Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1
WYTWARZANIE I ANALIZA PRODUKTÓW MLECZNYCH
Fermentacja różno-kulturowa, otrzymywanie kefiru.
Kefir jest popularnym napojem mlecznym fermentowanym, wywodzącym się z Bałkanów. Sporządzany jest z mleka
krowiego lub koziego, fermentację powodują drobnoustroje w postaci ziaren kefirowych (grzybki kefirowe) złożonych z
paciorkowców mlekowych Streptococcus lactis (75%) oraz Betabacterium caucasicum (25%) żyjących w symbiozie z
drożdżami z rodzaju Candida. Symbioza polega na zakwaszaniu środowiska przez bakterie, hydrolizie laktozy do m.in.
glukozy, która jest wykorzystywana przez drożdże, dostarczające w zamian witaminy z grupy B. Kefir zawiera 0,8% kwasu
mlekowego, 0,3-0,8% etanolu i znaczną ilość CO2. Miano coli nie może być mniejsze niż 0,1.
Immobilizacja enzymów
Enzymy są biokatalizatorami, które charakteryzuje:
- wysoka specyficzność działania
- kierunkowość działania
- zdolność do obniżania w istotny sposób energii aktywacji reakcji chemicznych.
Dzięki temu znalazły szerokie zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu spożywczego, farmaceutycznego, kosmetycznego,
chemicznego i w analityce medycznej. Często jednak stosowanie enzymów w formie natywnej wiąże się z wysokimi kosztami
prowadzenia procesów, szczególnie wtedy gdy konieczne jest stosowanie preparatu enzymatycznego o wysokim stopniu
oczyszczenia, jak np. w farmacji, a także wówczas gdy proces prowadzony jest cyklicznie. Dlatego od 60-ych lat XX wieku
coraz większym zainteresowaniem cieszą się enzymy immobilizowane.
Pierwszą technologią, która wykorzystała unieruchomiony biokatalizator, była mikrobiologiczna produkcja kwasu octowego.
Dziś stosuje się unieruchamianie zarówno pojedynczych enzymów, kompleksów dwóch lub większej ilości enzymów, jak i
całych komórek czy struktur komórkowych.
Najczęściej stosowanymi metodami unieruchamiania enzymów są:
1. Metody z wykorzystaniem oddziaływań fizycznych:
- immobilizacja oparta na adsorpcji i adhezji, które wykorzystują siły jonowe, wiązania wodorowe, oddziaływania van
der Waalsa i inne słabe oddziaływania fizykochemiczne do związania enzymu z nośnikiem, takim jak: drewno,
celuloza, polimery syntetyczne, antracyt, tlenki metali, szkło porowate, ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny, pumeks
czy jonity (DEAE-Sephadex, CM-celuloza itp.)
- pułapkowanie biokatalizatora wewnątrz struktury naturalnych lub syntetycznych polimerów; przykładowymi
nośnikami są: agar, alginian, kolagen, poliakrylamid, poliuretan, polistyren, żywice sieciowane energią świetlną
- immobilizacja z wykorzystaniem półprzepuszczalnych membran lub układów fazowych, gdzie membrana lub granica
faz stanowi przegrodę uniemożliwiającą migrację enzymu:
� zamykanie w komórkach naturalnych, np. w erytrocytach
� kapsułkowanie i mikrokapsułkowanie (liposomy, kapsułki nylonowe, polimocznikowe, pochodne
celulozowe)
� zamykanie pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami lub w wężach (np. silikonowych, nylonowych)
- pułapkowanie we włóknach (włókna z octanu celulozy)
2. Metody z wykorzystaniem oddziaływań chemicznych
- immobilizacja poprzez tworzenie wiązań kowalencyjnych (peptydowego, estrowego, węgiel-węgiel, węgiel-azot i in.);
nośniki i odczynniki wiążące to np.: hydroksyalkilometakrylan - aldehyd glutarowy, CM-celuloza  karbodiimid, szkło
porowate lub silikażel  aldehyd glutarowy, a także: diaminy, kwasy dikarboksylowe, bromocyjan, izomocznik
- unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego, np. sieciowanie przestrzenne, kopolimeryzacja
enzymów z nośnikami rozpuszczalnymi przy użyciu odczynników dwufunkcyjnych) oraz sieciowanie kryształów i
agregatów białek enzymatycznych (enzym pełni rolę matrycy i biokatalizatora)
Zaletami metod fizycznych jest zachowanie struktury enzymu oraz łatwość i niski koszt przeprowadzenia procesu
immobilizacji. Często jednak następuje wymywanie biokatalizatora ze złoża, zwłaszcza w przypadku stosowania prostej
adsorpcji białka na powierzchni matrycy.
Metody chemiczne zapewniają stabilność układu, ale w wielu przypadkach wiąże się to z częściową utratą aktywności
enzymu, spowodowaną zmianą konformacji białka. Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem jest łatwą metodą i daje stabilny
układ, lecz jest kosztowne. Pułapkowanie w żelu jest tanie, ale nie można stosować go do enzymów hydrolitycznych,
działających na substraty wielkocząsteczkowe, czyli mogących degradować żel. Kapsułkowanie stosuje się przede wszystkim
w farmacji, jest jednak trudne w kontroli i znajduje zastosowanie jedynie do przemian niskocząsteczkowych, podobnie jak
membrany półprzepuszczalne. Natomiast wzajemne sieciowanie jest łatwe i tanie, zapewnia dużą aktywność i stabilność
chemiczną, jednak przy tym niską stabilność mechaniczną.
Podstawowym parametrem technologicznym, który pozwala ocenić celowość stosowania wybranej metody immobilizacji, jest
stabilność operacyjna enzymu. Określa ona czas pracy, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności
biokatalizatora.
W czasie procesu technologicznego immobilizowany biokatalizator stopniowo traci swoją produktywność, co spowodowane
jest:
- wymywaniem enzymu ze złoża oraz rozpuszczaniem się lub ścieraniem matrycy
- utratą aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu
Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1
- pogorszeniem się warunków kontaktu substratu z enzymem w wyniku zanieczyszczenia i zatkania się porów złoża lub
mechanicznego zgniatania matrycy
- zanieczyszczeniem mikrobiologicznym
Wady stosowania immobilizacji enzymów są następujące:
- wysoki koszt, związany głównie z otrzymaniem czystego preparatu enzymatycznego
- utrata aktywności wywołana zmianą warunków fizykochemicznych środowiska, w porównaniu do warunków, jakie
panowały wewnątrz komórki przed izolacją
- utrata aktywności podczas prowadzenia procesu immobilizacji (w tym ilościowe straty enzymu)
Większość wyżej wymienionych wad można usunąć przez dobór prawidłowej metody immobilizacji dla potrzeb konkretnego
procesu technologicznego.
Zalety unieruchamiania enzymów:
- immobilizacja może stabilizować strukturę białek, dzięki czemu zwiększona jest ich termostabilność i odporność na
działanie czynników denaturujących
- możliwość stosowania enzymów w środowisku organicznym
- łatwe oddzielenie od mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu procesu, dzięki czemu otrzynujemy produkt o wysokiej
czystości
- możliwość wielokrotnego wykorzystywania biokatalizatora
- ograniczenie inhibicji enzymu, zarówno przez substrat jak i przez produkt, podnosi wydajność procesu biokatalizy
- możliwość pracy w systemach ciągłych (np. z wykorzystaniem reaktora przepływowego)
Wykonanie ćwiczenia (cz. 1)
I. Immobilizacja (unieruchomienie) enzymu i komórek drożdży.
1. W zlewce o objętości 100 cm3 przygotować 80ml 1,5% roztwór CaCl2 w wodzie destylowanej.
2. W probówce sporządzić 2% roztwór alginianu sodu, w 5 ml wody destylowanej.
Alginian sodu niezbyt dobrze rozpuszcza się w wodzie, wymaga ciepłej wody, wytrząsania i cierpliwości w czasie rozpuszczania
(roztwór alginianu ogrzewamy umieszczając w ciepłej wodzie  ogrzanej w małej zlewce na kuchence elektrycznej, lub w łaz
ni wodnej
w temperaturze ok. 50-600C).
3. Odważyć/odmierzyć 2g/ml drożdży piekarniczych/winiarskich.
4. Rozpuścić i wymieszać (vortex) odważone drożdże w probówce zawierającej 5ml wody destylowanej. Zakryć
probówkę folią aluminiową i pozostawić do wyrośnięcia przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Do probówki z rozpuszczonym alginianem wlać zawiesinę drożdży i wsypać całą zawartość kapsułki
zawierającej bakterie z rodzaju Lactobacillus. Całość dokładnie wymieszać (wytrząsanie, vortex).
6. Nabrać ok. 10ml mieszaniny drożdży, bakterii i alginianu sodu do strzykawki - użyć wężyka gumowego,
następnie zdjąć wężyk i dodawać powoli, po kropli roztwór do zlewki z 1,5% CaCl2.
Nie wolno dopuścić aby końcówka strzykawki zetknęła się z roztworem CaCl2.
Po wkropleniu całości należy dokładnie umyć strzykawkę, wężyk i używane probówki z pozostałości alginianu !!!
7. Pozostawić kulki immobilizowanych komórek drożdży i bakterii do utwardzenia w roztworze CaCl2 przez 10
minut.
8. Odcedzić powstałe kuleczki z roztworu CaCl2 za pomocą sitka (przelewając zawartość przez sitko do drugiej
zlewki) i pozostawić, aż odciekną.
9. Kuleczki przechowywać w zlewce z jałową wodą destylowaną.
II. Przygotowanie fermentowanego mleka.
1. Wlać ok. 300 ml mleka do zlewki 800-1000ml, przykryć folią aluminiową i wstawić do łaz
ni wodnej o
temperaturze ok. 40-450C na 10 minut (do kontroli temperatury wody użyć termometru).
2. Ogrzane mleko poddać procesowi homogenizacji - ok. 5 minut.
3. Po homogenizacji mleko spasteryzować zagotowując je na kuchence  w trakcie gotowania mleko należy od
czasu do czasu zamieszać !!!
4. Po pasteryzacji mleko schłodzić do temperatury ok. 400C w zimnej wodzie.
5. Rozlać po ok. 150ml mleka do 2 jałowych kolby o pojemności 250-300 cm3, do pierwszej dodać 3-4 łyżeczki
jogurtu naturalnego, do drugiej kuleczki immobilizowanych komórek drożdży i bakterii (po uprzednim
odcedzeniu, kuleczki pobrać łyżeczką plastikową) . Całość delikatnie zamieszać.
6. Dokonać pomiaru pH mleka.
Należy pamiętać, aby dokładnie płukać elektrodę wodą destylowaną i delikatnie ją osuszyć bibułą przed każdym pomiarem.
7. Szczelnie zakryć kolby folią aluminiową, opisać i inkubować w temperaturze ok. 300C przez ok. 1-2 godziny.
8. Po tym czasie wyciągnąć kolby z termostatu i przechowywać w chłodnym miejscu do kolejnych zajęć.
Otrzymywanie mleka pozbawionego laktozy. Ocena aktywności enzymatycznej laktazy.
Immobilizacja enzymów.
Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1
Enzym laktaza katalizuje hydrolizę laktozy do glukozy i galaktozy. Oba produkty są słodsze od laktozy i dużo
chętniej konsumowane niż ten cukier. Pomimo tradycyjnych upodobań konsumentów co do spożywania produktów
mlecznych pochodzących od krów, znaczna część populacji (szacuje się, że nawet ok. 75%) nie jest w stanie
przyswoić zbyt dużej ilości laktozy. Mleko krowie może zostać poddane trawieniu poprzez dodanie enzymów
hydrolizujących laktozę, co pozwala otrzymać produkt dla ludzi nie tolerujących tego dwucukru.
Wykonanie ćwiczenia (cz. 2)
I. Analiza wyników fermentacji mlekowej
Dokonać pomiaru pH otrzymanych produktów i opisać zaobserwowane zmiany (konsystencja, barwa itd.).
II. Immobilizacja laktazy
UWAGA!!!
Wszystkie roztwory używane w doświadczeniu muszą być przygotowane na bazie wody destylowanej (jony wapnia w wodzie kranowej
mogą wchodzić w reakcje z alginianem sodu).
1. W zlewce o objętości 100 cm3 przygotować 80ml 1,5% roztwór CaCl2 w wodzie destylowanej.
2. W probówce sporządzić 2% roztwór alginianu sodu, w 5 ml wody destylowanej.
Alginian sodu niezbyt dobrze rozpuszcza się w wodzie, wymaga ciepłej wody, wytrząsania i cierpliwości w czasie rozpuszczania
(roztwór alginianu ogrzewamy umieszczając w ciepłej wodzie  ogrzanej w małej zlewce na kuchence elektrycznej, lub w łaz
ni wodnej
w temperaturze ok. 50-600C).
3. Za pomocą glukometru oznaczyć w mleku (nie UHT), które będzie używane w doświadczeniu poziom glukozy
 patrz pomiar glukozy
4. Wprowadzić do probówki z roztworem alginianu sodu zawartość kapsułki z enzymem laktazą. Całość
dokładnie wymieszać (vortex).
5. Mieszaninę enzymu i alginianu pobrać do strzykawki  użyć wężyka gumowego i delikatnie wkraplać do
zlewki z CaCl2.
Nie wolno dopuścić aby końcówka strzykawki zetknęła się z roztworem CaCl2.
Po wkropleniu całości należy dokładnie umyć strzykawkę, wężyk i używane probówki z pozostałości alginianu !!!
6. Pozostawić kulki immobilizowanego enzymu do utwardzenia w roztworze CaCl2 przez 10 minut.
7. Odcedzić powstałe kuleczki z roztworu CaCl2 za pomocą sitka (przelewając zawartość przez sitko do drugiej
zlewki) i pozostawić, aż odciekną.
8. Jako kolumny wypełnionej immobilizowaną laktazą użyć cylindra strzykawki (10ml). W tym celu należy
wyjąć tłoczek ze strzykawki, umieścić w środku kawałeczek waty i ubić go delikatnie tłoczkiem tak aby
grubość warstwy nie przekraczała 1 cm. Wata lub gaza zapobiegną blokowaniu wylotu cylindra strzykawki
przez kuleczki enzymu.
9. Do strzykawki wprowadzić kuleczki unieruchomionego w alginianie enzymu (użyć plastikowej łyżeczki).
10. Przez tak przygotowaną kolumnę przelać powoli ok. 50ml mleka. Otrzymaną frakcję zebrać do czystej zlewki
o pojemności 50-100ml i po kilku minutach oznaczyć w niej poziom glukozy za pomocą glukometru  patrz
pomiar glukozy.
III. Pomiar glukozy za pomocą glukometru
Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1
Zamiast próbki krwi nanosimy kroplę mleka
rozcieńczonego 5-krotnie w wodzie destylowanej.
Rozcieńczone mleko nanosimy na brzeg paska za
pomocą pipety automatycznej
Jeżeli próbka mleka jest zbyt mała  można nanieść
dodatkową ilość w ciągu 60 sekund od czasu
naniesienia pierwszej kropli
Wynik pomiaru stężenia podawany jest w mg/dl
Zakres pomiaru gleukometru wynosi od 20-500 mg/dl.
Jeżeli wynik pomiaru jest niższy niż 20 mg/dl na ekranie wyświetlacza pojawia się symbol LO.
(należy zmniejszyć rozcieńczenie próby)
Jeżeli wynik pomiaru jest wyższy od 500 mg/dl na ekranie wyświetlacza pojawia się symbol HI
(należy zwiększyć rozcieńczenie próby)
IV. Opracowanie wyników:
- pomiary pH, opis otrzymanego produktu i na tej podstawie wyciągnięte wnioski o przebiegu i skutkach
fermentacji,
- pomiary poziomu glukozy w mleku i na tej podstawie wyciągnięte wnioski dotyczące aktywności laktazy.
V. Materiały do ćwiczeń, które zapewnia student !
Cz. 1:
- świeże drożdże (kostka)
- mleko  300ml
- jogurt naturalny  10ml
Cz. 2:
Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1
- mleko ok. 100ml (nie UHT!!!)
VI. Zagadnienia teoretyczne:
- rodzaje fermentacji mlekowej
- przemysłowe wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej
- immobilizacja enzymów
VII. Literatura:
- Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998.
- Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
- Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki A
ódzkiej; 2000
- Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003.