Ćwiczenie 11 (MOiŚ)
Bakterie Amonifikacyjne i proteolityczne
1. Cykl biochemiczny azotu.
2. Etapy krążenia azotu w środowisku:
a) nitryfikacja
2 NH4+ + 3 O2 2 NO2- + 4 H+ + 2 H2O [Nitrosomonas sp., Nitrosospira sp.]
2 NO2- + O2 2 NO3- [Nitrobacter sp.]
b) denitryfikacja
2NO3- + 6H+ 2NH3 + 3O2 [denitryfikacja częściowa]
2NO3- + 10e- + 12H+ N2 + 6H2O [denitryfikacja całkowita][Azospirillum sp., Pseudomonas fluorescens]
c) amonifikacja
Proces przemiany azotu zawartego w związkach organicznych do formy amoniaku lub soli amonowych. Amonifikacja
przeprowadzana jest przez liczne organizmy zarówno tlenowe jak i beztlenowe należące do różnych taksonów (nawet
różnych królestw m.in bakterie i grzyby)
d) wiązanie wolnego azotu
N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi
[Clostridium sp., Azotobacter sp., Anabaena sp., Rhizobium sp.]
3. Bakterie proteolityczne, amonifikacyjne i ich znaczenie w obiegu azotu.
4. Wykonanie badania w kierunku oznaczania NPL bakterii amonifikacyjnych w 100 ml
a) posiewamy próbki wody lub ścieków (nierozcieńczone) w ilościach:
3 x 10 ml do probówek wypełnionych 1 ml 10-krotnie stężonego podłoża
3 x 1 ml do probówek wypełnionych 10 ml standardowego podłoża
3 x 0,1 ml probówek wypełnionych 10 ml standardowego podłoża
b) inkubujemy przez 7 dni w temperaturze pokojowej
c) po inkubacji do każdej probówki dodajemy odczynnik Nesslera (w stosunku 1:1)
d) próby dodatnie to te probówki w których po dodaniu reagentu wystąpi żółtopomarańczowe lub czerwonobrunatne
zabarwienie
e) odczytane próby dodatnie porównujemy z tablicami dotyczącymi posiewów trójkowych i określamy liczbę bakterii
amonifikacyjnych w 100 ml
5. Wykonanie badania w kierunku oznaczenia liczby bakterii proteolitycznych w 1 cm3 próbki
a) wykonujemy rozcieńczenia badanej próby w postępie dziesiętnym
b) z każdego rozcieńczenia nanosimy na 2 szalki Petriego po 0,1 ml próby i rozprowadzamy  hokejówką po całej
powierzchni podłoża
c) inkubujemy 24-48 godzin w temperaturze pokojowej
d) liczymy kolonie  dodatnie czyli takie wokół których występuje przejaśnienie spowodowane rozkładem kazeiny
(aktywność proteolityczna)
e) obliczamy liczbę bakterii w 1 cm3 próbki.
Mnożymy średnią liczbę kolonii bakteryjnych obu posiewów z jednego rozcieńczenia x 10 x odwrotność
rozcieńczenia.
Pod uwagę bierzemy rozcieńczenia, które dały w każdym z posiewów (na obu szalkach) liczbę kolonii
mieszczącą się w zakresie szeregu optymalnego (30-300 kolonii).
W przypadku gdy posiewy wykonane z więcej niż jednego rozcieńczenia zawierają liczbę kolonii
mieszczącą się w szeregu optymalnym, obliczamy liczbę kolonii w 1 cm3 osobno dla każdego rozcieńczenia a
następnie wyciągamy średnią.