09:47 2013-10-21

Interferencja RNA czyli historia pewnej petunii i robaka noblisty

Proces w który w obecności dcRNA wpływa na ekspresje NRA zawirające go komologiczne
Przez lata błędnie uważano że wprowadzenie do komórki antysensownego RNA poprzez tworzenie hybrydy z mRNA iniemożliwia proces translacji

Ochrona przeciwwirusowa (wiele wirusów zawiera dsRNA jako materiał genetyczny)
Regulacja ekspresji genów
sekwencja microRNAtworzącego strukturę szilki do włosów (kairpin loop)
Interferencja z mRNA


Enzymy

1Dicer

tne długołańcuchowe dsRNA
należy do rodziny RNAz klasy III (rozpoznających dsRNA)
atywny jao dimer, każdy monomer ma 5 domen
2 miejsca aktywne są defektywne
w efekcie postania fragmenty dsRNA o długości 21-23bp (siRNA) u bakterii produktem RNazy III są fragmenty 9-11bp
tnie RNA wirusowe i pre-miRNA

2. RISC
Helikaza zależna od ATP
odpowiada za wyciszanie ekspresji genów
Rdzeź zbudowany z białka argonuate
Domena PAZ
Wiąże koniec 3' jednoniciowego RNA
Domena PIWI
wiąże koniec 5' jednoniciowego RNA
podobna do RNazy H
ssRNA znajduje się pomiędzy domenami PAZ i PIWI


3. miRNP
Budowa jak RISC
zawiera miRNA zamiast siRNA

Etapy degradacji RNA


RNAi

siRNA
miRNA
rasiRNA

dsRNA
pochodzenie
Wirusy
Efekt dzialania polimerazy RNA RNA zależnej
Hairpin loops - spinkia do włosów - mamy geny które kodują miRNA które nie podlegaja translacji, ale transkrypcji tak. Maja dewie sekwencje, po transkrypcji jedno jednonociowe RNA będzie miało sekwencje komplementarne na swoim drukim końcu, łączy się przypominając splątany sznurek i dzięki komplementarnemu podwójnemu łańcuchowi będzie rozpoznawany przez enzym dyrosza, odcina on pętle i powstaje zwykłe dwuniciowe miRNA, jako struktura krótka tworzy kompleks RISC. Może to wyciszyć ekspresję genu albo ją naislić.

RNAi działanie
Hydroliza mRNA
represja translacji
Metylacja histonów


small interfering RNA siRNA
20-25 nukleotydowe fragmenty dsRNA
występujące naturalnie jako produkt działania enzymu Dicer
m

miRNA
występuje naturalnie jako produkt genów
20-25bp
jjest transkrybowane z DNA lecz nie podlega translacji
Gen kodujący jest dsłuższyniż miRNA - zawiera sekwencję mi RNA oraz jej odwrócony frakgemnt
...


Mi-RNA funkcje

\Komplementarn do części sekwencji mRNA fargmentu niekodującego 3'UTR
U zwierząt miRNA zazwyczaj nie jest komplementarne do części kodujących jak u roślin
Związanie miRNA z 3'UTr HAMUJE TRANSLACJE, ALE NIE WPŁWA NA DEGRADACJĘ mRNA


shRNA
short hairpin RNA
Zastosowanie
badania naukowe
wyciszanie genów
medycyna
dostarczamy przy pomocy wirusów
lepsza selektywność niż siRNA
shRNA to syntetyczne RNA tworzone przez człowieka!!

ekspresja siRNA
przejściowa -dsRNA dosrtarczane do kmórki
Stabilna - użycie wektora DNA do produkcji shRNA
Jako wektor
-plazmidy
-retrowirusy
-adenovirusa
-inne?


siRNA - dostarczanie
hodowla komórkowa

in vivo
micele lipidowe
koniugaty
bakteryjnym fagami RNA
cholesterolem
Ateokolagenem
kłady wirusowe (retrovirusy)





10:09 2013-10-21
Modyfikacje posttranslacyjne biaek
Czyli jak zwiększyć różnorodność

Białka-modyfikacje

Zwiękajż zmienność iałek
zmieniają funkcję białek
aktywacja białek
llokalizacja białek
interakcje białk-białko białko-kwas nukelinowy, białko-lipidy białko0kofaktory

"Dalej napierdala. On chyba kręci z Wyżłem, a ten napierdalał Pokorze a ten nam robił z dupy jesień średniowiecza. Kurwa mać ile można srać o białkach."

Ponad 200 różnych modyfikacji
Większość to modyfikacje enzymatyczne
około 5% białek jest zaangażoanych w modyfikację innych biaółe
kinazy
fosfatazy
transferazy
ligazy
hydrolazy

Białka podlegaja modyfikacją na każdym etapie istnienia
to samo biało może podlegać różnym modyfikacją
dojrzewanie białka
aktywacja białka
hydroliza białka
W wyniku degradacji elastyny tworzą się peptydy elastynopochodne, co powoduje przyciąganie do tego miejsca komórki układu immunologicznego co wspieragojenie się rany

Typy modyfikacji
Fosforylacja-defos
ograniczona proteoliza
ubikintynacja
metylacja
acetylacja
modyfikacje lipidowe
Glikolizacja
Nitrozylacja
Hydroksylacja
gamma-karboksylacja
deaminacja


Modyfikacje odwracalne
fosforylacja
defosforylacja
mdyfikacje lipidowe (niektóre)
Modyfikacje nieodwracalne
ograniczona proteoliza
ubikitynacja
hydroksylacja
ganna-karboksylacja



Foosforylacja
Modyfikacja odwracalna
szybka (milisekundy)
enzymatyczna
kinazy serynowo0treoninowe
kinazy tyrozynowe
przekaźnictwo sygnału
Regulacja wzrostu i podziałów komórek


Kinazy
fosforylacji ulegają grupy -OH
seryny
treoniny
tyrozyny

Kinazy serynowo-treoninowe
PKA, PKC, PKG, Kinazy aktywowane mitogenami MAPK kinazy aktywowanie onami wapnia i kalmoduliną Kinaza Akt kinaza CDK

Kinazy tyrozynowe
Knazy receptorów katalitycznych
znajdują się w błonie komórkowej dla czynników wzrostu GF
Kinazy cytozolowe
Produkty protoonkogenów (src, vsrc (wirusowe), abl)


Białka DEFOSFORYLACJA
Fosfatazy
hydrolityczne odszczepienie reszty fosforanowej
proces szybki
wiele typów fosforylaz białkowospecyficznych

Aktywacja fosforylaz przez insuline

Glikolizacja

zawsze enzymatyczna
Glikacja - nieenzymatyczne przyłaczenie glukozy
temperatura stęzęnie glukozy, czas kontaktu
Oznaczanie cukrzycy (glikowana hemoglobina i inne białka - im wyższe stężenie glikowanej hemoglobiny to zna znaczy że jest wyższa glikemia to znaczy ze choroba i jej skutki)

Glikolizacja c.d.
Najbardziej skomplikowana modyfikacja
Kontrola zwijania białka
Bez szblonu przenoszenia reszt cukrowych - każda reszta przenoszona w inny sposób
Transpport biała np. do aparatu Golgiefo - przyłączenie mannozy!
Ligandy dla receptorów
Regulacja interakcji białko -niałko
Zwiększenie rozpuszczalności

Podział glikolizacji od:
miejsce połączenia glikanu
struktura glikanu
skład glikanu (reszty cukrowej białka :P)
wielkość glikanu

Profil glikolizacji jest zmiennu
Nie ma szablonu na którym zachodzi
zleży od ekspresji enzymów odpowiedzialnych za glikolizację
Duża zienność między KOMÓRKAMI - możne być to marker nowotworowy
Olbrzmia zmienność białek

Tpy:
N-Glikozylacja (asparagina
O
C
Fosfo
Glipiacja - przyłącznie fosfolipidu przez glikazn i linker z fosfoetandoloaminy


Nitrozylacja
Przyłącznie do reszty tiolowych cysteiny tlenku azotyu
utworzenie S-nitrozotioli
Szybka redukcjanitrozotioli przez GHS i tiioredoksynę
Proces specyficzny
Mahazynowanie nitrozylowanych białek, np. kaspaz (nieaktywne)
po uwalnienie do cytoplazmy denitrozylacja o wiązen sie z aktywcją
Inicjacja apoptozy


Metylacja
Przyłącznie reszty netylowych
N-metylacja
O-metylacja

Zwiększa hydrofobowość białka
Neutralizauje dodatnie ładunek
Podlegają jej:
Histydyna
Arginina
...

Przyłącznie reszt metylowych
mechanizm regulacji epidenetycznej
metylacja histonów
dawcą grup metylowych jest s-adeozylometionina (SAM)
Arginina może ulegać symetrycznej metylacji, powstaje dimetyloarginina, może powstawać aysmetrycznej metylacji powstaje ADMA (powstaje też z rozpadu białek metylowanych), można go wydalić z moczem, ale jak to niemożliwe to działa on silnie toksycznie b jest inhibitorem tlenku azotu NO! Powoduje miażdżycę tętnic!

deaminacja
Deaminacja arginacji
powstaje cytrulina
nieodwracalna?
Histony
Regulacja ekspresji genów (m.in. p54, receptorów estrogenowych)
Powstawanie cytrulinowanych peptydów
lega jej arginina i metyloarginina
Inne białka

p53!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! koło kurwa
Cytrulinowane białka i peptydy
Powstaja pod wpływem PAD
indukcja przez zapalenie
Modyikacja różnbych białek macierzy
Intensywan cytrulinizacja w RZS
Przeciwciała anty-CCP
markiery diagnostyczne - zwłaszcza reumatoidalnego zapalenia stawów.
Bardzej specyficzne niż RF
Czynnik prognostyczny


Deaminacja oksydacyjna

Lizyna
deaminacja oksydacyjne do allizyny
tworzenie wązań pomiędzy cząsteczkami:
tropoelastyny
tropokolagenu

N-acetylacja
Acetylacja kotranslacyjna która zachodzi z translacją, znaczanie nieznani

Acetylacjja reszt epsilon-aminowych lizyny
głównie białek histonowych
HAT o9 HDAC - regulacja kspresji genów
Znaczenie procesu...


Modyfikacje lipidowe
Znakowanie buałek transportoanych do organelli (ER, aparatu Golgiego, mitochondriów, lizosomów, endosomów, błony komórkowej
ZMiana właściwości biała (wzrost lipofilności)
Kotwiczenie białek.

Typy:
s - prenulacja
S - mitystovylacja
S- palmocylacja
N-końcowa myry


S-prenylylacja
Podlegają jej wybrane reszty cysteinowe
Białka prenylowane mają na C-końcu specjalny motyw
Przyłącznnie reszty C15 lub C20
Proces katalizowany przez transferzy FT i GGT
Kotwiczenie białek w błonach

S+Palmoczlacji
Pryzacynie resytz kw palmoilowego do resytz PAT, odwracalnz

S+Mirzstzlacji C14
odwracalnz

Ogranicyona proteoliya
Wzstpuje tzsice rnbzch proteay
Proces nieodwracalnz yawsye
yachodyi w proteasomach i liyosomach lae moe te w cztoplaymie

Roypoynaj rne sekwencje aminokwaskw,
Aminopopetzdayz o arbokszpeptzdayz
Podyia proteay

.
.
..


Udyia w biosznteyie biaek