Ćwiczenie 6
Diagnostyka Enterobacteriaceae (część 1)
Szczepy:
1. Escherichia coli ATCC 35218
2. Escherichia coli ATCC 25922
3. Escherichia coli ATCC 35216
4. Escherichia coli izolat kliniczny
5. Escherichia coli szczep lac+
6. Escherichia coli szczep lac-
7. Proteus vulgaris
8. Proteus mirabilis
9. Enterobacter aerogenes
10. Serratia marcescens
Podłoża:
1. Podłoże LB
2. Podłoże Mac Conkey a
3. Podłoże Endo
4. Podłoże Simmonsa (z cytrynianem)
5. Podłoże MUG
6. Słupki podłoża MIR (Mocznik Indol Ruch)
7. Skosy podłoża Kriglera
8. 10 % laktoza
9. Podłoże Clark a
10. Chrom Agar Orientation
11. Testy diagnostyczne API 20E firmy Bio Merieux
Wykonanie ćwiczenia:
1. Wybarwić preparaty metodą Grama
2. Wysiew na podłoże MIR wykonuje się wprowadzając materiał w słupek podłoża. Po 24 h
inkubacji odczytać wyniki.
Obserwować zmianę zabarwienia słupka, kolor czerwono-fiololetowy świadczy o
rozkładzie mocznika (aktywność ureazy).
15
Na podłożu tym można też obserwować ruch  gatunki ruchliwe mają tendencję do
wzrostu na zewnÄ…trz od miejsca posiewu.
Następnie do probówek dodać odczynnika Kovac a  czerwony pierścień na powierzchni
słupka świadczy o reakcji dodatniej produkcji indolu z tryptofanu.
3. Podłoże Kriglera zawiera dwa cukry: laktozę i glukozę, sprawdza się na nim także
wytwarzanie siarkowodoru. Posiew na podłoże rozpoczyna się od części słupkowej
(przynajmniej do 2/3 jej wysokości), a następnie wysiewa się bakterie na część skośną.
4. Test MUG sÅ‚uży do szybkiej detekcji Escherichia coli. PodÅ‚oże zawiera substrat bð-D-
glukuronian 4-metyloumbeliferylowy (MUG), większość szczepów E. coli oraz niektóre
Salmonella i Shigella produkują glukuronidazę, która hydrolizuje MUG do fluoryzującego
produktu (4-metyloumbeliferon). Po inkubacji fluorescencjÄ™ obserwujemy poddajÄ…c
próbki działaniu długiego ultrafioletu (366 nm).
Jeżeli prowadzi się test na podłożu bulionowym obserwuje się również wytwarzanie gazu
w rurce Durhama.
MUG
5. Bulion z laktozą służy do identyfikacji koliform (pałeczek fermentujących laktozę),
czynnikiem różnicującym jest laktoza, a wskaz
nikiem purpura bromokrezolowa
6. Na podłożu Clark a wykonać testy MR i VP wg procedury podanej poniżej
7. Wykonać testy diagnostyczne API 20E firmy Bio Merieux (zestaw do identyfikacji
bakterii z rodzaju Enterobacteriaceae i innych pałeczek Gram-ujemnych) dla wybranych
szczepów wg przepisu producenta.
16
Pożywka CLARKA
Skład podłoża (g/l):
Pepton 5,00
Glukoza 5,00
Wodorofosforan dipotasu 5,00
KoÅ„cowe pH 6.9 Ä… 0.1 w 25ºC (po sterylizacji)
test VP, do 1 ml 24 godzinnej hodowli dodać:
0,4 ml 40% roztworu wodorotlenku potasu (40 g KOH + 100 ml wody),
0,6 ml 5% roztworu alkoholowego 1-naftolu i kreatyny (5 g 1-naftolu + 100 ml 95%
etanolu),·
wstrzÄ…snąć probówkÄ™ i pozostawić w temperaturze 37ºC po 20 min. dokonać odczytu.
test MR, wykonuje siÄ™ przez dodatek 2 kropli roztworu czerwieni metylowej (0,1 g czerwieni
metylowej rozpuścić 300 ml etanolu).
Opis:
Podłoże Clarka służy do różnicowania bakterii po względem typu fermentacji glukozy - test
MR oraz zdolności do wytwarzania acetoiny (acetylometylokarbinolu) wykorzystując
reakcję Voges-Proskauera - test VP. Acetoina, obok 2,3-butanodiolu i innych związków,
jest produktem rozkładu glukozy, prowadzonej przez niektóre mikroorganizmy. Wykrywanie
acetoiny polega na tworzeniu diacetylu, o zabarwieniu różowoczerwonym, z acetoiny w
środowisku zasadowym, przy dostępie tlenu i obecności kreatyny. W przypadku testu VP -
wystąpienie intensywnego czerwonego zabarwienia w górnej części podłoża oznacza
obecność acetoiny - wynik pozytywny.
W przypadku wyniku ujemnego podłoże nie zmienia barwy lub pojawia się śladowa barwa
różowa, względnie pomarańczowa, które po upływie kilku godzin przybiera kolor
złotordzawy.
Typy fermentacji prowadzonych przez bakterie możemy odczytać dzięki dodatkowi
indykatora pH - czerwieni metylowej po zakończonej kilkudniowej inkubacji.
Bakterie prowadzące tzw. kwaśną fermentację wytwarzają z cukru i związków pokrewnych
kwasy: mrówkowy, octowy, bursztynowy, mlekowy, co powoduje spadek pH hodowli
poniżej 4,5. W drugim typie fermentacji powstaje mało produktów kwaśnych, a więcej o
charakterze obojętnym np. glikol butylenowy, pH hodowli kształtuje się powyżej 4,5.
Czerwień metylowa w środowisku poniżej pH 4,5 zmienia zabarwienie z żółtego na
czerwone, co świadczy o dodatnim odczycie. W środowisku powyżej pH 4,5 czerwień
metylowa ma zabarwienie żółte  wynik ujemy.
17
Szczepy kontrolne: Wzrost Test VP Test MR
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 dobry + -
Bacillus cereus ATCC 10876 dobry + -
Escherichia coli ATCC 25922 dobry - +
Klebsiella pneumonice ATCC 13883 dobry - +
Podłoże KLIGLERA
Skład podłoża (g/l):
Pepton 20,00
Ekstrakt drożdżowy 3,00
Ekstrakt wołowy 3,00
Chlorek sodu 5,00
Laktoza 10,00
Glukoza 1,00
Tiosiarczan sodu 0,50
Cytrynian amonu żelaza(III) 0,50
Czerwień fenolowa 0,03
Agar 15,00
KoÅ„cowe pH 7.4 Ä… 0.1 w 25ºC (po sterylizacji)
Sposób hodowli:
1. Podłoże posiać poprzez wkłucie igłą bakteriologiczną wybranej, pojedynczej kolonii do
2/3 wysokości słupka oraz rozprowadzić materiał po powierzchni skosu.
2. Inkubować w temperaturze 37ºC przez 18 24 h.
Opis:
Podłoże Kliglera stosowane do identyfikacji gram(-) pałeczek jelitowych, głównie bakterii z
rodziny Enterobacteriaceae w oparciu o zdolność do fermentacji glukozy, laktozy i redukcji
tiosiarczanu do H2S. Zmiany barwne podłoża w wyniku wzrostu drobnoustrojów można
wyjaśnić:
a. Rozkład glukozy - drobnoustroje wykorzystujące tylko glukozę rosną słabo w części
słupkowej w linii wkłucia, powoli rozkładając zapas tego cukru. Kwaśne produkty rozkładu
glukozy prowadzą do zmiany zabarwienia podłoża na kolor żółty. Przy obfitym wzroście
bakterii na powierzchni skosu glukoza zostaje szybko zużyta jak również kwaśne produkty jej
rozkładu. Następuje wówczas wtórna alkalizacja podłoża, będąca następstwem rozkładu
18
peptonu (dekarboksylacja aminokwasów), co powoduje zaczerwienienie części skośnej
podłoża.
b. W przypadku bakterii fermentujących również laktozę nie zachodzi zjawisko wtórnej
alkalizacji podłoża, ze względu na 10-krotnie większą ilość laktozy w podłożu w porównaniu
z glukozą, która pozwala na utrzymanie stanu zakwaszenia podłoża przez dłuższy czas.
c. Zdolność szczepu do fermentacji cukrów z wytworzeniem gazu, uwidacznia się
pojawieniem pęcherzyków gazu w części słupkowej podłoża Kliglera.
d. Szczepy wytwarzające H2S powodują zaczernienie podłoża. Powstaje ono wyniku redukcji
tiosiarczanu do H2S powodowanej przez bakterie, H2S reaguje z jonami żelaza dając siarczek
żelaza, który tworzy czarne precypitaty na granicy skosu i słupka i głębiej w słupku. Na
podłożu silnie zakwaszonym zaczernienie może zniknąć po 48 h inkubacji.
Odczyt wyników:
a. Czerwone zabarwienie części skośnej i żółte słupkowej  fermentacja glukozy, brak
fermentacji laktozy.
b. żółte zabarwienie części skośnej i słupkowej wskazuje na fermentację glukozy i laktozy.
c. Wytwarzanie gazu przy fermentacji laktozy i glukozy uwidacznia siÄ™ powstawaniem
pęcherzyków w słupku lub rozerwaniem podłoża.
d. Wytwarzanie H2S uwidacznia się jako zaczernienie całego słupka lub występuje w postaci
ciemnego pierścienia na granicy słupka i skosu.
Wzrost SÅ‚upek Skos H2S Gaz
Szczepy kontrolne:
Salmonella typhimurium ATCC 14028 dobry żółty czerwony + +
Salmonella eneritidis ATCC 13076 dobry żółty czerwony + +
Shigella sonnei ATCC 9290 dobry żółty czerwony - -
Escherichia coli ATCC 25922 dobry żółty żółty - +
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 dobry żółty żółty - +/-
19
PODA
OŻE ENDO
Skład podłoża (g/l):
Pepton 10,00
Laktoza 10,00
Chlorek sodu 5,00
Siarczyn sodu 2,00
Wodorofosforan dipotasu 3,50
Fuksyna zasadowa 0,30
Agar 15,00
KoÅ„cowe pH 7.3 Ä… 0.2 w 25ºC (po sterylizacji)
Uwaga! Podłoże ENDO jest światłoczułe. W czasie ekspozycji na światło, przy obecności
tlenu, podłoże może ulec fotooksydacji, ciemniejąc od jasnoróżowego do czerwonego. Płytki
koloru głębokiej czerwieni należy wyrzucić.
Opis:
Podłoże ENDO to podłoże wybiórcze służące do wykrywania i różnicowania bakterii z grupy
coli i E. coli pochodzących z różnych materiałów. O charakterze wybiórczym podłoża
stanowi obecność siarczynu sodowego i fuksyny zasadowej, hamujących wzrost większości
gram-dodatnich bakterii.
Podłoże używane jest do różnicowania metabolizujących i niemetabolizujących laktozę
mikroorganizmów. W podłożu ENDO fuksyna zostaje zredukowana siarczynem sodu do
bezbarwnej leukozasady. W wyniku wykorzystywania laktozy przez bakterie tworzy siÄ™
aldehyd octowy, który przywraca fuksynę do pierwotnej postaci. Dlatego kolonie bakterii
laktozo-dodatnich majÄ… ciemnoczerwone zabarwienie. Przy intensywnym tworzeniu siÄ™
aldehydu kolonie mają zielono-złoty, metaliczny połysk w wyniku krystalizacji fuksyny.
Bakterie laktozo-negatywne tworzÄ… bezbarwne, przejrzyste kolonie.
WyglÄ…d kolonii
Wzrost
Szczepy kontrolne:
Barwa Metaliczny
połysk
Escherichia coli ATCC 25922 dobry/b.dobry ciemnoczerwone +
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 dobry/b.dobry czerwonawe Ä…
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 dobry/b.dobry czerwonawe -
Salmonella typhimurium ATCC 14028 dobry/b.dobry bezbarwne -
Staphylococcus aureus ATCC 6538 brak - -
-
20
PODA
OŻE LAKTOZOWE Z PURPUR
BROMOKREZOLOW

Skład podłoża (g/l):
Pepton 10,00
Laktoza 10,00
Chlorek sodu 5,00
Purpura bromokrezolowa 0,02
KoÅ„cowe pH 7.6 Ä… 0.1 w 25ºC (po sterylizacji)
Sposób hodowli:
1. Po wystudzeniu do minimum 45ºC Ä… 0.5ºC, posiać podÅ‚oże 1 ml badanej próbki lub posiać
wybraną pojedynczą kolonią z 24 h hodowli, inne metody wysiewu według norm lub
wewnętrznych wytycznych.
2. Inkubować w temperaturze 35ºC przez 24 h, w przypadku braku obecnoÅ›ci gazu, czas
inkubacji przedłużyć do 48 h.
Opis:
Podłoże z laktozą i purpurą bromokrezolową to podłoże różnicujące, pozwalające stwierdzić
zdolność do rozkładu laktozy. W wyniku rozkładu laktozy tworzą się kwasy, powodujące
zmianę zabarwienia podłoża z fioletowej na żółtą, dzięki obecności indykatora pH - purpury
bromokrezolowej, dodatkowo w rurce Durhama zbiera siÄ™ gaz.
O wzroście drobnoustrojów świadczy zmętnienie, osad lub kożuszek na powierzchni.
Szczepy kontrolne: Wzrost Zabarwienie podłoża Gaz
Escherichia coli ATCC 25922 dobry żółte +
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 dobry żółte +
Klebsiella pneumonice ATCC 13883 dobry żółte +/-
Salmonella typhimurium ATCC 14028 dobry fioletowe -
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 brak/b.słaby fioletowe -
21
Pożywka SIMMONSA
Podłoże stosowane do stwierdzania zdolności wykorzystywania cytrynianu jako jedynego
z
ródła węgla, szczególnie do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.
Skład podłoża (g/l):
Chlorek sodu 5,00
Cytrynian sodu 2,00
Diwodorofosforan potasu 1,00
Wodorofosforan diamonu 1,00
Siarczan magnezu 0,20
Błękit bromotymolowy 0,08
Agar 20,00
KoÅ„cowe pH 7.2 Ä… 0.1 w 25ºC (po sterylizacji)
Sposób hodowli:
1. Podłoże posiać rysą poprzez przeniesienie pojedynczej kolonii przy pomocy ezy.
Uwaga! Przy posiewie na podłoże Simmonsa należy zwrócić uwagę, żeby wraz z bakteriami
nie przenieść podłoża wzrostowego, które może nieść substancje stanowiące z
ródło węgla
inne niż cytrynian, co może spowodować błędne wnioski.
2. Inkubować w temperaturze 37ºC do 4 dni.
Opis:
Agar Simmonsa jest podłożem o dokładnie zdefiniowanej kompozycji chemicznej, gdzie
z
ródłem węgla jest cytrynian sodu, a z
ródłem azotu będą jony amonowe pochodzące z
wodorofosforanu diamonu. Podłoże to nie zawiera substancji odżywczych takich jak:
aminokwasy, peptydy, witaminy, będą rosły na tym podłożu drobnoustroje o niskich
wymaganiach pokarmowych.
Wykorzystywanie cytrynianu przez drobnoustroje prowadzi do alkalizacji podłoża, co
powoduje zmianę zabarwienia podłoża z zielonego na niebieskie, dzięki obecności indykatora
pH - błękitu bromotymolowego.
Szczepy kontrolne: Wzrost Wygląd podłoża
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 dobry niebieskie
Salmonella enteritidis ATCC 13076 dobry niebieskie
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 dobry niebieskie
Escherichia coli ATCC 25922 słaby/dobry zielone
22
Podłoże CHROMagar Orientation
Zostało opracowane przez A. Rambacha CHROMagar, Paryż, Francja.
y
ródłem składników odżywczych w podłożu BD CHROMagar Orientation Medium są
specjalnie dobrane peptony. Mieszanka chromogenów składa się z substratów sztucznych
(chromogenów), które w wyniku rozkładu przez określone enzymy bakteryjne tworzą związki
o różnym zabarwieniu, co umożliwia bezpośrednie różnicowanie pewnych gatunków lub
wykrywanie pewnych grup drobnoustrojów Przed inkubacją oraz podczas niej należy
ograniczyć do minimum ekspozycję na światło, gdyż może ono zniszczyć układ
chromogenów.
Szczepy bakteryjne Wzrost
Escherichia coli ATCC 25922 Wzrost dobry lub bardzo dobry; kolonie średniej
wielkości lub duże, ciemnoróżowe do różowych, przejrzyste
Enterobacter cloacae ATCC 13047 Wzrost dobry lub bardzo dobry; kolonie
średniej wielkości, ciemnoniebieskie, mogą występować fioletowe obwódki
Proteus mirabilis ATCC 14153 Wzrost dobry lub bardzo dobry; kolonie średniej
wielkości, blade do beżowych, otoczone bursztynową lub brązową obwódką; w obszarach
intensywnego wzrostu podłoże może być całkowicie bursztynowe lub brązowe. Częściowe
lub całkowite zahamowanie stopniowego wzrostu kolonii.
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Wzrost dobry lub bardzo dobry; kolonie
małe, niebieskozielone do niebieskich
Streptococcus agalactiae ATCC 12386 Wzrost dobry lub bardzo dobry; kolonie małe,
jasnoniebieskozielone do jasnoniebieskich, mogą występować obwódki
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Wzrost dobry lub bardzo dobry; kolonie średniej
wielkości lub małe, naturalne zabarwienie (białe lub kremowe)
Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 Wzrost dość dobry lub dobry; kolonie małe,
matowe, jasnoróżowe do różowych
23