09:27 2013-10-14

Identyfikacja mutacji DNA

PCR-RFLP
PCR-ASO
PC

Endonukleazy restrykcyjne
występują w prokariota
Chronią te organizmy przed bakteriofagami
Właney DNA chroniony jest przez system etylaz
Znanych jest kilka tysięcy, używanych kilkaset endonukleaz

Metylacja ane3nin lub cytozyn
Metylacja Dam (SAM -> pozycja N6 adeniny w sekwancji GATC)
Metylazy Dcm (SAM -> pozycja C5 cytozyny w sekwencji CCAGG lub CCTGG)
Dam 0 w losowej sekwencji jedno miejsce metylaacji co 256 nukleotydów
Dcm - w losowej sekwencji jedno miejsce metylacji co 512 nukleotydów

Podstawowe narzędzie badawcze w biologii molekularnej
Najwięjksze znaczenie mają restryktazy klay II
Sa to homodimery aktywowane jonami magnazu
Rozpoznają sekwencje palindromowe 4-8 nukleotyfowe
Miejsce cięcia w obrębie sekwencji lub poza nią

Sposoby cięcia DNA
- Tępe końce
- Lepki końce

Lepkie końce można zastosować do techniki klonowania.



PCR-RFLP
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

Zasotosowanie metod reakcji łańcuchowej polimerazy
Identyfikacja mutacji
Identyfikacja osów
Identyfikacja patogenów
Synteza genów


RT-PCR (badanie mRNA)
badanie ekspresji genów
ocena splicingu

Real Time PCR
badanie ekspresji genów
ocena splicingu
wykrywanie mutacji
wykrywanie i ilościowa ocena
Wirusów DNA i RNA
baterii

Potrzebne do real time PCR
sonda
startery i matryca
polimeraza
specjalny termocykler


Kontrola ekspresji genu
Proces wieloetapowy
Ciągle słabo poznany

Struktura chromatyny
Kontrola epigenetyczna
Inicjacja transkrypcji
Obróbka i modyfikacja transkryptu
Transport RNA
Kontrola przez regulacyjna RNA
Stabilność transkryptu
Inicjacja translacji
Modyfikacja postranslacyjna
Transport białka
Kontrola stabilności białka

Struktura chromatyny - regulacja dostępu do genu przez zmianię upakowania DNA - modyfikacja histonów i zesad DNA
Kontrola epigenetyczna - regulacja nie będąca konsekwencją zmian sekwencji nukleotdowej genomu.
Inicjacja transkrypcji - jeden z najważniejszych etapów regulowanych przez oddziaływanie
Obróbka transkryptu - wycinanie intronów, czapeczka, poliadenylacja, edycja
Transport
Regulacja Stabilności 0 kontrola przez regiony nie podlegające translacji

Kontrola epigenetyczna ekspresji (wiemy że nic nie wiemy)
-Modyfikacja DNA (głównie metylacja wysp CpG) - modyfikacja cytozyn może występować w wysptach CTG (wielokrotne powtózenia CG) szczególnie podatne na metylację. Podlegają metylacji także histony - modyfikacje są bardzo bogate - metylacja, acetylacja, przyłączenie reszt cukrowych i innych polinukleotydów etc. Jeżeli histon ulega metyacji wtedy zwiększa się jego powinowactwo do DNA. Gdy acetylacji, wtedy traci on swó + ładunek, odpada on od chromatyny, chromatyna ulega rozluźnieniu i ułatwia to dostęp dla ensymów.
-Modyfikacja histonów
-Wpływ na kondensację chromatyny

kontrola epigenetyczna
Modyfikacja DNA (Głównie metylacja wysp CpG)
Metylacja cytozyny i tworzenie 5-metylocytozyny
Mechanizmy filogenetycznie stary (znany już u procaryota)
Ochrona przed fagami bakteryjnymi
U Eucaryota
Regulacja ekspresji genów
...

Wzspz CpG
Okoo 3% cztoyznz w genomie ulega metzlacji.
Gwnie nale do wzsp CpG lub CpNpG
Sekwencje CpG tworzą "wyspy" składajaće się z kiljuset nukleotydów o 50% zawartości par GC
Wyspy te są markerami ekspresji genów - w [ostaci hipermetylowanej powodują inaktywację regionu DNA
Metylacja umożliwia przekazywanie potomstwu profilu ekspresji genów
Dziedziczenie informacji nabytej!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Inaktywacjua jednego chromosomu X
Imprinting genomowy
Regulacja ekspresji genów
Udział w karcinogenezie
Hipermetylacja promotorów genów suprersorowych wycisza ich ekspresję ( hipermetylacja dotyczy zwykle pojedynczych genów)
Hipometylacja promotorów protoonkogenów nasila ich ekspresję (hipometylacja dotyczy całego genomu)

Imprinting
profil ekspresji genów może być dziedzczony
Dziedziczenie jest niezależne od dziedziczenie mendlowskiego
Umożliwia ekspresję genu pochodzącego od jednego z rodziców (ekspresja monoalleliczna)
IGF-2 - od ojca
CDKN1C 0 od matki

Metylazy - enzymy przenoszczenia grup metylowych.
Wiele typów metylaz ulegających ekspresji na różnych stadiach rozw2oju
Główne znaczenie w czasie rozwoju embrionalnego
Wyłąćcznie ekspresji grup genów
Hamowanie aktywności transpozonów

Metylazy/demetylazy
Regulacja ekspresji

Metylazy DNMT - DNA methyltrasnferase
DNMT3A - 3b - METYLACJA DE NOVO
dnmt1 - UTRZYMANIE SANU METYLACJI (EKSPRESJA W ZRÓŻNICOWANYCH KOMÓRKACH)

Demetylazy
TET 0 ten-eleven translocaton)
Orzekształcają 5mC w 5hmC
dzalej działa AID i powstaje 5-metylouracyl
5mU jest wycinany i zastępowany przez C
Kluczowe znaczenie w różnicowaniu komórek progenitorowych i macierzycstych

Demetylacja DNA w czasie rozwoju
Demetylacja genowa (genome-wide)
Męski materiałó genetyczny zaraz po zapłodnieniu, na etapie zygoty
Komórka embrionalna na wczesnym etapie rozwoju
Demetylacja specyficzna dla loci

Mutageneza
mC jest wrażliwa na spontaniczna demetylację
Tworzą się nierozpoznawana przez system naprawczy tymina
W efekcie wyspy CpG ewolucyjnie zamieniaja się na sekwencje
.....

Kontrola epigenetyczna
Badanie metylacje DNA
MEtylowanie DNA jest obiecującym biomarkerem nowotworów
Ilość metylowanego DNA u osób z nowotworem jest wielokrotnie wyższa
Badanie stanu metylacji promotorów genów w płynacz biologicznych
Surowica, płyn otrzewnowy
Geny: NIP3, RECK, CYP1B1

Histony:
Mogą podlegać modygikacją
Modyfikacje histonów wpływają na strukturęchromatyny i ekspresję genw

...


Histonz
Acetzlacja HAT
Deacetzlacja
HDAC
równowaga jest utrzymywana popryey rwnowag pomidzy tymi dwona enzymami.

HAT, HDAC - przykłady działania
Różnicowanie komórek hematopoetycznych
AML1 lub RARz wiąze się z HAT
HAT acetyluje lizyny w histonach H3 i H4 tworząc luźną chromatynę
Łatwiejszy dostęp dla zynników transkrycyjnych i nasilenie transkrypcji genów wywołujących różnicowanie komórki.

Hiperaktywacja HDAC, hipoaktywacja HAT
Supresja antyonkogenów
p53
RB1
RUNX3

Znacznenie w unikaniu apoptozy ptzrz komórki nowotworowe
Terapia - przywrócenie równowagi pomiędzy HDAC i HAT

Inhibitory HDAC (HDI)
Psychiatria: kwas walproinowy, kw nikotynowy nowe leki na choroby neurodegeneracyjne i ch. Alzhaimera
Onkologia: vorinostat, romidepsyna (Białaczka T-komórkowa)
Kw walproinowy (rak szyjki macicy i jajnika)
Balinostar 0 rak jajnika)
Mocetinostat

Regulacja ekspresji
Wzaczniacze (nasilanie ekspresji genów)
Wyciszacze (hamowanie ekspresji genów)
Izolatory
Promotory
Czynniki transkrypcyjne


Wzmacniacze - występują od kilkuset do kilkuset tysięcy bp od wzmacnianego gnu
Niespecyficznie regfulują aktywność transkrypcyjną genów lub fragmentów chromosomów
Lokalizacja względem wzmacnianego genu jest dowolna (mogą nawet stanowić jego fragment)
Wiążą się z miejscami wiążącymi na czynnikach transkrypcyjnych)


Wyciszacze
Podobne do wzmacniaczy
wiążą czynniki transkrypcyjne
Hamują ekspresję genów

Izolatory
Problem transaktywacji ekspresji genów przez wzmacniacze
Krótkie fragmenty DNA
Zapobiegają aktywacji/inaktywacji genu przez wazmaczacz/wyciszacz innego genu
Mogą znajdować się przed promotorem lub między genami
Z izolatorem wiążą się białka CTCF zawierajace 11 motywów palców cynkowych

CTCF jest wrażliwy na metylację rozpoznawanego motywu.

Izolatory przyklady
Allelospecyficzna ekspresja genu
IGF-2 i H19
W zależności od profilu metylacji ICR tworzą się pętle DNA o różnej strukturze
W efekcie dochodzi do wyłączenia genów


mRNA

mRNA - obróbka
Czapeczka - zwiększa stabilność RNA
HARPER OPISANE!!!!!!

mRNA - poliadenylacja - ogonki poli-A

mRNA - struktura
Region kodujący
Regiony niekodujące - 3'UTR i 5'UTR
5'UTR - występuje czapeczka, reguluje proces translacji
3'UTR - regulacja stabilnośći transkryptu
Lokalizacja subkomórkowa

Introny/egzony - po co
Introny występują wyłącznie u eukariontów


poszczególne egzony kodują zazwyczaj odrębne domeny biaółkowe
Białka zbudowane z powtarzających się domen powstałyu w wyniku duplikacji/multiplikacji egzonów.

Egzony danego genu często są rekombinacją egzonów innych genów.

Splicing RNA
Geny eukariotyczne zawieraja introny
Przed translacją muszą być one usunięte
Splicing- usuwanie ,,,,,

W wycinaniu intronó wykrozystywane jest koljka mechanizmów
Charakterystyczne sekwencje na granicy intron-egzon
Kompleksy malłych jądrowych RNA (snRNA) i białóek (snRNP)
U1RNP, U2RNP, U4/U6RNP, U5RNP
Ponad 100 różnych białek nie będących RNP

Introny:
Introny zwierają sekwencje konsensusowe umożliwiajace identyfikację ich początków i końców
rozpoczynają się od pary GU po której następuje....
Introny mogą być wycinane same
Zwijanie się i przyjmowanie odpowiedniej konformacji
Autokataliza
Introny grup I i II
W wyniku autokatalizy uwalniaja się raczej liniowe introny a nie lariaty (lassa)

Grupa I sef-splicing
Wewnęyrzne sekwencje 5' naprowadzajace gRNA określające miejsce ataku nukleofilowego
Sekwencje .........


lternatywny splicing
Jeden gen może być matrycją dla wielu białek izoformy
Alternatywne wycinanie genów/intronów zależne od tkanki (tkankowo specyficzny)

Regulacja:
Aktywatory 0 ukierunkowanie splicingi w kierunku konkretnych egzonów i aktywują splicyng
Represory odwrotnie

Aktywatory - ukierunkowują spliceosom w kierunkó konkretnych egzonói aktywują splicing

Represory blokują miejsce splicingu
Istotne w niektorych chorobach gdyż powodują powstanie nowych epitopów które biorą udział w chrobach aktuimmunologicznych.


Aktzwatorz
Biako SR
domena RRM wica si y RNA

hnRNPhnRNP I wue si y wzcisyenie w egyonie
hnRNPA aktzwuje wiyanie kooperaczjne innzch biaek ukrzwajczch miejsce wymacniacya
biako SC35SR nie moe aktzwowa splicingu

Edzcja RNA
Proces ymian sekwencji RNA innz ni splicing prowadycz do powstaniea RNA o innej sekwencji ni matrzca DNA
Odkrztz w mitochondrialnach Trzpanosoma
Wystpuje także w przypadku kilku genów u człowieka )np APOB)

Proces zmiany inny niż splicing prowadzący do powstania RNA o innej sekwencji niż matryca DNA
odkryty w mitochondriach u trypanosoma


Edycja RNA
Umożliwia powstanie różnych produktów białkowych z tego samego genu
Umożliwia syntezę funkcjonalnego mRNA z pseudogenów
Czasami prowadzi do dużych zmian w mRNA
Dotyczy regionów kodujących, intronów (pre-mRNA) i regionów UTR
Może przywracać konserwatywne aminkowasy w białkach (kontrola nad mutacjami?)
Ochrona przed wirusami

Oksydaza cytochromowa C (CoxIII z trypanosoma brucei

Edycja RNA - mechanizm
Obróbka posttranslacyjna
Sterowana przez klase guide RNA (gRNA
gRNA to małe cząsteczki RNA komplementartne do edytowanego mRNA
Niedokładne parowanie między gRNA a mRNA tworzy regiony rozpoznawane przez enzymy edytujące
w ich skład wchodzą:
endonuklezay
terminalna transferaza urydylowa TUTaza
ligaza RNA

Edycja RNA
Świetnie poznana u bakterii i roślin
dotyczy co najmniej kilku genów u ssaków
Apoliproteina B (C->U) - deaminacja cytozyny
Receptory dla glutaminy B (A -> I (inozyna)

KUUUUUUUUUUUURRRWAAAAAAAAAA JAAAK ON ZAPIERDALA!!!!!!!

Wirus D zapalenia wątroby (A->I)
Paramyxovirusy (wstawienie G)

Egycja genu APOB
Edycja podlega C-U w egzonie mRNA
Powstaje kodon STOP
Zupełnie inna forma

Mechanizm edycji A na I
Udział deaminazy adenozyny zależnej od dsRNA
konwersja A->I w 2 egzonach genu receptora glutaminiowego B
Rozpoznawana jest struktura drugorzędowa dookoła miejsca edycji
...