BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO  biotechnologia środowiska
Dwiczenie 6 i 7 Analiza mikroskopowa osadu czynnego
Osad czynny to nie tylko bakterie  w skład mikrofauny wchodzi całe mnóstwo pierwotniaków oraz organizmy tkankowe. Częste
obserwacje tego samego osadu umożliwiają wychwycenie bardzo istotnych zmian związanych z aktywnością, sposobem poruszania,
obecnością form przetrwalnikowych itp. Wśród pierwotniaków w osadzie spotykane są wiciowce, korzenionóżki oraz orzęski o bardzo
zróżnicowanym kształcie oraz budowie.
Najliczniej spotykane są orzęski, w tym formy pływające (Tetrahymena, Colpidium, Paramecium), pełzające (Litonotus, Chilodonella, Aspidisca)
oraz osiadłe (Vorticella, Epistilis, Opercularia, Podophrya).
Wśród nich obserwujemy gatunki bardzo wrażliwe na czynniki środowiska, i to właśnie one są bioindykatorami pracy osadu. Wśród
organizmów tkankowych najczęściej spotykane są: wrotki, nicienie, czasami brzuchorzęski lub niesporczaki. Oprócz wrotek, na które możemy
natrafid przez cały rok, organizmy te występują sezonowo. Obserwacja ich zachowania jest cenna przy opisywaniu pracy osadu. Ich obecnośd
świadczy o jego dobrej pracy i wysokim stopniu oczyszczania ścieków; są one wskaz
nikiem dobrego osadu. Obserwując osad za pomocą
mikroskopu, można otrzymad wyczerpujące informacje na temat funkcjonowania oczyszczalni. Rozmiary, stopieo skupienia oraz kształt
kłaczków osadu są związane z warunkami, w których przebiega proces, a ponadto mają podstawowe znaczenie dla właściwości
sedymentacyjnych osadu. Obecnośd specyficznych cząstek (materiałów) w kłaczkach informuje o charakterze dopływającego ścieku; z kolei
zmiany w ilości oraz przestrzennym rozmieszczeniu organizmów nitkowatych informują o potencjalnym zagrożeniu z powodu puchnięcia
osadu. Prowadząc regularne obserwacje, mamy szansę zauważyd wzrost znaczenia organizmów nitkowatych, zanim jeszcze właściwości
sedymentacyjne osadu ulegną pogorszeniu. W przypadku puchnięcia postawienie właściwej diagnozy i podjęcie odpowiednich środków
zaradczych wymaga zidentyfikowania organizmów nitkowatych. Szczególną rolę w tym zakresie funkcjonowania oczyszczalni zawsze odgrywały
pierwotniaki.
Pierwotniaki są bardzo zróżnicowane pod względem rozmiarów, kształtów oraz sposobów poruszania się. Obserwacja pierwotniaków
dostarcza dużo informacji na temat całej biocenozy. Zmiany w składzie gatunkowym czy modyfikacje proporcji ilościowych mogą zwracad
uwagę na przekształcenia zachodzące w procesie, ostrzegad przed potencjalnymi zagrożeniami lub wskazywad na wadliwe funkcjonowanie
systemu. Na przykład obserwacja mikrofauny to z pewnością najszybszy i najtaoszy sposób, żeby stwierdzid zatrucie osadu substancjami
toksycznymi. Ograniczona ruchliwośd oraz modyfikacje morfologiczne, takie jak skurczenie lub zniekształcenie komórek, to wyraz
ne oznaki
niedawnego zatrucia. Poszczególne gatunki i całe kategorie pierwotniaków wykazują zróżnicowaną wrażliwośd na działanie substancji
toksycznych. Gatunki wrażliwe zanikają, a gatunki odporne, korzystając ze zmniejszonej konkurencji, zwiększają swoją liczebnośd.
Warto pamiętad, że obserwowanie pierwotniaków jest pożyteczne nie tylko w sytuacjach awaryjnych. Ich skład gatunkowy oraz
proporcje ilościowe zależą w dużym stopniu od obciążenia substratowego i wieku osadu, czyli głównych parametrów określających
funkcjonowanie całego systemu. Kontrola obciążenia staje się coraz ważniejszym elementem sterowania we współczesnych oczyszczalniach 
na przykład pogodzenie wymogów nitryfikacji z jednoczesną kontrolą bakterii nitkowatych wymaga precyzyjnej kontroli obciążenia.
Osiągnięcie pełnej wydajności procesu w nowo uruchamianym systemie wymaga czasu.  Dojrzewanie osadu to okres intensywnych
transformacji jakościowych i ilościowych. Przebudowa  mikrofauny dotyczy nie tylko pojawiania się i zanikania
konkretnych gatunków, ale widoczna jest także w zmianach dotyczących całych grup organizmów.
Stopniowy przyrost masy osadu prowadzi do daleko idących zmian warunków pokarmowych. W pierwszym okresie dopływający
do reaktora ładunek substancji ściekowych napotyka tylko znikomą masę osadu (obfitośd dostępnych substratów pokarmowych,
bardzo wysoka aktywnośd bakterii). Gwałtowny przyrost populacji bakteryjnych prowadzi do szybkiego rozwoju żywiących się nimi
pierwotniaków. W pierwszym etapie pojawiają się te, które potrafią najszybciej rozmnażad się w warunkach obfitości pokarmu bakteryjnego 
są to przede wszystkim najdrobniejsze wiciowce heterotroficzne. W ślad za nimi pojawiają się pływające bakteriożerne orzęski. Rozwój
wiciowców oraz pływających orzęsków przyczynia się do wyraz
nego spadku zagęszczenia bakterii rozproszonych. Jednocześnie ciągły przyrost
masy osadu w reaktorze sprawia, że bakterie mają do dyspozycji coraz mniej substratów pokarmowych. A
adunek dopływających substratów
rozkłada się bowiem na coraz większą masę organizmów i dostępne zasoby stają się coraz mniejsze. Swobodnie pływające orzęski są
zastępowane przez formy osiadłe
i pełzające, które pobierają pokarm w sposób wydajniejszy i potrafią przeżyd przy znacznie niższych zagęszczeniach bakterii niż gatunki
pływające. Formy pełzające żerują także na bakteriach tworzących kłaczki. Ameby oskorupione (Testacea) stają się ważnym składnikiem osadu
dopiero w póz
niejszej fazie. Także wrotki, nicienie, niesporczaki oraz inne zwierzęta, mające z reguły dużo dłuższy czas generacji niż większośd
pierwotniaków, pojawiają się dopiero w póz
niejszych etapach sukcesji. Zmiany w  dojrzewającym osadzie czynnym wynikają głownie ze
stopniowych zmian w dostępności pokarmu bakteryjnego, umiejętności korzystania z rożnych jego rodzajów przez poszczególne gatunki lub
kategorie bakteriożerców oraz z ich zróżnicowanego tempa wzrostu.
Skład gatunkowy orzęsków w osadzie wykazuje wyraz
ny związek z jakością oczyszczonego ścieku. Curds i Cockburn stworzyli ranking
gatunków orzęsków powiązanych z określonymi zakresami BZT5 w odpływie. Wykazali, że znajomośd orzęsków w osadzie
czynnym pozwala w pewnym zakresie przewidywad jakośd odpływu. Skutecznośd systemu potwierdzono, stosując go w oczyszczalniach, z
których nie pobierano wcześniej danych. Polską modyfikację tej procedury postępowania zaproponował Klimowicz (1983). Przedstawione
metody powstały na bazie danych uzyskanych z dużej liczby oczyszczalni, reprezentujących bardzo szeroki zakres warunków.
Zaobserwowano istnienie wyraz
nego związku między składem gatunkowym  mikrofauny osadu czynnego a warunkami procesowymi i
jakością odpływu. Z praktycznego punktu widzenia zasadniczą wadą w stosowaniu tych procedur jest jednak koniecznośd identyfikowania
gatunków. Oznaczanie gatunków jest trudne, wymaga dużej wiedzy i pokaz
nego zbioru literatury. Madoni (1994) zaproponował uproszczone
podejście do oceny osadu czynnego na podstawie występujących w nim pierwotniaków. Metoda jest podobna do indeksów biotycznych
stosowanych do oceny jakości rzek za pomocą makrobezkręgowców. Ocenę osadu czynnego przeprowadza się bez konieczności identyfikacji
gatunków (z małym tylko wyjątkiem). Założono, że same proporcje ilościowe dużych i łatwych do rozpoznania kategorii pierwotniaków
pozwalają ocenid kondycję osadu i funkcjonowanie systemu.
Wiciowce heterotroficzne
Drobne wiciowce o rozmiarach < 10 źm są stałym składnikiem osadu czynnego. Stanowią także najliczniejszą kategorię wśród pierwotniaków w
dopływających ściekach. Zawsze dominują w pierwszej fazie rozruchu nowej oczyszczalni, a także w systemach
wysoko obciążonych. Żywią się głownie bakteriami rozproszonymi. Niektóre z nich są osiadłe lub czasowo przytwierdzają się do
powierzchni. Przy niższych obciążeniach liczebnośd wiciowców ulega wyraz
nej redukcji. Powodem jest silna konkurencja ze strony orzęsków
oraz drapieżnictwo  wiciowce są preferowanym pokarmem wielu drapieżnych pierwotniaków. Stwierdzenie wysokiej liczebności wiciowców w
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO  biotechnologia środowiska
Dwiczenie 6 i 7 Analiza mikroskopowa osadu czynnego
dojrzałym osadzie świadczy o złym funkcjonowaniu systemu. Może to byd rezultat nadmiernego obciążenia substratowego, braku tlenu lub
dopływu ścieków zagniwających. Wiciowce wykazują generalnie większą odpornośd niż orzęski na niedobory tlenu i obecnośd substancji
toksycznych. Z powodu swojej odporności i szybkiego tempa wzrostu, spośród wszystkich pierwotniaków wiciowce najwcześniej odradzają się
po różnego rodzaju szokowych zaburzeniach.
Orzęski swobodnie pływające
Pływające bakteriożerne orzęski to kategoria również charakterystyczna dla wysokich obciążeo substratowych i wczesnych etapów sukcesji w
nowo uruchamianych systemach. Zwłaszcza gatunki o drobnych rozmiarach z grupy Hymenostomata: Cyclidium, Tetrahymena, Uronema,
Colpidium, to organizmy dominujące w warunkach wysokiego obciążenia. Orzęski te są zdolne do bardzo szybkiego wzrostu, ale wymagają przy
tym dużego zagęszczenia bakterii w środowisku. Przy niższych zagęszczeniach bakterii są konkurencyjnie wypierane przez inne grupy o
wydajniejszych strukturach filtrujących, np. przez osiadłe czy pełzające Hypotrichida.
Osiadłe orzęski bakteriożerne
Osiadłe orzęski z grupy Peritrichidia (np. Carchesium, Vorticella, Epistylis czy Opercularia) posiadają bardzo charakterystyczne wydajne aparaty
filtrujące. Przytwierdzają się do powierzchni kłaczków osadu za pomocą sztywnych lub kurczliwych stylików. Przedstawiciele tej grupy
orzęsków to najbardziej charakterystyczny składnik osadu czynnego. Występują w szerokim zakresie obciążeo. Czasami obserwuje się ich
masowy rozwój, kiedy stanowią ponad 80% całej  mikrofauny osadu. Przypuszczalnie świadczy to o niestabilnych warunkach będących
efektem nagłego wzrostu obciążenia lub jego znacznych wahao.
Orzęski pełzające
Pełzające bakteriożerne orzęski (np. Aspidisca, Euplotes, Chilodonella, Trochilia) występują przede wszystkim w warunkach niskich i średnich
obciążeo. Liczne gatunki pełzające potrafią korzystad z bakterii związanych z kłaczkami osadu, niektóre specjalizują się w połykaniu bakterii
nitkowatych. Według niektórych autorów, stosunek ilościowy form pełzających do osiadłych ma związek z wydajnością oczyszczalni. Kiedy jego
wartośd przekracza 0,5, odpływ jest lepszej jakości. Zaobserwowano także odwrotną zależnośd form pełzających i indeksu objętościowego
osadu. Bardzo wysokie zagęszczenia form pełzających (powyżej 2 000 osobników ml-1) towarzyszą niskim wartościom SVI (poniżej 200).
Natomiast przy wartościach SVI powyżej 400  liczebnośd orzęsków pełzających szybko spada (Madoni, 1994).
Ameby oskorupione (Testacea)
W osadzie czynnym występują najczęściej przedstawiciele rodzajów: Arcella, Euglypha i Diflugia. Ich występowanie jest związane
z długim wiekiem osadu, niskim obciążeniem, dobrym natlenieniem oraz bardzo niskim stężeniem azotu amonowego  czyli z warunkami
towarzyszącymi pełnej nitryfikacji. Dlatego właśnie Testacea w osadzie czynnym są uważane za wskaz
nik dobrze przebiegającej nitryfikacji.
Opanowują tylko osady nisko obciążone, ponieważ ich tempo wzrostu jest bardzo powolne. Liczebnośd Testacea zwykle rośnie latem w
wyższych temperaturach. W miarę upływu czasu pod wpływem soli żelaza domki Arcella nabierają coraz bardziej intensywnego,
brązowożółtego zabarwienia. Niektórzy traktują intensywnośd tej barwy jako dodatkową informację wskazującą na wiek osadu.
Niektóre z pierwotniaków są gatunkami wskaz
nikowymi  przede wszystkim są to gatunki zdolne do życia w warunkach ekstremalnych, a
więc wskazują na złą kondycję osadu. Do tej grupy należą orzęski z rodzaju Opercularia. W osadzie czynnym najczęściej występują trzy gatunki:
Opercularia coarctata, Opercularia microdiscus i Opercularia minima. Dośd popularne, ale występujące raczej w niewielkich ilościach, są
charakterystyczne dla wysokich obciążeo i wysokich wartości
BZT5 w odpływie. Jeśli jednak pojawiają się w dużych ilościach w systemach, które powinny pracowad przy średnich lub niskich
obciążeniach, to świadczą zdecydowanie o złych warunkach. Poza tym gatunki te wykazują stosunkowo dużą odpornośd na rożne substancje
toksyczne, zwłaszcza na metale. W oczyszczalniach, które mają dużą domieszkę ścieków przemysłowych zawierających substancje toksyczne,
Opercularia występują często w znacznych ilościach. Opercularia coarctata bywa jedynym składnikiem mikrofauny w oczyszczalniach
przemysłowych zasilanych ściekami bogatymi w metale. Orzęskom z rodzaju Opercularia często towarzyszy Vorticella microstoma, również
charakterystyczna dla wysokiego obciążenia. Ten gatunek jest zwykle obecny we wczesnej fazie rozwijającego się osadu czynnego i z czasem
zostaje zastępowany przez Vorticella convallaria, która dominuje w stabilnych warunkach. Przy spadkach stężenia tlenu obserwowano powrót
Vorticella microstoma, uważanej za dobry wskaz
nik niedoborów tlenowych. Orzęski z rodzaju Opercularia oraz Vorticella microstoma to jedyne
gatunki, których rozpoznawanie jest konieczne przy wyznaczaniu Biotycznego Indeksu Osadu.
Świetnymi wskaz
nikami są gatunki beztlenowe, np. orzęski z rodzajów Plagiopyla, Metopus czy Caenomorpha. Dzięki osobliwej
morfologii można je łatwo rozpoznad pod mikroskopem. W warunkach naturalnych żyją w makrosiedliskach pozbawionych tlenu, takich jak
muł sapropelowy. Żywią się bakteriami siarkowymi i uważane są za wskaz
niki siarkowodoru. Gdy pojawiają się w osadzie czynnym, wskazują
wyraz
nie na wadliwe działanie systemu, np. istnienie martwych stref, w których osad zalega i zagniwa.
Za wskaz
niki dobrych warunków panujących w osadzie czynnym uważa się ameby domkowe: Arcella sp., Euglypha sp. oraz takie orzęski,
jak: Plagicampa metabolica, Coleps hirtus czy Vaginicola. Organizmy te związane są z niskim obciążeniem, długim wiekiem oraz dobrymi
warunkami tlenowymi  z warunkami sprzyjającymi nitryfikacji. W literaturze można spotkad listę organizmów wskaz
nikowych (Salvado).
Kolejnośd na liście odpowiada rosnącej jakości odpływu: im więcej organizmów z dalszych pozycji listy zawiera osad i równocześnie im większa
jest ich liczebnośd, tym lepsza jest przewidywana jakośd odpływu:
1. Drobne wiciowce
2. Drobne ameby nagie (<50źm)
3. Vorticella microstoma
4. Uronema nigricans
5. Opercularia coarctata
6. Aspidisca cicada
7. Acineria uncinata
8. Vorticella convallaria
9. Epistylis plicatilis
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO  biotechnologia środowiska
Dwiczenie 6 i 7 Analiza mikroskopowa osadu czynnego
10. Duże ameby nagie (> 50 źm)
11. Trochilia minuta
12. Euplotes aediculatus
13. Carchesium polypinum
14. Zoothamnium sp.
15. Thuricola kellicotiana
16. Vorticella campanula
Dawno już zauważono, że dobrze pracujące osady, o dobrej jakości odpływu mają na ogół bardzo urozmaicony skład gatunkowy
pierwotniaków. Z drugiej strony ograniczona liczba gatunków lub silna dominacja pojedynczej grupy świadczy najczęściej o zakłóconym
funkcjonowaniu systemu. Indeks Biotyczny Osadu uwzględnia informację o różnorodności pierwotniaków, przyznając wyższą liczbę punktów
osadom o większej różnorodności.
Występowanie określonych gatunków wskaz
nikowych tłumaczy się zwykle ich wrażliwością na konkretne czynniki środowiskowe, takie jak
np. temperatura, tlen, pH czy określone substancje toksyczne. Podstawowe znaczenie mają przedstawione wcześniej warunki pokarmowe
związane z wielkością obciążenia substratowego oraz wiek osadu. Należy jednak pamiętad, że w kształtowaniu struktury każdego systemu
ekologicznego wielką rolę odgrywają interakcje międzygatunkowe  przede wszystkim konkurencja i drapieżnictwo. Ich efekty pośrednie mogą
byd trudne do przewidzenia. Na przykład zanik konkretnego gatunku wrażliwego na dany czynnik może doprowadzid do znaczących zmian w
innym miejscu sieci troficznej. W każdej oczyszczalni powstaje osad czynny o swoistych właściwościach. Prowadząc regularne obserwacje,
operator ma szansę poznad i zanalizowad osad, nauczyd się odróżniad zmiany nieistotne od tych bardzo ważnych dla przebiegu procesu.
Bardzo często zdarza się, że wynik analizy osadu czynnego ogranicza się do przedstawienia składu gatunkowego. Należałoby jednak
pamiętad, iż sam skład gatunkowy w wielu przypadkach nie jest przydatny. Technolog oczyszczalni oczekuje informacji dotyczących jakości
osadu, jego kondycji związanej z ilością pokarmu, tlenu, wieku osadu, stwierdzenia ewentualnych zaburzeo, ustalenia przyczyn złej pracy.
Informacje takie uzyskamy tylko i wyłącznie podczas współpracy biologów ze specjalistami w zakresie technologii oczyszczania ścieków.
Kompleksowa analiza osadu czynnego
Jak przygotowad próbę do badao
Przed pobraniem próby należy delikatnie wymieszad osad.
Przygotowujemy preparaty przyżyciowe, nanosimy na szkiełko podstawowe dwie krople osadu i przykrywamy je osobnymi szkiełkami
nakrywkowymi  tak by nie stykały się ze sobą i stanowiły dwie niezależne próby.
Jak prowadzid obserwacje
Do obserwacji najlepiej użyd mikroskopu kontrastowo-fazowego  ukazuje on wyraz
nie elementy przez
roczyste, często prawie niewidoczne w
jasnym polu.
Obserwacje mikroskopowe prowadzimy w sposób systematyczny, poziomymi lub pionowymi pasami, tak aby stopniowo obejrzed całą próbę
znajdująca się pod szkiełkiem nakrywkowym.
Używamy kolejnych powiększeo mikroskopu, rozpoczynając od najmniejszych powiększeo:
1. Obiektywy 10x i 20x  służą do oceny kształtu, budowy i wielkości kłaczków, szacowania zagęszczenia bakterii nitkowatych, zagęszczenia
grup Protozoa i Metazoa.
2. Obiektyw 40x  służy do identyfikacji pierwotniaków w oparciu o ich budowę, wielkośd i ruch, oceny spójności kłaczków, zagęszczenie
bakterii  wolnożyjących : śrubowce (Spirillae), krętki (Spirochaetae).
3. Obiektyw 100x  obiektyw immersyjny (używany tylko z olejkiem)
Jak ocenid morfologie kłaczków (rysunek 107)
Obserwując kształt, budowę i wielkośd kłaczków, możemy ocenid, w jakim stopniu ich cechy morfologiczne wpływają na właściwości
sedymentacyjne osadu.
Kłaczki zwarte mają większy ciężar właściwy niż kłaczki luz
ne  szybciej sedymentują.
Podobnie kłaczki duże i mocne będą łatwiej opadad niż kłaczki słabe i drobne, lub bardzo drobne. Jeżeli drobnym kłaczkom towarzyszą kłaczki o
nieregularnym kształcie  najczęściej dochodzi do połączeo między nimi w czasie osadzanie, co sprzyja klarowaniu odpływu. Z drugiej strony
kłaczki o regularnym kształcie (zaokrąglone) łatwiej  upakowują się blisko siebie w czasie osadzania niż kłaczki nieregularne.
Cechy charakterystyczne poszczególnych grup mikroorganizmów
Aby prawidłowo dokonad oceny ogólnej jakości osadu czynnego powinniśmy wziąd pod uwagę udziały poszczególnych grup mikroorganizmów,
które są wskaz
nikami jakości odpływu i warunków panujących w komorach.
Protozoa (pierwotniaki)
Ameby nagie  (rysunek 74)
(skala 0  brak do 3  kilka w polu widzenia; obiektyw 40x)
Są to pierwotniaki o plastycznym ciele poruszające się najczęściej bardzo powoli przy pomocy tzw. nibynóżek. Odżywiają się bakteriami i
innymi pierwotniakami na drodze fagocytozy. Występują w osadach o dużym obciążeniu i obniżonej zawartości tleniu.
Ameby domkowe (rysunek 75)
(skala 0  brak do 3  kilka w polu widzenia; obiektyw 20x)
Ameby domkowe, zawdzięczające swoja nazwę pseudochitynowemu pancerzykowi otaczającemu ich ciało, są spotykane w oczyszczalniach
nisko obciążonych w warunkach sprzyjających nitryfikacji, czyli o dłuższym wieku osadu. Uważane SA za organizmy występujące w dobrze
pracującym osadzie.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO  biotechnologia środowiska
Dwiczenie 6 i 7 Analiza mikroskopowa osadu czynnego
Słonecznice (rysunek 76)
(skala 0  brak do 3  kilka w polu widzenia; obiektyw 40x)
Pierwotniaki o kulistym ciele, z którego promieniście wychodzą tzw. aksopodia służące do poruszania się i łapania pokarmu. Słonecznice
odżywiają się innymi pierwotniakami. W osadzie pojawiają się rzadko, najczęściej obserwowane w osadzie nisko obciążonym.
Wiciowce (rysunek 72)
(skala 0  brak do 3  kilka w polu widzenia; obiektyw 40x)
Grupa organizmów liczna i bardzo zróżnicowana pod względem morfologii i biologii. Poruszają się charakterystycznie dzięki jednej lub kilku
wiciom. Mogą się odżywiad rozpuszczonymi substancjami organicznymi. Obecnośd dużej liczby wiciowców świadczy o wysokim obciążeniu
osadu i niedoborach tlenu.
Orzęski
Orzęski osiadłe (rysunki 14, 17, 18, 23, 24)  osiadłe kolonie drzewkowate. Odżywiają się bakteriami, małymi glonami, wiciowcami, ich
obecnośd wskazuje na dobre i stabilne warunki panujące w osadzie
Orzęski pełzające (rysunki 36, 42, 45)  odżywiają się głównie bakteriami i małymi wiciowcami, ich obecnośd wskazuje zwykle na dłuższy wiek
osadu.
Orzęski swobodnie pływające (rysunki 53)  odżywiają się bakteriami, wiciowcami i innymi orzęskami, ich obecnośd świadczy o dobrej pracy
osadu.
Metazoa (bezkręgowce)
Wrotki (rysunek 109)
(skala: 0  brak, 1  od jednego do trzech w preparacie, 2  kilka w preparacie, 3  przynajmniej jeden w większości pól widzenia; obiektyw 20x)
Wrotki to organizmy wielokomórkowe o owalnym lub robakowatym kształcie. Odżywiają się bakteriami, mogą pomagad w tworzeniu się
kłaczków poprzez wydzielanie lepkich, śluzowatych substancji, a także rozdrabnianie większych kłaczków, poprawiając tym samym warunki
tlenowe wewnątrz kłaczków i tworząc nowe powierzchnie adsorpcji dla namnażających się bakterii. Wrotki SA wskaz
nikami dłuższego wieku
osadu.
Nicienie (rysunek 110)
(skala 0  brak, 3  kilka w preparacie)
Nicienie odżywiają się głównie bakteriami i bardzo małymi cząstkami kłaczków. Są spotykane w oczyszczalniach o niskim obciążeniu i i wysokiej
zawartości tleniu. Nicienie mogą odgrywad ważną rolę w osadzie poprzez stymulowanie wzrostu bakterii, a także ułatwianie dyfuzji tlenu do
wnętrza dużych kłaczków poprzez ich rozdrabnianie.
Skąposzczety (rysunek 111)
(skala: 0  brak, 1  jeden na dwa preparaty, 2  dwa na dwa preparaty, 3  trzy i więcej)
Organizmy wielokomórkowe, o segmentowatym, wydłużonym ciele ze szczecinami po obu stronach pierścieni. Ich ciało najczęściej jest pokryte
czerwonymi lub pomaraoczowymi plamkami. Odżywiają się całymi kłaczkami osadu lub mniejszymi mikroorganizmami.
Niesporczaki (rysunek 112)
(skala: 0  brak, 1  jeden do trzech w preparacie, 2  kilka w preparacie, 3  przynajmniej jeden w większości pól widzenia; obiektyw 20x)
Organizmy wielokomórkowe o krępym ciele i czterech parach odnóży zakooczonych pazurkami. U większości gatunków występuje para
pigmentowanych oczu. Odżywiają się fragmentami kłaczków. Pojawiają się sporadycznie w osadach o niskim obciążeniu.
Bakterie nitkowate występujące w osadzie
Bakterie nitkowate (rysunek 108)
(skala referencyjnych obrazów FI 0-5)
Uznaje się, że nadmierny rozwój bakterii nitkowatych jest jedną z głównych przyczyn puchnięcia osadu czynnego. Ponieważ określenie
bezwzględnej liczebności jest trudne i bardzo czasochłonne, opracowano system szacowania udziału bakterii nitkowatych (FI w skali 0-5)
poprzez porównanie z obrazami referencyjnymi określającymi konkretną wartośd skali.
Ważne jest, by przed porównaniem z obrazem referencyjnym obejrzed cały preparat, w wyniku czego w naszej pamięci powstaje niejako
uśredniony obraz pozwalający na bardziej obiektywne porównanie ze zdjęciem referencyjnym.
Actinomycetes (Nocardiopodobne) (rysunek 86)
Cechy charakterystyczne: brak ruchu, krzaczkowate kolonie głównie wewnątrz lub wokół kłaczków, brak granul siarki, Gram-dodatnie, Neisser-
ujemne (często są obserwowane Neisser-dodatnie granule polifosforanów),
Czynnik sprzyjające rozwojowi: szeroki zakres wieku osadu, wysoka zawartośd tłuszczów, lotnych kwasów tłuszczowych, substancji
powierzchniowo czynnych, stosunkowo wysoka temperatura (dominują głównie latem)
Microthrix parvicella (rysunek 91)
Cechy charakterystyczne: brak ruchu, nici skłębione w kłaczkach lub pomiędzy kłaczkami, Gram-dodatnia, Neisser-dodatnia  wybarwione na
czarno granule poli-P.
Czynnik sprzyjające rozwojowi: niskie obciążenie osadu, długi i średni wiek osadu, wysoka zawartośd kwasów tłuszczowych i ich estrów, niski
poziom tlenu w komorze napowietrzania, wysoka zawartośd azotu amonowego,
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO  biotechnologia środowiska
Dwiczenie 6 i 7 Analiza mikroskopowa osadu czynnego
Sphaerotilus natans (rysunek 94)
Cechy charakterystyczne: brak ruchu, nici proste lub lekko wygięte, komórki pałeczkowate lub prostokątne, Gram-ujemne, Neisser-ujemne.
Czynniki sprzyjające rozwojowi: niedobór tlenu, wysoki stosunek węgla do azotu i węgla do fosforu, dopływ ścieków zagniwających,
przeciążenie ładunkiem przy niedoborze tlenu.
Bakterie swobodnie pływające
Śrubowce (Spirillae) (rysunek 114)
(skala: 0  brak, 1  kilka, 2  kilkanaście, 3  kilkadziesiąt w polu widzenia; obiektyw 40x)
Śrubowce swobodnie pływające przypominające korkociąg bakterie, które najczęściej poruszają się bardzo szybko, często zmieniając kierunek.
Są uważane za wskaz
nik niedoboru tlenu w osadzie czynnym.
Krętki (Spirochaetae) (rysunek 115)
(skala: 0  brak, 1  kilka, 2  kilkanaście, 3  kilkadziesiąt w polu widzenia obiektyw 40x)
Występują głównie w oczyszczalniach z systemem usuwania nutrietów.
Monokolonie (rysunek 116, 117)
(skala: 0  brak, 1  mniej niż pięd w preparacie, 2  od pięciu do dwudziestu w preparacie, 3  widoczne w prawie każdym polu widzenia;
obiektyw 20x)
Monokoloniami nazywamy występujące w kłaczkach lub pomiędzy kłaczkami skupiska bakterii tego samego typu, często obudowane
śluzowatymi otoczkami. W kontraście fazowym są widoczne jako opalizujące, niebieskawe twory o kulistym kształcie. Wśród bakterii
tworzących tego typu monokolonie wyróżniamy bakterie kumulujące polifosforany (poli-P). Ich obecnośd świadczy o dobrych warunkach
defosfatacji. Monokolonie mogą tworzyd jeszcze bakterie denitryfikacyjne, zooglearne.
Cel dwiczenia
Celem dwiczenia jest zapoznanie się ze strukturą i funkcjonowaniem osadu czynnego.
Wykonanie dwiczenia cz.1
1. Materiały, aparatura, odczynniki:
- osad czynny
- mikroskop kontrastowo-fazowy (sala 5A)
- barwnik A  błękit metylenowy
- barwnik B  fiolet krystaliczny
- barwnik C  chryzoidyna 1% roztwór
- olejek immersyjny
2. Ogólna ocena kłaczków i pierwotniaków osadu czynnego
2.1. Obserwacje mikroskopową osadu czynnego prowadzimy w kontraście-fazowym  mikroskop w sali 5A.
2.2. Należy przygotowad preparat przyżyciowy dokładnie wymieszanego osadu czynnego. W tym celu na szkiełko
podstawowe nanosimy pipetą dwie krople osadu tak aby po przykryciu ich osobnymi szkiełkami nakrywkowymi,
szkiełka nie stykały się.
2.3. Obserwacje mikroskopowe prowadzimy w sposób systematyczny, poziomymi lub pionowymi pasami, tak aby
stopniowo obejrzed całą próbę znajdująca się pod szkiełkiem nakrywkowym, przy powiększeniu obiektywu 10x, 20x, 40x
2.4. Przy powiększeniu 10x należy zaobserwowad:
2.4.1. kształt, budowę i wielkośd kłaczków osadu
2.4.2. zagęszczenie przedstawicieli Protozoa i Metazoa (skala 0-3) reprezentujących: orzęski, wiciowce, ameby nagie,
ameby skorupkowe (domkowe), słonecznice, wrotki, nicienie, skąposzczety
podczas analizy, w razie potrzeby, posłużyd się tablicami z rysunkami schematycznymi organizmów osadu czynnego,
oraz ich charakterystyka przedstawiona w powyższej kompleksowej analizie osadu czynnego)
2.5. Przy powiększeniu 20x, 40x zaobserwowad:
2.5.1. budowę i wielkośd pierwotniaków
2.5.2. spójnośd kłaczków osadu
2.6. Wyniki analizy zestawid w tabeli 1
Wykonanie dwiczenia cz. 2
3. Ocena bakterii osadu czynnego
3.1. Wykrywanie materiałów zapasowych (poli-P) - barwienie metodą Neissera (rysunek 85)
Barwienie pozwala na stwierdzenie obecności w komórkach bakterii materiałów zapasowych w postaci polifosforanów
(od fioletu do koloru czarnego)
Barwienie wykonujemy nad wanienką do barwienia, preparat umieszczamy na statywie, do płukania używamy wody
destylowanej.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO  biotechnologia środowiska
Dwiczenie 6 i 7 Analiza mikroskopowa osadu czynnego
3.1.1. Przygotowad suchy preparat osadu czynnego  w tym celu na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanosimy
pipetą kroplę osadu czynnego, drugim szkiełkiem wykonujemy jej rozmaz, suszymy preparat (do odparowania
wody).
Przygotowad świeży roztwór (A+B) składający się z dwóch części roztworu A i jednej części roztworu B  w tym celu
wprowadzamy do probówki pipetą 1 ml barwnika A i 0,5 ml barwnika B.
3.1.2. Nanieś na utrwalony preparat roztwór A+B  po 15 sekundach spłukad wodą nad wanienką
3.1.3. Nanieśd roztwór C  po 45 sekundach spłukad wodą nad wanienką
3.1.4. Pozostawid preparat do wyschnięcia na ręczniku papierowym/bibule
3.1.5. Preparat oglądad w jasnym polu stosując powiększenie obiektywu 40x lub 100x z olejkiem immersyjnym 
mikroskop jasnego pola pracownia 01
W preparacie zaobserwowad obecnośd ziaren poli-P (kolor fioletowy do czarnego) wewnątrz komórek bakterii.
Barwienie to pozwala również na identyfikację bakterii nitkowatych:
- Neisser-ujemne: Sphaerotilus natans, Nocardia, Thiotrix
- Neisser-dodatnie: Micrithrix parvicella
3.2. Analiza bakterii nitkowatych i swobodnie pływających
3.3. Obserwacje mikroskopową osadu czynnego prowadzimy w kontraście-fazowym  mikroskop w sali 5A.
3.4. Należy przygotowad preparat przyżyciowy dokładnie wymieszanego osadu czynnego. W tym celu na szkiełko
podstawowe nanosimy pipetą dwie krople osadu tak aby po przykryciu ich osobnymi szkiełkami nakrywkowymi,
szkiełka nie stykały się.
3.4.1. Przy powiększeniu 10x należy określid zagęszczenie bakterii nitkowatych (indeks FI od 0 do 5)
FI 0  występują pojedynczo w preparacie mikroskopowym
FI 1  występują pospolicie, ale nie w każdym kłaczku
FI 2  występują od 1-5 nici w każdym kłaczku (liczebnośd niska)
FI 3  występują od 5-20 nici w każdym kłaczku (liczebnośd średnia)
FI 4  występują powyżej 20 nici w każdym kłaczku (liczebnośd wysoka)
FI 5  występują masowo w kłaczku i pomiędzy kłaczkami lub więcej nici niż kłaczków
3.4.2. Przy powiększeniu 40x należy określid zagęszczenie bakterii nie związanych z kłaczkami: śrubowców  Spirillae
(skala 0-3) i krętków  Spirochaetae (skala 0-3).
3.5. Wyniki zestawid w tabeli 1
4. Opracowanie wyników
Na podstawie wyników zestawionych w tabeli 1 ocenid jakośd osadu czynnego (tabela 2).
5. Literatura
5.1. Fijałkowska E. i wsp., Osad czynny  biologia i analiza mikroskopowa, Oficyna Wydawnicza IMPULS, Kraków 2005.
5.2. Dymaczewski Z., Poradnik eksploatatora oczyszczalni ścieków. Polskie Zrzeszenie inż. i Tech. Sanitarnych, Poznao, 1997.
Obecnośd ziaren poli-P (tak/nie)
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba