09:20 2013-10-07

Kwasy nukleinowe

Zjawisko transformacji.

Genom człowieka
Genm jądrowy (3300 Mb, ok 22 tys genów
Genom mitochondrialny 16,6hb, 37gen ow
- 2 geny rRNA
- 22 geny t RNA
- 13 genów kodujących białka

____________________________________________________________________________________________________________________
Genom mitochondrialny

Mitochondria
pochodzą od swymbiotycznych akterii
analizy porównawcze DnA sugerują że są to organizmy podobne do Rickettsia prowazekii
DNA zawiera 16569 bp
2 geny kodujące podjednostki rybosomalne
22 geny kodujące białka
dehudrogenazę NADH
oksydazę cytochromu C
Syntazę ATP
większość enzymów mitochondrialnych ma podjednostki kodowane przez genom jądrowy.

Mutacje mtDNA i choroby

Choroby mitochondrialne
Większość chorób mitochndrialnych prowadzi do
kwasicy mleczanowej
proliferacji mitochondriów
negatywnego barwienia na obecność oksydazy cytochromu c

ECM encefalomyopatia
LHON wrodzona neuropatia nerwu wzrokowego Lebera
LS zewspół Leigha

Leczenie wyłącznie objawowe, paliatywne
witaminy
kofaktory enzymów
zmiatacze wolnych rodników
Redukcja sosunku zmutowanych do prawidłpwych mitochondriów
Destrukcja uszkodzonych mitochondriów oprzez enzymy restrykcyjne
Wymiana uszkodzonych białek na białka syntetyzowane przez jadro (ekspresja allotropowa)
Orzeniesienie uszkodzonych genów z innych organizmów

____________________________________________________________________________________________________________________

Genom jądrowy

Skąd różniece w liczbie genów?
Różnne definicje genów
Szacowanie liczby genów
na podstawie mRNA i cDNA - ok 100tys
Modele komputerowe - pl 22-23tys.

Genom jądrowy
- Geny i sekwencje z nim zwiazane (25%)
# Kodujący DNA 10%
# Niekodujący DNA 90%
* Pseudogeny
* Fragmenty genów
* Introny, UTR (regulacja ekspresji genów)
- Pozagenowy DNA (75%)
# Sekwencje unikalne 60% rola nieznana
# Sekwencje powtórzeniowe 40% rola też nieznana, ważne diagnostycznie
* Sekwencje powtórzeniowe (tandemowe, klasterowe)
* Powtórzenia przeplatane

CHARAKTERYSTYKA POWTÓRZEŃ DNA

MEGASATELITY (różna lokalizacja na wybranych chromosomach
Częstość 50-400
Jednostka - klika tys pz

SATELITY (głównie centromery)
Częstość 100-010 000 000
Jednostka 200-5000 pz
Zastosowanie: identyfikacja chromosomów

MINISATELITY (sekwencje telomerowe lub pobliskie)
Częstość 2-400
Jednostka 7-100pz
Zastosowanie: diagnostyka molekularna

MIKROSATELITY (rozsiane po chromosomie)
Częstość 5-100
Jednostka 1-6pz
Zastosowanie: diagnostyka molekularna, mapowanie genów.


Gęstość genów 1/0,45 kb mitochondrium
1/40-45 kb jądro
Wielkość genu 10-15kb
Odstęp międzygenowy 25-30 kb
Liczba egzonów 1-79
Wielkość egzonu średnio 170 bp
max egzon 26 genu apoB 7,6kb
Wielkość intronu MAX W GENE dmd 30,0 KB

NAJWIĘKSZY GEN - dystrofina 2400KB, LICZBA EGZONÓW 79

DNA NIEZAMPLIFIKOWANY
- Wzmocnienie sygnału przy użyciu sond molekularnych
hybrydyzacja w roztworze
hybrydyzacja immobilizowanego DNA (nitropcluloza, nylon)
hybrydyzacja in situ (FiSH)
- DNA ZAMPLIFIKOWANY
- Klonowanie
- Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

METODY BADANIA DNA
FISH - FLUORESCENCJA IN SITU
np. wykrywanie translokacj
Wykrywanie genu HER2 (odpowiada za nowotwór piersi) pozwala na leczenie herceptyną

METODY AMPLIFIKACJI DNA
Klowanie in vitro
PCR in vitro

Temperatura denaturacji dwuniciowego DNA zleży od długości łańcucha, środowiska.

POLIMERAZY W REAKCJI PCR
najczęściej stosowana POLIMERAZA Taq

ZASTOSOWANIE PCR
Wykrwanie mutacji
Identyfikacja osób
Identyfikacja patogenów
Synteza genów
Biotechnologia
Terapia genowa

WADY
Konieczność znajomości sekwencji celem zaprojektowania primerów
Ograniczenie wielkości amplifikowanego fragmentu
Częstość błędów

SCREENING (czy jest mutacja)
IDENTYFIKACJA (na czym polega?)

SCREENING
PCR-HD
PCR-SSCP
PCR-DGGE
PCR-CCM
PCR-PTT

PCR-HDD heterodupleksy
Analiza fragmentów <200bp
Wykrywa mutację punktowe
Nie wykrywa miejca mutacji

PCR-SSCP
Polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych
Analiza fragmentów <600 bp
Wykrywa mutacje punktowe
Nie wykrywa miejsca mutacji

PCR-DGGE
Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego


SEKWENCJONOWANIE DNA
1) Metoda Macama-Gilberta (już niestosowana)
2) Metoda Sangera (dideoxy)
Po przyłączenie nukleotydu dideoxy nukleotydu proces sekwencjonowania zostaje zakończony.
3) Pirosekwencjonowanie


IDENTYFIKACJA
PCR-RFLP
PCR0ASO
PCR-ARMS
OLA