WYDZIAA
CHEMICZNY POLITECHNIKI ÅšL
SKIEJ
W GLIWICACH
KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ
I BIOTECHNOLOGII
ĆWICZENIE 8
ENZYMATYCZNA REDUKCJA
ZWI
ZKÓW KARBONYLOWYCH ORAZ WI
ZAC

C=C
OPRACOWAA
: mgr inż. Tadeusz Gorewoda
PROWADZ
CY: mgr inż. Tadeusz Gorewoda
Gliwice 2006
Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C
1. Wstęp;
Już od prawie wieku drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae) są obecne
w syntezie organicznej. Przez ten czas stały się one jednymi z najbardziej popularnych
biokatalizatorów komórkowych, stosowanych w różnych typach reakcji. Jednym z szerszych
zastosowań tych organizmów są reakcje redukcji. pośród tych reakcji można wymienić:
redukcje ²-ketoestrów, diketonów i ketokwasów; redukcje Ä…-hydroksyaldehydów
i Ä…-hydroksyketonów do Ä…,²-dioli; redukcjÄ™ zwiÄ…zków zawierajÄ…cych wiÄ…zanie C=C;
redukcję aromatycznych i nienasyconych ketonów; redukcję związków nitrowych.1 Wyżej
wymienione reakcje mogą zachodzić dzięki obecności w komórkach drożdży enzymów
z grupy reduktaz.
Podczas ćwiczenia zostaną przeprowadzone reakcje:
a) Redukcji ²-ketoestru do ²-hydroksyestru;
b) Redukcji wiązania podwójnego węgiel  węgiel;
1.1 Redukcja ² ²-hydroksyestru
²-ketoestru do ²
² ²
² ²
Spośród reakcji redukcji przebiegających z udziałem drożdży piekarskich najszerzej
opisywanÄ… grupÄ… sÄ… redukcje ²-ketoestrów do ²-hydroksyestrów. Badania genomu
S. cerevisiae wykazały 49 sekwencji kodujących białka zdolne do aktywności redukcyjnej.
Wykazano różnice pomiędzy działaniem poszczególnych enzymów, ich aktywnością
stereoselektywnością. Używając do reakcji wydzielone enzymy uzyskiwano doskonałe
selektywności (>90% ee, >90% de). Użycie całych komórek drożdżowych dało w niektórych
przypadkach nieco gorsze rezultaty.2 Wiąże się to z faktem działania całej gamy enzymów.
Dodatkowo taka metoda charakteryzuje się większą objętością mieszaniny reakcyjnej
i większym balastem, niż użycie pojedyńczych enzymów. Jednakże za użyciem całych
komórek drożdżowych przemawia istotny fakt, iż opisywane procesy zachodzą z udziałem
koezymu jakim jest NADPH (zredukowany fosforan dinukleotydu nikotyno-
amidoadeninowego). Aby koenzym ten mógł się regenerować, wymagane jest dostarczenie
drożdżom węglowodanów (np. glukozy).
R2 R3
R R1
+
węglowodan
NADP
OH
H
OH
reduktaza
R R1 R2 R3
NADPH
O O
1
Servi S.; Synthesis 1990, 1-25
2
Kaluzna I., Matsuda T., Sewell A. K., Stewart J. D.; J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12827-12832.
Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C
Największą zaletą redukcji ketoestrów z użyciem drożdży jest selektywność reakcji.
W przypadku ą-niepodstawionych ketoestrów stwierdzono, iż wielkość podstawnika przy
węglu C3 oraz podstawnika przy grupie estrowej wywiera istotny wpływ na enancjo-
selektywność reakcji. Wybierając odpowiednie podstawniki można więc uzyskać produkt
o pożądanej konfiguracji z wysokim nadmiarem enancjomerycznym. Poniżej przedstawiono
kilka przykładów:
OH O
O O
R1 OR2
R1 OR2
R1 R2 produkt wydajność (%) ee(%)
CH2Cl n-C8H17 (3R) 67 100
CH2Cl CH2CH3 (3S) - do 90
OBu-t CH2CH3 (3R) 75 97
Ph CH2CH3 (3S) - 100
Redukcja ą-podstawionych ketoestrów wiąże się dodatkowo z diastereoselekty-
wnością (powstają dwa centra chiralne). Także w tym wypadku udało się uzyskać wysokie
nadmiary enancjomeryczne i diastereomeryczne dzięki użyciu różnych podstawników
w pozycjach 2, 3 oraz przy grupie estrowej.
OH O
O O
R1 OR3
R1 OR3
R2
R2
R1 R2 R3 wydajność (%) ee(%) de(%)/konformer
CH3 CH3 CH2CH3 75 100 66 syn
CH3 CH2CH=CH2 CH2CH3 84 100 90 anti
CH3 CH3 n-C8H17 82 98 90 syn
CH2CH3 OH CH2CH3 72 >90 80 anti
Dla porównania redukcja ketonów do alkoholi w klasycznej preparatyce organicznej może
odbywać się na kilka sposobów. Główne z nich to:
a) Reakcje z wodorkami metali. Najczęściej używanymi związkami są LiAlH4
(glinowodorek litu) oraz NaBH4 (borowodorek sodu). Reakcja z użyciem LiAlH4 jest
dość ogólna - poza grupą karbonylową redukowane są także inne grupy obecne w
substracie np. NO2, CN, COOR itd. Borowodorek sodu jest bardziej selektywny i nie
redukuje grup takich jak NO2 czy halogenowych. DodatkowÄ… jego zaletÄ… jest
możliwość stosowania go w roztworach wodnych. Wodorki metali nie uwadarniają
podwójnych ani potrójnych wiązań węgiel  węgiel (za wyjątkiem wiązań C=C
sprzężonych z grupą COOR).
b) Redukcja z zastosowaniem wodoru gazowego i katalizatora (platyna, ruten, pallad,
nikiel itp.). To rozwiązanie obciążone jest najmniejszą selektywnością  w tych
warunkach zredukowane zostają także wiązania wielokrotne.
Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C
c) Reakcja z etanolanem sodu w alkoholu etylowym. Stosowana zanim odkryto LiAlH4,
częściej stosowana do redukcji estrów niż ketonów.
d) Reakcja z diborowodorem B2H6.
Opisane układy przez lata zyskały wiele modyfikacji. Ich najczęstszym celem było
uzyskanie chemoslektywności reakcji. Uzyskuje się ją dzieki stosowaniu różnych
warunków reakcji: kombinacji metal- jon wodorkowy, różnym katalizatorom
i rozpuszczalnikom3. Jednakże stosowane wodorki metali, jak i katalizatory metaliczne są
drogim i nie raz niewygodnym w pracy surowcem. Także praca z wodorem niesie za sobą
nibezpieczeństwo. Z tego względu drożdże piekarnicze w ostatnich latach nabierają
znaczenia na tym polu syntezy. Ich atrybutami sÄ… niska cena, niskie temperatury reakcji
(30-40oC), zastosowanie wody jako rozpuszczalnika, aspekt ekologiczny.
Daje to podstawy do zastosowania S. cerevisiae na poziomie przemysłowym. Jednym
z zastosowań drożdży jest chemo, regio i wysoce stereospecyficzna redukcja triketonu do
trimegestonu  leku podawanego w terapii chorób pomenopauzalnych.4
O
O
.
. (S)
.
.
S.cerevisiae
.
.
.
.
O
OH
sacharoza, EtOH, H2O
O
O
trimegeston
Ćwiczenie:
Eksperyment obejmuje redukcjÄ™ 2-metyloacetooctanu etylu prowadzÄ…cÄ… do mieszaniny
(2R,2S) i (2S,3S)-2-metylo-3-hydroksymaślanu etylu w stosunku izomerów 3:15.
OH O OH O
O O
S.cerevisiae
. OEt . OEt . OEt
+
CH3 CH3
CH3 30 st.C, 48 h, 65%, > 95% ee
3 : 1
Oczynniki:
2-metyloacetooctanu etylu 1.0g (7.7mmol)
drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae 30g
sacharoza 15g
woda destylowana 200ml
Celite®
Etanol
Octan etylu
MgSO4
3
March J.; Chemia Organiczna 1975 WNT Warszawa
4
Crocq V., Masson Ch., Winter J.,Richard Ch., Lemaitre G., Lenay J., Vivat M., Buendia J., Prat D.;Organic
Process Research & Development 1997, 1, 2-13
5
FrÄ…ter G., Müller U., Günter W, Roberts S.M.(ed.); Preparative Biotransformations. Whole Cells and Isolated
enzymes in Organic Synthesis, 1992, 2:1.1, Wiley, London.
Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C
Opis ćwiczenia:
Umieścić drożdże oraz wodę w kolbie stożkowej (500ml), a następnie zatkać
wylot kolby watą i umieścić w wytrząsarce (30oC) na około 20 minut w celu
zapoczÄ…tkowania fermentacji.
2-Metyloacetooctan etylu rozpuścić w 1ml etanolu i dodać jednorazowo do kolby
z fermentującymi drożdżami. Kontynuować mieszanie w wytrząsarce w temp.
300C przez 48h.
Po tym czasie sprawdza się przebieg reakcji metodą TLC. W tym celu należy
pobrać próbkę mieszaniny reakcyjnej (ok. 25  30 cm3) i zmieszać ją z celitem (2
 3 g). Otrzymaną mieszaninę przesączyć przez złoże mokrego celitu i przemyć
oddzielone drożdże octanem etylu (25 cm3). Uzyskane roztwory połączyć.
Doprowadzić odczyn przesączu do pH = 7 przy użyciu 2 molowego roztworu
NaOH i nasycić fazę wodna NaCl. Całość dokładnie wymieszać. Oddzielić fazę
organiczną na wirówce i zatężyć do objętości ok. 4  5 cm3. Jako układ
rozwijajÄ…cy stosuje siÄ™ mieszaninÄ™ eter naftowy - -eter dietylowy 3:1. PÅ‚ytki
wywołuje się poprzez rozpylenie na ich powierzchni anisaldehydu.
Rf substratu = 0.83
Rf produktu = 0.37
Jeżeli stopień przereagowania jest odpowiedni, reakcję należy przerywać
wyciągając kolbę z wytrząsarki i dodając 2 łyżki celitu. Tak przygotowaną
mieszaninę pozostawić na ok. 30min od czasu do czasu mieszając.
Nastepnie odsÄ…cza siÄ™ zawiesinÄ™ drożdży na lejku Büchnera poprzez zÅ‚oże celitu,
a żółty filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x150ml). Zlane ekstrakty
suszy siÄ™ bezwodnym siarczanem magnezu, przsÄ…cza na lejku z sÄ…czkiem
karbowanym, a przesącz odparowuje na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej
pozostałości produktu.
Surowy produkt oczyszczać metodą chromatografii kolumnowej. Jako
wypełnienie kolumny należy stosowac żel silikonowy a jako eluent układ benzyna
-eter dietylowy (3:1). Literaturowa wydajność wynosi 70% mieszaniny (2R,3S)- i
(2S,3S)-2-metylo-3-hydroksymaślanu etylu. Dla rozdziału tych diastereomerów
używane są techniki HPLC.
1.2 Redukcja podwójnego wiązania węgiel- węgiel
Redukcja wiązań typu C=C z użyciem drożdży jest istotną metodą syntezy chiralnych
wielofunkcyjnych syntonów. Po raz pierwszy drożdże do tego celu uzyto już w latach 30
zeszłego stulecia. Istotny wpływ w takim uwodornieniu ma otoczenie wiązania C=C  istotny
wpływ ma sąsiedztwo grupy karbonylowej lub wiązania podwójnego bez których to reakcja
nie zachodzi lub zachodzi ze słabymi wydajnościami. Badania przeprowadzone w latach 70
dowiodły stereoselektywności redukcji z użyciem S. cerevisiae. Także chemoselektywność
enzymów drożdżowych została niejednokrotnie potwierdzona. Poniżej przytoczono kilka
przykładów6 7:
6
Fuganti C., Griselli S.,Servi S., HQ
gberg, Roberts S.M. (ed.); Preparative Biotransformations. Whole Cells and
Isolated enzymes in Organic Synthesis, 1992, 2:7.1, Wiley, London.
7
Dumanski P.G., Florey P., Knetting M., Smallridge A.J.; J.Molec.Catal. B: Enzymatic 2001, 11, 905-908.
Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C
. .
. .
S.cerevisiae
(R)
eter naftowy
O O
76%
(CH2)7CO2Me
(CH2)7CO2Me
S.cerevisiae
Me(CH2)4
Me(CH2)4
O
O
74%
R
R
S.cerevisiae
H
NO2
H3C NO2
H CH3
R=H, Cl, Br, NO2 50% 89-98% ee
Redukcję wiązań C=C można rónież osiągnąć poprzez redukcję katalizowaną
np. metalami grup przejściowych lub ich tlenkami (Ni Raneya, Pt2O, Pd, itd.) z użyciem
gazowego wodoru. Istnieją także metody stosujące np. układy cynk i kwas, sód w etanolu,
hydrazynę lub lit i aminę alifatyczną. Zwykle można przeprowadzić tymi metodami
selektywną redukcję wiązań C=C (bez naruszenia innych obecnych w substratach grup
(np. COOH, CHO, CN, itp.) jednakże wymaga to zastosowania warunków i substratów
redukujÄ…cych charakterystycznych dla danego zwiÄ…zku3.
Ćwiczenie:
Celem ćwiczenia jest redukcja Ä…-metylo-²-(2-furylo)akroleiny . Jako produkt otrzymuje siÄ™
nasycony alkohol. Mechanizm tej reakcji jest trójetapowy : redukcja  utlenianie  redukcja.
Wyjściowy aldehyd pozostaje w równowadze z pochodną alkoholu allilowego, przy czym
równowaga jest przesunięta w stronę alkoholu. Jednakże już małe (równowagowe) ilości
Ä…-metylo-²-(2-furylo)akroleiny ulegajÄ… powolnej trans-addycji wodoru w poprzek wiÄ…zania
podwójnego, do nasyconego aldehydu. Nasycony aldehyd jest wówczas szybko redukowany
do nasyconego alkoholu.
+
. .
[H ]
OH
[Ox]
CHO
O O
szybko
poprzez utlenianie
powoli
in situ do nienasyconego aldehydu.
. .
szybko
OH
CHO
O
O
72%, > 98% ee
Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C
Odczynniki:
Ä…-metylo-²-(2-furylo)akroleina 1.36g, (0.01mola)
drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae 25g
glukoza 10.4g
woda destylowana 200ml
Celite®
Etanol
Octan etylu
MgSO4 bezw.
nasycony r-r węglanu sodu
2M kwas solny
Opis ćwiczenia:
Umieścić drożdże, glukozę i wodę w zlewce (1000ml). Delikatnie mieszać
w ciepłej łaz
ni wodnej (25-30 oC) przez ok. 1 godzinÄ™.
pH fermentującej mieszaniny powinno być następnie podniesione z 4 do ok. 5.5
poprzez dodanie nasyconego r-ru węglanu sodu (ok.3-6 ml).
Do tak przygotowanej mieszaniny należy dodać roztwór wyjściowego aldehydu
w etanolu (2ml) i delikatnie mieszać w temperaturze pokojowej. Operację należy
wykonywać pod wyciągiem.
Co 12  15 godzin należy sprawdzać pH mieszaniny. Ewentualnie w celu
obniżenia pH do wartości ok. 5 posłużyć się roztworem kwasu solnego.
Po tym czasie należy skontrolować skład mieszaniny metodą TLC. Próbkę
przygotować wg procedury z poprzedniej syntezy. Jako układ rozwijający stosuje
się chlorek metylenu. Płytki wywołuje się pod lampą UV przy długości fali
254nm. Ponieważ aldehyd szybko przechodzi w nienasycony alkohol, na płytce
przy Rf=0.38 mogą być widoczne 2 plamy w kształcie ósemki (nasycony i
nienasycony alkohol). Świadczy to o niecałkowitym przereagowaniu substratu.
Jeżeli obecna jest tylko 1 plamka przy Rf=0.34  pochodząca od produktu, można
uznać całkowite przereagowanie.
Jeżeli stopień przereagowania jest zadowalający, należy przerwać reakcję
dodając dwie łyżki celitu. Mieszaninę pozostawić na ok. 30 min od czasu do czasu
mieszając. Następnie odsączyć zawiesinę na lejku ze spiekiem, poprzez złoże
celitu, pod zmniejszonym ciśnieniem. Klarowny, żółty filtrat poddaje się ekstrakcji
octanem etylu (4 x 200ml). Zlane ekstrakty octanowe suszy siÄ™ bezwodnym
siarczanem magnezu a następnie przesącza na lejku z sączkiem karbowanym.
Przesącz odparowuje się na wyparce rotacyjnej (T = 30 oC), do uzyskania żółtego
oleistego produktu. Produkt można oczyszczać metodą chromatografii
kolumnowej, używając jako eluenta chlorku metylenu. Uzyskuje się (S)-3-(2-
furylo)-2-metylo-1-propanol z literaturową wydajnością 49%.
Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C
Przygotowanie do zajęć:
1.Dokładne przeczytanie instrukcji, zapoznanie się z technikami laboratoryjnymi używanymi
podczas opisanych ćwiczeń.
2.Przypomnienie pojęć związanych z katalizą enzymatyczną, redukcją związków
zawierających grupy karbonylowe i wiąznia C=C, selektywnością tych reakcji.
3.Porównanie metod enzymatycznych z klasycznymi. Wady i zalety.
Warunki zaliczenia:
1.Pozytywny wynik kartkówki;
2.Przeprowadzenie eksperymentalnej części ćwiczenia
3.Oddanie sprawozdania (wg. wskazówek prowadzącego) w terminie do 2 tygodni.