represja ta znoszona jest nadmiarem jonów NH4+ w komórkach, w wyniku
zakłóconych przemian białkowych spowodowanych niedoborem w podłożu jonów Mn+2.
Mechanizmem regulującym biosyntezę kwasu cytrynowego jest także ograniczenie
syntezy ATP, który jest inhibitorem fosfofruktokinazy. Dowodzi to istnienia w grzybni
alternatywnej drogi oddechowej (rys. 2.), jałowej energetycznie, a więc nie blokującej
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
4
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne
Ćwiczenie 4 część teoretyczna
___________________________________________________________________________
glikolizy. Ten typ oddychania tlenowego, często występujący u roślin, nie został jeszcze
zbadany u Aspegillus niger. Wykazano natomiast jego istnienie w grzybni Neurospora crasa
oraz drożdży Candida i Rhodotorula.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
5
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne
Ćwiczenie 4 część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Rysunek 1. Szlaki metaboliczne przemiany glukozy do kwasu cytrynowego u Aspergillus niger: 1  syntaza
cytrynianowa, 2, 3  hydrataza akonitanowa, 4  dehydrogenaza izocytrynianowa, 5  dehydrogenaza 2-
ketoglutaranowa, 6  liaza izocytrynianowa.
Alternatywna droga oddechowa ujawnia się w momencie osłabienia oddychania z
udziałem oksydazy cytochromowej, wtedy indukowana jest synteza oksydazy alternatywnej,
układu enzymatycznego katalizującego przenoszenie elektronów na tlen. Indukcję tej
oksydazy w komórkach grzybni może wywołać:
" nagromadzenie NADH
" zmniejszenie zapotrzebowania na ATP
" niedobór ADP w mitochondriach
" niedobór jonów Cu+2 niezbędnych do funkcjonowania oksydazy cytochromowej.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
6
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne
Ćwiczenie 4 część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Rys. 2. Schemat przemian oddechowych u Aspergillus niger, drogi klasyczna i alternatywna
Wymienione czynniki sprawiają, że koenzym NADH jest utleniany z udziałem
oksydazy alternatywnej szlakiem, w którym energia wydziela się w postaci ciepła, a nie ATP
(oksydaza ma niskie powinowactwo do tlenu i następuje rozkojarzenie fosforylacji
oksydatywnej). Oznacza to, że działalność oksydazy alternatywnej wymaga znacznie
wyższego stężenia tlenu w środowisku niż droga cytochromowa. Potwierdzają to badania,
które wskazują, że dopiero powyżej 21% tlenu powoduje wzrost aktywności oddychania
alternatywnego. W hodowlach metodą wgłębną, przy intensywnym napowietrzaniu jest
więc wzbudzana droga alternatywna. Awaria systemu napowietrzania powoduje
przywrócenie aktywności oksydazy cytochromowej i zahamowanie syntezy kwasu
cytrynowego na korzyść biomasy.
Inne mechanizmy regulujące syntezę kwasu cytrynowego to osłabienie reakcji
prowadzących do degradacji (dalszych przekształceń) kwasu cytrynowego, np. zahamowanie
przemian enzymatycznych cyklu Krebsa na etapach:
" hydratazy akonitanowej (hamowanej brakiem Mn+2 i Fe+2)  ogranicza dalsze
przekształcenia kwasu cytrynowego
" mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej zależnej od NADP (hamowanej
cytrynianem)
" dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej (hamowanej wysokim stężeniem cukru i jonami
NH4+).
Cykl kwasu cytrynowego związany jest także z cyklem glioksalowym, który dostarcza
kwasu szczawiooctowego  prekursora kwasu cytrynowego (rys. 1.).
Bilans fermentacji ma postać:
C6H12O6 + 1 � O2 C6H8O7 + 2 H2O + 804 kJ
Melasa buraczana jako surowiec do produkcji kwasu cytrynowego
Melasa buraczana to uboczny produkty przemysłu cukrowniczego, zawierający około
75-80% suchej masy. Przeważającą część (46-50%) stanowią cukry, natomiast do grupy
niecukrów (30% zawartości suchej masy) należą związki, zarówno korzystne (aminokwasy,
biotyna, kwas pantotenowy), jak i niekorzystne (kationy i aniony, białka, kwasy organiczne,
barwniki) dla rozwoju Aspergillus niger.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
7
MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA  studia zaoczne
Ćwiczenie 4 część teoretyczna
___________________________________________________________________________
Substancje szkodliwe dla drobnoustrojów w melasie pochodzą z:
" procesów gnicia buraków w trakcie przechowywania
" środków chemicznych stosowanych w celu zapobiegania gniciu
" preparatów używanych podczas upraw (nawozy, preparaty chwasto  i owadobójcze)
" procesów przerobu buraka na sok i dalej na cukier, kiedy to stosuje się flokulanty,
emulgatory, dezynfektanty, środki do gaszenia piany (kwasy lotne, azotany (V),
związki barwne)
Wszystkie te substancje zakłócają rozwój grzybni, albo powodują jej nieprawidłowy rozwój i
np.  zatopienie .
Nadmiar jonów ciężkich (głównie żelaza) usuwa się poprzez dodanie do podłoża
żelazocyjanku potasu. Stosuje się też odsalanie melasy na wymiennikach jonowych.
__________________________________________________________________________________________
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
8