PRACE POGL
DOWE  REViEW PAPERS
Roman WACHOWIAK
Ocena toksykoIogiczna metod
diagnostycznych stosowanych w zatruciach
środkami psychoaktywnymi
ToxicoIogicaI evaIuation of diagnostic methods used in
intoxication with psychoactive substances
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej
Diagnostyka toksykoIogiczna przy- ToxicoIogicaI diagnosis in cases of
Akademii Medycznej im. K. Marcinkowskiego
padków zatruć związkami psychoak- intoxication with psychoactive sub-
w Poznaniu
tywnymi, notowanymi w toksykoIogii stances known in cIinicaI and foren-
Kierownik:
kIinicznej i sÄ…dowej wymaga odpo- sic toxicoIogy requires appropriate
Prof. dr hab. med. Zygmunt Przybylski
wiednich badań Iaboratoryjnych. Pra- Iaboratory studies. The paper pertains
ca dotyczy oceny aktuaInie używanych evaIuation of the currentIy empIoyed
metod anaIizy jakościowo-iIościowej techniques of quantitative and quaIi-
Dodatkowe słowa kIuczowe:
metody analityczne badanych związków psychoaktywnych tative anaIysis of psychoactive sub-
analiza związków psychoaktywnych stances in a bioIogicaI materiaI. Use-
w materiaIe bioIogicznym. Przydatność
zatrucia
najczęściej stosowanych metod skri- fuIness of the most frequentIy appIied
oceny
ningowych (immunochemicznych) i screening (immunochemicaI) ap-
potwierdzajÄ…cych (fizykochemicznych) proaches and the confirmation (physi-
AdditionaI key words:
oceniono w aspekcie kryteriów waIi- cochemicaI) techniques was evaIuated
analytical techniques
dacyjnych, dotyczÄ…cych specyficzno- against the vaIidation criteria, reIating
psychoactive drug testing
ści Iimitu detekcji i oznaczaIności. to the specificity, detection Iimit and
intoxication
sensitivity of the discussed sub-
evaluation
stances.
Wprowadzenie w sposób obiektywny mogły wykazać zależ-
Diagnostyka toksykologiczna przypad- noS
ć pomiędzy poziomem leku w osoczu, a
ków zatruć S
miertelnych, obok monitoringu efektem notowanych oddziaływań toksyko-
kontrolowanej terapii przedawkowania le- dynamicznych. PowszechnoS
ć stosowania
ków (overdose drug monitoring) odgrywa szybkich i wiarygodnych metod analizy ja-
aktualnie ważną rolę w nowoczesnej toksy- koS
ciowo-iloS
ciowej ksenobiotyków w pły-
kologii klinicznej i sądowej. Zapotrzebowa- nach ustrojowych jest uzależniona od po-
nie na tego typu badania ciągle wzrasta, stępu technicznego, który w ostatnim okre-
bowiem są ono determinowane częstotliwo- sie jest wyrax
nie zauważalny. Koszty zwią-
S
cią zatruć związanych z systematycznym zane z zakupem odpowiedniego wyposaże-
nadużywaniem leków, w tym S
rodków psy- nia aparaturowego i niezbędnych odczyn-
choaktywnych. Motywacja i celowoS
ć ozna- ników, przy obecnych możliwoS
ciach finan-
czania poziomów leków i ich metabolitów w sowych wskazują na zasadnoS
ć centraliza-
płynach ustrojowych w przypadku zatruć cji usług diagnostycznych ułatwiających
stanowi podstawę racjonalnego działania szybkie, kompleksowe badanie.
terapeutycznego, a szczególnie detoksyka- Aktualnie istnieje zwiększone zapotrze-
cyjnego. KoniecznoS
ć okreS
lenia poziomu bowanie w zakresie toksykologicznych ba-
ksenobiotyku w płynach ustrojowych i tkan- dań diagnostycznych, klinicznych, jak i są-
kach ma szczególne znaczenie w toksyko- dowych, wynikające z potencjalnego zagro-
logii sądowej, bowiem wielokrotnie w spo- żenia związanego z dystrybucją i naduży-
sób obiektywny pozwala ustalić przyczynę i waniem leków psychoaktywnych i realizacji
mechanizm zgonu. Szczególne zapotrzebo- założeń Ustawy o zapobieganiu narkoma-
wanie diagnostyczne dotyczy również inter- nii. Potwierdzeniem tych obserwacji jest
pretacji wielu przypadków medyczno-sądo- wzrost doniesień kazuistycznych, dotyczą-
wych czy klinicznych, okreS
lonych jako trud- cych ostrych zatruć i zgonów.
ne, z racji m.in. nieprzytomnego stanu pa- MajÄ…c na uwadze koniecznoS
ć wykony-
cjenta, przy braku jakichkolwiek informacji wania odpowiednich badań diagnostycz-
dotyczÄ…cych okolicznoS
ci zdarzenia. Ko- nych, niezbędnych w kompleksowej moni-
niecznoS
ć indywidualizacji w odniesieniu do torowanej terapii zatruć, przedstawiono tren-
poszczególnych stanów zatruć pacjentów dy i możliwoS
ci analityczne, warunkujÄ…ce
leczonych w oddziałach toksykologii klinicz- obiektywną interpretację istniejących zależ-
nej, wymaga specjalistycznych oznaczeń noS
ci, w aspekcie wybranych związków psy-
Adres do korespondencji:
poziomów leków w osoczu z częstotliwoS
ciÄ… choaktywnych.
Prof. dr hab. farm. Roman Wachowiak
adekwatną do istniejących zagrożeń, wyni-
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej
kających z obserwacji klinicznych. Propo- Wyniki badań diagnostycznych
Akademii Medycznej
nowane metody analityczne, przeznaczone a uwarunkowania interpretacyjne
ul. R
więcickiego 6, 60-781 Poznań, POLAND
do rutynowych oznaczeń, powinny być wy- W rozważaniach dotyczących używania
Tel./Fax: [phone] w. 551
starczająco czułe, bardzo selektywne, aby S
rodków psychoaktywnych (odurzających,
e-mail: [e-mail]
PrzeglÄ…d Lekarski 2001 / 58 / 4 215
narkotycznych), należy uwzględnić cztery
dominujące grupy związków chemicznych
wykazujących efekt oddziaływań na oS
rod-
kowy układ nerwowy. Wskazać tutaj należy
na następujące grupy związków:
" narkotyczne związki przeciwbólowe
(morfina, heroina, kodeina) i syntetyczne
analogi, np. (metadon, dolargan);
" związki działające depresyjnie na
oS
rodkowy układ nerwowy (barbiturany, ben-
zodiazepiny, tricykliczne antydepresanty,
kwas gamma hydroksymasłowy [GHB]);
" psychostymulanty (amfetamina, ko-
kaina, efedryna, kofeina);
" zwiÄ…zki halucynogenne (LSD, me-
skalina, ecstasy, psylocybina, kwas ibote-
nowy).
Powyższy podział systemowy S
rodków
psychoaktywnych został rozbudowany w
oparciu o raport Komitetu Ekspertów WHO.
Wyróżniono w nim 8 grup związków, które
w aspekcie oddziaływań farmakologicznych
mieszczÄ… siÄ™ w wymienionym wykazie czte-
rogrupowym. Wysoka aktywnoS
ć farmako-
logiczna S
rodków psychoaktywnych, deter-
minowana niskimi dawkami ich zażywania,
przy równoczeS
nie niekorzystnym współ-
czynniku terapeutycznym (rozpiętoS
ć mię-
dzy dawkÄ… leczniczÄ… a S
miertelnÄ…), stwarza
Rycina 1
trudny układ analityczny, związany z wyjąt-
Metody i zakresy najczęściej notowanych oznaczaIności związków psychoaktywnych w płynach ustrojowych.
kowo niskimi zakresami stężeń w płynach
Methods and ranges of detection for psychoactive drugs in body fluids.
ustrojowych (10-6-10-12 g/ml). Zakresy ozna-
czalnoS
ci uzyskane najczęS
ciej stosowany-
chemicznymi wymaga zawsze dodatkowo
stego i jego aktywnego metabolitu we krwi
mi metodami przedstawiono na rycinie 1.
potwierdzenia innymi metodami fizykoche-
przy ich zróżnicowanych parametrach far-
W ocenie zależnoS
ci przyczynowo-skut-
micznymi.
makokinetycznych (szybkoS
ć eliminacji,
kowej, obowiązujące międzynarodowe nor-
Diagnostyka toksykologiczna zatruć
czas biologicznego półtrwania, klirens), po-
my interpretacyjne zakresów stężeń tera-
S
rodkami psychoaktywnymi opiera siÄ™
zwala wyjaS
nić nietypowy przebieg klinicz-
peutycznych, toksycznych i S
miertelnych,
przede wszystkim na analizie chemicznej
ny zatrucia. Krytyczna ocena powinna do-
dotyczą wyłącznie krwi, jako bardziej stabil-
materiału biologicznego (krew, mocz, S
lina,
tyczyć zawsze wyników badań uzyskanych
nego objętoS
ciowo układu odniesienia w
włosy) - zatrucia kliniczne, poszerzone do-
niespecyficznymi metodami, np. metody
porównaniu z moczem. Poziomy stężeń
datkowo o tkanki (zatrucia S
miertelne). Sze-
immunochemiczne mogą być sumą oddzia-
najczęS
ciej notowanych S
rodków psychoak-
reg uwarunkowań sprawia, że mocz okazu-
ływań interferujących pochodnych o podob-
tywnych oraz okresy ich biologicznego pół-
je się ważnym materiałem biologicznym
nym układzie strukturalnym, (reaktywnoS
ć
trwania w organizmie człowieka, są dostęp-
przydatnym w diagnostyce toksykologicznej
krzyżowa  cross-reactivity). Z tego też
ne w wielu monografiach [4,8,9,13,26], czy
[8,28].
względu dla danego testu oznaczanych kse-
programach np. TOXINET (Internet), czy
WiększoS
ć dostępnych skriningowych
nobiotyków uwzględnia się reaktywnoS
ć
MICROMEDEX (INFO TECHNOLOGY Sup-
metod diagnostycznych S
rodków psychoak-
krzyżową, która okreS
la iloS
ć wybranego
plied Ltd.).
tywnych dotyczy więc ich analizy w moczu
związku interferującego, wywołującego w
Ważnym elementem niezbędnym w
[DAU-test  Drug of abuse urine]. Za uży-
układzie analitycznym taką samą wartoS
ć
kompleksowej ocenie analizowanych zależ-
ciem moczu jako preferencyjnego materia-
parametru pomiarowego (absorbancja), jak
noS
ci toksykodynamicznych ksenobiotyku
Å‚u biologicznego przemawia szereg uwarun-
wybrane stężenie odpowiedniego wzorca,
jest koniecznoS
ć uwzględnienia (udziału)
kowań, wS
ród których można wymienić:
np. 100 mg/ml nordiazepamu w teS
cie na
metabolitów  produktów ich biochemicz-
" dłuższy czas przebywania ksenobio-
obecnoS
ć benzodiazepin. Uzyskany więc
nych przekształceń. Metabolity, obok związ-
tyków w moczu aniżeli we krwi, stężenie we
pozytywny wynik badań immunochemicz-
ków macierzystych, mogą interferować za-
krwi jest ograniczone czasem półtrwania
nych, przy braku informacji o innych zaży-
równo w zakresie oddziaływań toksykody-
(t1/2);
wanych lekach przez pacjenta, wymaga
namicznych, jak również uzyskiwanego wy-
" wyższe poziomy stężeń w moczu w
odpowiedniej interpretacji o istniejÄ…cych za-
niku badań analitycznych. Klasyczny przy-
porównaniu z krwią (LSD jest typowym przy-
kłóceniach z możliwoS
ciÄ… wystÄ…pienia wy-
kład synergistycznego oddziaływania karba-
kładem);
niku fałszywie pozytywnego. Przykładowo
mazepiny i jej aktywnego metabolitu 10,11-
" nieinwazyjny sposób pobierania pró-
fałszywie pozytywny wynik badań,  potwier-
epoksydu, czy oddziaływań nordiazepamu,
bek moczu do badań.
dzajÄ…cy obecnoS
ć tricyklicznych antyde-
metabolitu jego prekursorów klorazepatu,
W ostatnich latach zwrócono uwagę na
presantów jest często obserwowany dla
diazepamu, chlorodiazepoksydu, jest po-
możliwoS
ć wykorzystania włosów osoby
przypadków zatruć wyłącznie karbamaze-
wszechnie znany [8,9,13,29]. WÅ‚aS
ciwa in-
podejrzanej o dłuższe nadużywanie leków,
piną podczas jej równoczesnej analizy
terpretacja istniejących oddziaływań toksy-
w tym narkotyków jako właS
ciwego mate-
metodÄ… TDx.
kodynamicznych dla tych układów jest moż-
riału dowodowego. Badania lat 90-tych
Z tego też względu handlowa propozy-
liwa po uprzedniej selektywnej identyfikacji
wskazują jednoznacznie, że większoS
ć nad-
cja wielu producentów zestawów analitycz-
i różnicującej analizie iloS
ciowej poszczegól-
używanych związków psychoaktywnych,
nych ostrzega i okreS
la prawdopodobień-
nych komponentów zawartych w płynach
takich jak kokaina, heroina, amfetamina,
stwo występowania reaktywnoS
ci krzyżowej
ustrojowych. Wyniki badań laboratoryjnych
metadon, mogą być wykryte i oznaczone ilo-
wskazujÄ…c na ich ograniczonÄ… pewnoS
ć i
uzyskane niespecyficznymi i tym samym
S
ciowo we włosach [14]. Kontrola przestrze-
skutecznoS
ć analityczną. Powyższe niedo-
niewłaS
ciwymi metodami analitycznymi nie
gania okresu abstynencji w czasie leczenia
godnoS
ci sprawiają, że pozytywny test ba-
pozwalajÄ… na obiektywnÄ… interpretacjÄ™ ob-
odwykowego, czy też jej dorax
ne przepro-
dań jakoS
ciowych, a nawet iloS
ciowych, uzy-
jawów klinicznych. MożliwoS
ć równoczesne-
wadzenie w przypadku podejrzeń o zaży-
skany metodami homogenicznymi-immuno-
go okreS
lenia poziomów związku macierzy-
216 PrzeglÄ…d Lekarski 2001 / 58 / 4 R. Wachowiak
wanie S
rodka psychoaktywnego jest deter- nym skriningu toksykologicznym S
rodków (solid phase enzyme immunoassay).
minowana okresem biologicznego półtrwa- psychoaktywnych spowodowało wprowa- Zasada metody EMIT proponowanej
nia, tj. czasokresem przebywania związków dzenie przez firmę Merck zestawów anali- przez SYVA CORPORATION oparta jest na
narkotycznych w płynach ustrojowych. Za- tycznych TRIAGE. Zaproponowany system fakcie hamowania aktywnoS
ci enzymu w
bezpieczenie więc najczęS
ciej spotykanego pozwala dokonać szybkiej zróżnicowanej układzie konkurencyjnego wiązania przeciw-
materiału (krew, mocz) po okresie ukończo- analizy jakoS
ciowej moczu, w kierunku sied- ciała, np. wolnego leku zawartego w prób-
nej eliminacji narkotyku z organizmu nie miu (TM-7) czy oS
miu (TM-8) podstawowych ce z lekiem znakowanym enzymem. Wolny
pozwala na obiektywnÄ… ocenÄ™ potwierdza- grup S
rodków psychoaktywnych  Metadon lek konkuruje z lekiem znakowanym enzy-
jącą zażycie, czy też uzależnienie. (MTD), benzodiazepiny (BZO), kokaina mem o połączenia z przeciwciałami a ak-
(COC), amfetamina (AMT), kannabinole tywnoS
ć enzymu jest wprost proporcjonal-
Homogeniczne metody anaIityczne (THC), alkaloidy grupy opium (OPI), barbi- ne do iloS
ci wolnego leku w próbce. Aktyw-
stosowne w diagnostyce zatruć turany (BAR) i tricykliczne antydepresanty noS
ć enzymu nie związanego z przeciwcia-
Najbardziej przydatnymi metodami ana- (TCA). łami (najczęS
ciej bakteryjna dehydrogena-
lizy jakoS
ciowo-iloS
ciowej ksenobiotyków, Istotą działania testu jest konkurencyj- za glukozo-6 fosforanowa) mierzona reduk-
stosowanymi w laboratoriach toksykologii na reakcja zwiÄ…zku psychoaktywnego za- cjÄ… substratu NADP do NADPH jest deter-
klinicznej i sÄ…dowej (szybki skrining), sÄ… te wartego w moczu z jego chemicznie znako- minowana poS
rednio stężeniem oznaczane-
które nie wymagają odrębnych technik izo- wanym połączeniem z koloidalnym złotem go leku Ab=f (c) stężenie przy  = 340 nm.
lacji z materiału biologicznego (krew, mocz, (koningat) o okreS
lonÄ… liczbÄ™ miejsc prze- Druga metoda homogeniczno-immunolo-
S
lina). Stosowane w tym względzie metody ciwciała umieszczonego na pasku membra- giczno-fluorescencyjno-polaryzacyjna
homogeniczne oparte są przede wszystkim nowym w tzw. strefie testowej płytki. W koń- (FPIA) pozwala na okreS
lenie poziomów
na badaniach immunochemicznych. Możli- cowym etapie pomiaru trwającym ok. 3-8 wybranych związków w osoczu, surowicy
woS
ć wytwarzania przeciwciał dowolnych minut barwny prążek w strefie testowej jest czy moczu. W układzie analitycznym wystę-
leków w organizmie żywym spowodowała obserwowany wówczas, gdy w badanym puje przeciwciało przeciw związkowi ozna-
istotny postęp w badaniach jakoS
ciowo-ilo- moczu nie występuje poszukiwany kseno- czonemu, związek oznaczony połączony z
S
ciowych ksenobiotyków, a szczególnie biotyk (próba ujemna). Brak prążka barw- barwnikiem fluorescencyjnym (znakowany
S
rodków psychoaktywnych. Standardowy nego w strefie testowej potwierdza obecnoS
ć hapten), próbka badana, w której oznaczo-
proces otrzymywania trwałych połączeń ksenobiotyku w próbie badanej (wynik do- ny jest związek (nieznakowany hapten w
chemicznych lek-białko, opiera się na wy- datni). roztworze buforu rozcieńczonego). W te-
korzystaniu reaktywnych grup (karboksyko- W rutynowych badaniach skriningo- stach FPIA mierzona jest emisja S
wiatła spo-
wych, aminowych, tiolowych, hydroksylo- wych, obok systemu TRIAGE, używane są laryzowanego po uprzedniej kompetycyjnej
wych), które z wybranym lekiem tworzą bardzo często jednostopniowe testy immu- reakcji znakowanego i nieznakowanego
czynny zwiÄ…zek immunologiczny  wysoko- nochemiczne ukierunkowane na danÄ… gru- haptenu o miejsca wiÄ…zania w przeciwcia-
cząsteczkowy hapten (immunogenic conju- pę związków psychoaktywnych. Na rynku łach. Automatyczny układ rejestrujący okre-
gate). Przykładowo, produkt połączenia biał- dominują testy firm HUMAN, HYDREX, IN- S
la stopień depolaryzacji S
wiatła, który jest
ka z morfiną następuje poprzez grupy hy- TIMEX, SYVA BEHRING. odwrotnie proporcjonalny do wielkoS
ci czÄ…-
droksylowe przy C-3 i C-6 lub heterocyklicz- Ostatnia pozycja firmy SYVA BEHRING steczek rotujących. Stopień depolaryzacji
ny atom azotu tworzÄ…c hapten o ukierunko- i Roche Diagnostic dotyczy jednostopniowe- promieniowania fluoroscencyjnego jest
wanej zdolnoS
ci wytwarzania przeciwciał w go testera kasetowego (SYVA-RADIO wprost proporcjonalny do stężenia leku w
odniesieniu do morfiny, kodeiny czy teba- TEST), kubkowego (SYVA-RAPID) oraz próbce biologicznej. Metoda ta jest całko-
iny. Podanie haptenu drogą parenteralną ONTRAK TESTSTIK czy ONTRAK Test cup- wicie zautomatyzowana i z tego względu
zwierzętom doS
wiadczalnym stymuluje wy- 5, pozwalającego na równoczesną identyfi- częS
ciej stosowana w porównaniu z inny-
tworzenie wysoce specyficznych przeciwciał kację pochodnych siedmiu lub pięciu grup mi. Obie metody charakteryzują się wyso-
monoklonalnych, które po odpowiednim S
rodków psychoaktywnych (amfetaminy, ką oznaczalnoS
ciÄ… i dyskusyjnÄ… specyficz-
mianowaniu mogą być wykorzystane w ana- barbiturany, benzodiazepiny, kannabinole, noS
cią nie pozwalającą ustalić udziału po-
lizie jakoS
ciowo-iloS
ciowej danego ksenobio- kokaina, metamfetamina, opiaty, fencyklidy- szczególnych pochodnych tworzących daną
tyku [25]. na oraz tricykliczne antydepresanty). grupę. Przykładowo wszystkie pochodne
benzodiazepiny sÄ… mniej lub bardziej czyn-
Jakościowa i półiIościowa ocena Metody immunochemiczne ne w teS
cie immunologicznym, a uzyskiwa-
toksykoIogiczna stosowane w anaIizie iIościowej ny wynik badania jest sumą oddziaływań w
Istotnym postępem w szybkim skrinin- związków psychoaktywnych przeliczeniu na wybraną pochodną tzw. ka-
gu toksykologicznym S
rodków psychoaktyw- Konsekwencją rozszerzenia zakresu libratora, np. nordiazepamu. W układzie
nych jest użycie czułych testów płytkowych, użycia jakoS
ciowych metod immunoche- oddziaływań interferencyjnych nie rzadko
których rozwój chronologicznie zapoczątko- micznych było ich przystosowanie dla ce- może wystąpić interakcja zakłócająca przez
wał Abuscreen ONTRAKT firmy Roche Dia- lów analiz iloS
ciowej. Metody immunoche- innÄ… strukturalnie grupÄ™ chemicznÄ… zwiÄ…z-
gnostics (test aglutynacyjny) [2]. Zasada miczne należą obecnie do najczęS
ciej sto- ków.
oznaczania testem ONTRAKT sprowadza sowanych technik homogenicznych i nie
się do potwierdzenia, względnie wyklucze- wymagających wstępnej izolacji moczu czy Metody heterogeniczne
nia aglutynacji układu konkurencyjnej reak- osocza. Mniejsze zainteresowanie dotyczy potwierdzające skriningowe wyniki
cji ksenobiotyku zawartego w badanym metod radioimmunologicznych (RIA) i radio- badań immunochemicznych
materiale (mocz) i osadzonym na tzw. LA- receptorowych (RRA), które obok koniecz- Zastosowanie metod potwierdzających
TEXIE z przeciwciałami przeciw oznacza- noS
ci etapu rozdziału (metody heterogenicz- (confirmation) jest bardziej czasochłonne i
nemu związkowi. Użycie testu ONTRAKT ne) wymagają wzorca związku znakowane- wymaga zawsze zastosowania wstępnej
wymaga zakupu odpowiednich zestawów go izotopem oraz odpowiedniego wyposa- izolacji z materiału biologicznego. WartoS
ć
np. dla wybranych grup związków psycho- żenia z racji użycia izotopów promieniotwór- użytkowa nowoczesnych metod analizy ja-
aktywnych. WykrywalnoS
ć poszczególnych czych. koS
ciowo-iloS
ciowej ksenobiotyków w ma-
ksenobiotyków w materiale biologicznym Powszechnie stosuje się dwie metody teriale biologicznym zależy więc przede
jest zróżnicowana, a o jej wymiarze decy- homogeniczne, tj. enzymatyczno-immuno- wszystkim od wydajnoS
ci stosowanych me-
duje wartoS
ć stężenia progowego (cutoff), logiczną (Enzyme-Multiplied Immunoasay tod izolacji. WS
ród preferowanych technik
powyżej którego odczyt należy uznać za Technique  EMIT-SYVA) oraz immunolo- izolacji należy wymienić klasyczną ekstrak-
pozytywny. Progowe wartoS
ci stężenia  cut- giczną metodę fluoroscencyjno-polaryzacyj- cję typu ciecz/ciecz oraz znacznie szybszą
off dla wybranych oznaczeń grup związków ną  FPIA, TDx firmy ABBOT. Mniejsze za- i bardziej wydajną z użyciem fazy stałej (so-
w odniesieniu do wybranej substancji kali- stosowanie znajduje heterogeniczna tech- lid phase extraction  SPE) [1,22]. Wydaj-
bracyjnych oscylujÄ… w zakresie 25-1000 ng/ nika immunoenzymatyczna ELISA (enzyme- ny proces izolacji klasycznej ksenobiotyku
ml. linked-immunosorbent assays) w układzie z osocza czy moczu, po uprzednim jego
Istotny postęp w szybkim zróżnicowa- analitycznym enzymu osadzonego na fazie uwolnieniu z połączeń białka czy koniugatu
PrzeglÄ…d Lekarski 2001 / 58 / 4 217
II-ej fazy metabolizacji enzymatycznej, może sykologicznych stosuje się korekcje para- żonego stosunkiem intensywnoS
ci wybrane-
być osiągnięty wyłącznie w warunkach wła- metrów identyfikacyjnych dla najczęS
ciej go z widma jonu w odniesieniu do intensyw-
S
ciwego doboru pH, uwarunkowanego cha- stosowanych metod chromatograficznych. noS
ci okreS
lonego jonu pochodnej determi-
rakterem kwasowo-zasadowego analitu. Zastąpienie przez Kovats a [15] parametru nowanej, dodanej w stałym stężeniu do roz-
ZnajomoS
ć wartoS
ci pka ksenobiotyku (war- czasu retencji stabilnym układem odniesie- tworów wzorcowych.
toS
ć pH, przy którym 50% związku znajduje nia  indeksem retencji, dało początek no- Niezastąpioną metodą stosowaną w tok-
się w postaci zjonizowanej) jest w tym przy- wym technikom identyfikacji związków pro- sykologii sądowej i klinicznej jest chromato-
padku najważniejszym parametrem odnie- ponowanym przez Mofota i współpracowni- grafia gazowa z możliwoS
cią użycia innych
sienia. Przykładowo izolacja amfetaminy ków [1,19,20]. Podobne zasady systema- detektorów aniżeli masowy. Zastosowanie
(pka 9.9) wymaga S
rodowiska o pH powy- tycznej analizy identyfikacyjnej, opartej na układu GLC z odpowiednim detektorem
żej 11, przy którym 100% jej postaci będzie bazie indeksów retencji, zaproponowano dla (ECD, NPD, AFID, FID, TCD) pozwala re-
wolną zasadą podatną do ekstrakcji roz- metody chromatografii cieczowej HPLC gulować nie tylko oznaczalnoS
ć ksenobio-
puszczalnikami organicznymi. [3,5,12,17]. Chromatografia cieczowa nale- tyków, ale również zapewnia eliminację
Efektywny, a zarazem uproszczony i ży aktualnie do najbardziej przydatnych i możliwych wpływów interferujących, np.
szybki proces izolacji ksenobiotyków z oso- efektywnych metod analizy jakoS
ciowo-ilo- pochodzących od użytego rozpuszczalnika.
cza, można uzyskać wykorzystując depro- S
ciowej ksenobiotyków w materiale biolo- RóżnorodnoS
ć rozwiązań technicznych,
tonizujące właS
ciwoS
ci acetonitrylu w ukła- gicznym. Jej zastosowanie dla celów iden- możliwoS
ć wyboru odpowiednich technik
dzie 1:1. Oddzielony supernatat od precy- tyfikacyjnych znacznie wzrosło po wprowa- analitycznych, analiza ksenobiotyków jako
pitatu białkowego, po uprzednim wyparowa- dzeniu nowej techniki detekcji typu DIODE- pochodnych sililowych, acetylowych, alkilo-
niu i odpowiednim rozcieńczeniu, umożliwia ARRAY. Zastosowanie tego typu detekcji wych, estrowych, eliminacja tła interferują-
szybką analizę w układach analitycznych pozwala uzyskać obok sygnału piku dane- cych zanieczyszczeń, predystynują chroma-
(HPLC, GC). Znacznie przyspieszonÄ… pro- go zwiÄ…zku na chromatogramie jego widmo tografiÄ™ gazowÄ… do podstawowych metod
cedurÄ™ izolacji S
rodków psychoaktywnych UV (200-350 nm) w układzie trójwymiaro- badawczych stosowanych w toksykologii
z materiału biologicznego zapewnia ekstrak- wym, potwierdzającą jego jednorodnoS
ć. Ta [1,9,10,20].
cja z użyciem faz stałych. Dyskutowane fazy właS
ciwoS
ć detektora DIODE-ARRAY pod- W rutynowych badaniach toksykologicz-
są zmodyfikowanymi chemicznie postacia- nosi znacząco możliwoS
ci identyfikacji nych zastosowanie znajdują również inne
mi żelu krzemionkowego (zawierają m.in. związków [6,11,16,18,23,24]. programy systematycznej analizy ksenobio-
podstawione łańcuchy węglowodorów C8, Komputerowe sterowanie układu HPLC tyków, wS
ród których wymienić można sys-
C18 ), często z dodatkowymi podstawnika- zawierającego dodatkowo bank widm w tem Remedi-HS (Bio-Rad Laboratories,
mi odpowiedzialnymi za polarnoS
ć adsor- nadfiolecie, umożliwia szybką identyfikację Hercules CA US). Program Remedi-HS
benta. Używane najczęS
ciej w krajowych dowolne zarejestrowanego piku badanego oparty jest na zasadach chromatografii cie-
laboratoriach fazy stałe są produkowane związku. Aktualnie istnieją gotowe progra- czowej (HPLC) i detekcji UV. System Re-
przez firmy J.T. Baker, Supelco, Varian, z my komputerowe pozwalające na podsta- medi-HS umożliwia szybką analizę ok. 500
ukierunkowanym przeznaczeniem do izola- wie banku widm (library search) dokonać leków i ich metabolitów w układzie wielo-
cji zróżnicowanych chemicznie grup S
rod- identyfikacji związku ujętego w rejestrze punktowego pomiaru UV (multiwavelenght
ków psychotropowych. KoniecznoS
ć uzyski- danych. WS
ród dostępnych programów ultraviolet detection). Niezależnie od ukła-
wania wyniku badań w możliwie jak najkrót- uwagę zwraca propozycja handlowa firmy dów sprzężonych w analizie metodą HPLC
szym czasie sprawia, że aktualne trendy i Hewlett Packard  aktualny dystrybutor w wykorzystuje się zróżnicowaną zdolnoS
ć
zapotrzebowania lansujÄ… szybkie metody Polsce - AGILENT TECHNOLOGY, dotyczÄ…- detekcji, m.in. (UV, fluorescencyjnej, elek-
izolacji głównie z użyciem faz stałych nie ca programu obejmującego identyfikację trochemicznej), której użycie jest determi-
wymagających wstępnych etapów przygo- ponad 1600 związków (głównie leków i ich nowane strukturalnymi uwarunkowaniami
towawczych (kondycjonowanie, aktywacja). metabolitów oraz pestycydów i innych), w badanych związków [23]. Najnowszym roz-
Powyższe oczekiwania spełnia propozycja układzie 12-blokowego podziału (sublibra- wiązaniem analitycznym jest zastosowanie
firmy Varian dotyczą użycia fazy stałej Ab- ries). Niezastąpioną metodę identyfikacji i chromatografii cieczowej z spektrometrią
selut Nexus. Procedura wykonawcza szyb- analizy iloS
ciowej związków psychoaktyw- masową LC/MS. Osiągi detekcji dla ozna-
kiej izolacji z wysokÄ… wydajnoS
cią w zakre- nych jest metoda chromatografii gazowej i czeń wielu związków w tym układzie są niż-
sie 80-100% sprowadza się do trzyetapo- spektrofotometrii masowej (GC/MS) z rów- sze aniżeli uzyskane w systemie GC/MS i
wego prostego postępowania w kolejnoS
ci: noczesną możliwoS
cią korzystania z biblio- najczęS
ciej występują w zakresie od 10 ng/
adsorbcja analitu z osocza, płukania wodą i teki widm masowych np. systemu HP 5997 ml. Względy ekonomiczne sprawiają, że
desorbcji metanolem. Uproszczone postÄ™- OC MS/MD Chemistation. WS
ród możliwych technika ta nie znajduje jeszcze powszech-
powanie ma zasadniczą przewagę nad in- technik analitycznych w tym układzie, za- nego zastosowania i tylko nieliczne placówki
nymi bardziej restrykcyjnymi i czasochłon- stosowanie znalazła technika pełnego wid- w Polsce dysponują tymi możliwoS
ciami
nymi. W praktyce, obok wymienionych faz ma masowego (MID - multiple ion detection) analitycznymi.
octyl -C8, octaldecyl  C18, Narc-2 (Becker) stosowanego dla wyższych stężeń bada- Notowane wysokie poziomy ksenobio-
w rutynowych badaniach w toksykologii są- nych związków. Dla przypadków niższych tyków w płynach ustrojowych dla przypad-
dowej szersze zastosowanie znajduje Extre- stężeń ksenobiotyków typowych dla mate- ków zatruć przekraczających zakres stężeń
lut (Merck) jako uniwersalny sorbent związ- riału biologicznego zastosowanie znajduje terapeutycznych stwarzają możliwoS
ci wy-
ków o zróżnicowanym charakterze kwaso- technika SIR (selected ion recording) czy korzystania dodatkowych metod potwierdza-
wo-zasadowym i obojętnym [7,11]. SIM (selected ion monitoring). Obie techni- jących. Najwyższą wartoS
ć użytkową nale-
Współczesna toksykologia kliniczna czy ki pozwalają na monitorowanie zmian inten- ży przypisać m.in. testom wielokrotnej ko-
sÄ…dowa, dysponujÄ…ca nowoczesnymi tech- sywnoS
ci wybranych specyficznych frag- rekty wartoS
ci RF opracowanych dla metod
nikami wykrywania trucizn musi dokonać ich mentów cząsteczki tworzących widmo ma- chromatografii cienkowarstwowej, umożli-
szybkiej i pewnej identyfikacji w materiale sowe. Uzyskane dane dla materiału bada- wiających analizę większej liczby leków
biologicznym na drodze trudnej i skompli- nego przy użyciu dowolnej techniki, mogą [9,10,23]. Podobne zastosowanie znajduje
kowanej eliminacji co najmniej kilku tysięcy znalex
ć potwierdzenie w komputerowym system TOXI-LABTM (Analytical systems,
związków chemicznych towarzyszących układzie porównawczym z odpowiednim Division of Marion Laboratories, Inc.) umoż-
życiu człowieka. Zagadnienia związane z wzorcem wybranym z banku widm. Metoda liwiający szybki skrining (TLC) powszech-
szybką identyfikacją ksenobiotyków w ma- GC/MS znajduje również zastosowanie w nie nadużywanych leków psychoaktywnych
teriale biologicznym dotyczą ciągłego roz- analizie iloS
ciowej [21,30]. Rutynowo, z uwa- i ich metabolitów w kompleksowym zesta-
wijania różnych metod fizykochemicznych, gi na oznaczalnoS
ć, stosuje się technikę SIM wie analitycznym, zapewniającym proces
tworząc coraz bardziej doskonałe programy z równoczesnym użyciem wzorca wewnętrz- ekstrakcji, rozdziału i wizualizacji badanych
tzw. systematycznej analizy toksykologicz- nego, którym jest pochodna deuterowana ksenobiotyków na chromatogramie [27].
nej. W celu wyeliminowania wielu czynni- oznaczonego związku. Kalibracja dotyczy Współczesna analityka toksykologiczna
ków zakłócających powtarzalnoS
ć między- poS
redniej zależnoS
ci funkcji zróżnicowa- dysponująca nowoczesnymi technikami,
laboratoryjną, w rutynowych badaniach tok- nych stężeń związku oznaczonego, wyra- musi dokonać szybkiej i pewnej identyfika-
218 PrzeglÄ…d Lekarski 2001 / 58 / 4 R. Wachowiak
interest on SE-30 or OV-1 stationary phase. J. 17. Lambert W.E., Meyer E., De Leenheer A.P.: Sys-
cji i analizy iloS
ciowej substancji toksycznej
Chromatogr. 1981, 220, 195. tematic toxicological analysis of basic drugs by gra-
w materiale biologicznym i stanowi integral-
2. Armbruster D.A., KroIak J.M.: Screening for drug dient eluation of an alumina-based HPLC packing
ną częS
ć postępowania diagnostycznego,
of abuse with the Roche ONTRAKT Assays. J. Anal. material under alkaline condition. J. Anal. Toxicol.
przydatnego w kontroli procesu skutecznej
Toxicol. 1992, 16, 172. 1995, 19, 73.
detoksykacji. Przedstawione powyżej wybra-
3. Baker I., SkeIton R.: Estimation of HPLC retention 18. Logan G.K., Stafford D.T., Tebbett J.R., Moore
ne zagadnienia, dotyczÄ…ce wykorzystania indices of narcotic analgesics and related drugs. J. C.M.: Rapid screening for 100 basic drugs and
Chromatogr. 1980, 18, 153. metabolites in urine using cation exchange solid
niektórych rutynowych analitycznych metod
4. BaseIt R.C., Cravey R.H.: A compendium of thera- phase extraction and high-performance liquid chro-
badawczych, stanowią fragment ważnego
peutic and toxic concentrations of toxicologically sig- matography with diode array detection. J. Anal.
problemu zwiÄ…zanego z diagnostykÄ… che-
nificant drugs in human biofluids. J. Anal. Toxicol. Toxicol. 1990, 14, 154.
miczną zatruć, która ulega systematyczne-
1977, 1, 81. 19. Moffat A.C.: The standardisation of thin-layer chro-
mu doskonaleniu uwarunkowanego dyna- 5. Bogusz M., Erkens M.: Reversed phase high-per- matographic systems for the identification of basic
micznym postępem technicznym, którego formance liquid chromatographic data base of reten- drugs. J. Chromatogr. 1975, 110, 341.
tion indices and UV spectra of toxicologically relevant 20. Moffat A.C.: Use of Se-30 stationary phase for the
inicjacjÄ… sÄ… m.in. zapotrzebowania toksyko-
substances and its interlaboratory use. J. Chroma- gas-liquid chromatography of drugs. J. Chromatogr.
logii klinicznej i sÄ…dowej.
togr. 1994, 674, 97. 1975, 113, 69.
6. Bogusz M. Wu M.: Standardized HPLC-DAD sys- 21. Mushoff F., DaIdrup T.: Detection and quantifica-
Wnioski
tems based on retention for systematic toxicological tion of low concentrations of 11-nor-delta-9-tetrahy-
1. Systematyczny wzrost uzależnień screening. J. Anal. Toxicol. 1991, 15, 188. drocannabinol-9-carboxylic acid from minimal
7. Breiter J., HeIger R., Lang H.: Evaluation of col- amount of urine. J. Leg. Med. 1991, 104, 263.
oraz zatruć S
rodkami psychoaktywnymi
umn extraction: A new procedure for the analysis of 22. Scheurer J., Moore C.M.: Solid-phase extraction of
wymaga odpowiednich metod diagnostycz-
drugs in body fluids. Forens. Sci. 1976, 7, 131. drugs from biological tissues  a review. J. Anal.
nych, niezbędnych w monitorowanej terapii
8. ChamberIain J.: The analysis of drugs in biological Toxicol. 1992, 12, 264.
i skutecznej detoksykacji.
fluids. CRP Press. Boca Ration New York, London, 23. Schütz H.: Modern screening strategies in analyti-
2. Homogeniczne, immunochemiczne
Tokyo 1995. cal toxicology with special regard to new
techniki diagnostyczne proponowane w róż- 9. Clark s isolation and identification of drugs. Pharma- benzodiazepines. Z. Rechtsmedizin. 1988, 24, 19.
ceutical Society, London 1986. 24. Smith R., TurdIey T., GiII R., Moffat A.: The appli-
nych modyfikacjach charakteryzujÄ… siÄ™
10. DaIdrup T., Susanto F., MichaIke P.: Combination cation of retention indices using the alkylarylketone
znaczną czułoS
ciÄ…, lecz ograniczonÄ… spe-
of TLC, GL and HPLC (RP 18) for rapid detection of scale to the separation of the barbiturates by HPLC.
cyficznoS
ciÄ…, z racji reaktywnoS
ci krzyżowej
drugs and related compounds. Z. Anal. Chem. 1981, II. The effect of the stationary phase. Chromatogr.
 cross reactivity i wymagajÄ… odpowiednie-
308, 413. 1984, 19, 407.
go potwierdzenia innymi metodami badaw- 11. Ferara S.D., Tedeschi L., Frison G., Castanga F.: 25. Smith R.N.: Radioimmunoassay of drugs in body flu-
czymi. Solid phase extraction and HPLC-UV confirmation ids in a forensic context. Forensic Science Progress
of drug of abuse in urine. J. Anal. Toxicol. 1992, 16, 3, Springer  Verlag, Berlin, Heidelberg. 1988.
3. WS
ród rutynowych metod potwier-
217. 26. Stead A.H., Moffat A.C.: A collection of therapeutic,
dzających należy wskazać na chromatogra-
12. HiII D.W., Kind A.J.: Reversed-phase solvent-gra- toxic and fatal blood drug concentration in man. Hu-
fiÄ™ cieczowÄ… (HPLC), gazowÄ… (GLC) oraz
dient HPLC retention indexes of drugs. J. Anal. man Toxicol. 1983, 3, 437.
sprzężone układy GC/MS i LC/MS, jako
Toxicol. 1994, 18, 233. 27. TOXI-LAB screening and confirmation of drug abuse.
najbardziej specyficzne systemy analitycz- 13. Karch S.B.: Drug abuse handbook. CRS Press. Analytical Systems Division of Marion Laboratories
Boca-Raton, Boston, New York, Washington D.C. Irvine, CA. 1987.
ne.
1998. 28. TheIander G., Jonsson J., Schuberth J.: Is urine
4. Komputerowe programy systema-
14. Kintz P.: Drug testing in hair. CRS. Boca-Raton, New a suitable material for the preliminary screening of
tycznej analizy toksykologicznej zapropono-
York, London, Tokyo, 1996. drugs in autopsy cases. Forens. Sci. Inter. 1983, 22,
wane dla układów HPLC-DIODA ARRAY
5. Kovats E.: Gaschromatographische charakteri- 189.
oraz GC/MS stanowią istotny postęp w szyb-
sierung organischer Verbindungen. Teil 1: retentions 29. Weaver D.F., CamfieId P., Frase A.: Massive carba-
kiej i skutecznej analizie związków psycho- indices aliphatischer halogenide, alcohole, aldehyde, mazepine overdose. Clinical and pharmacologic
und ketone. Helv. Chim. Acta 1958, 41, 1915. observations in five episodes. Neurology 1988, 38,
aktywnych.
16. Koves E.M., WeIIs B.S., WeIIs J.: Evaluation of a 755.
photodiod array HPLC-based system for the detec- 30. Yinon J.: Forensic application of mass spectrometry.
Piśmiennictwo
tion and quantification of basic drugs in postmortem CRS Press Inc. 1995, 16.
1. Ardrey R., Moffat A.: Gas liquid chromatography
blood. J. Forens. Sci. 1992, 37, 42.
retention indices of 1318 substances of toxicological
PrzeglÄ…d Lekarski 2001 / 58 / 4 219