Wykład 9
30 kwietnia 2009
Biologiczne funkcje wolnych
rodników
" Fotosynteza (pierwotny rozdział ładunku i
przenoszenie elektronu w łańcuchu transportu e)
" Fosforylacja oksydacyjna w mitochondriach
" Biosynteza prostaglandyn i tromboksanów
" Utlenienie ksenobiotyków w mikrosomach
" Regulacja ciśnienia krwi
" Zabijanie bakterii w trakcie fagocytozy
" Ponadto dość powszechny staje się pogląd, \
e wolne
rodniki i tzw.  reaktywne formy tlenu zaanga\
owane
są w wielu procesach chorobowych, a nawet mogą
być odpowiedzialne za proces starzenia komórek
Do najwa\
niejszych i najbardziej
badanych nale\
ą:
" rozedma płuc indukowana dymem papierosów
" reumatoidalne zapalenie stawów
"
"
"
" zatrucie alkoholowe
"
"
"
" zwłóknienie płuc indukowane azbestem
"
"
"
" zatrucie czterochlorkiem węgla
"
"
"
" zatrucie niektórymi metalami
"
"
"
" choroba Parkinsona
"
"
"
" choroba Alzheimera
"
"
"
" choroba Downa
"
"
"
" mia\
d\
yca
"
"
"
" uszkodzenie tkanek towarzyszące reperfuzji po niedotlenieniu
"
"
"
" nowotwory
"
"
"
Metody detekcji wolnych rodników
" Bezpośrednie, przy u\
yciu rozdzielczych
czasowo spektroskopii optycznych, metod
polarograficznych oraz po zastosowaniu
spektroskopii elektronowego rezonanu
paramagnetycznego (EPR lub ESR)
" Pośrednie, poprzez oznaczanie produktów
oddziaływania z wybranymi akceptorami,
poprzez obserwację zaniku kluczowych
reagentów
Podstawowe równania
" Podstawę ERP stanowi efekt Zeemana,
polegający na rozszczepieniu poziomów
energetycznych cząstek paramagnetycznych
pod wpływem zewnętrznego pola
magnetycznego. Po umieszczeniu cząstki o
momencie magnetycznym � w polu
�
�
�
magnetycznym o indukcji B, cząstka ta
uzyskuje energię E:
E = - � * B
(� �)
Podstawowe zale\
ności
" Dla atomu o całkowitym momencie pędu J
dipolowy moment magnetyczny wynosi:
� = - g � J
�
�
�
gdzie: g  współczynnik spektroskopowego
rozszczepienia,
� - magneton Bohra.
Tak więc po umieszczeniu atomu w polu
magnetycznym uzyskuje on energię:
E = g � J B
Podstawowe zale\
ności
" Wektor J ka\
dego atomu mo\
e przybierać
tylko pewne dozwolone orientacje określone
zbiorem wartości liczby kwantowej MJ i
dlatego energia związana z przestrzenną
orientacją atomu ograniczona jest do zbioru
wartości zale\
nego od MJ i wynosi:
EJ= g MJ B
gdzie:MJ=J, J-1, J-2,...-J.
Podstawowe zale\
ności
" Obserwację sygnału ERP mo\
na przeprowadzić
mierząc zmiany rezonansowego pochłaniania energii w
zale\
ności od częstotliwości (�) promieniowania
�)
�)
�)
elektromagnetycznego przy stałej wartości indukcji
zewnętrznego pola magnetycznego, lub odwrotnie,
zmieniając pole magnetyczne (B) przy stałej
częstotliwości (�). Ze względów technicznych w
�)
�)
�)
spektroskopii EPR wygodniejszy jest drugi sposób.
Schemat blokowy
absorpcyjnego
spektrometru optycznego
oraz spektrometru EPR
Spektrometr EPR firmy Bruker
Chla + A + h�
�
�
�
Chla* + A
Chla+. + A-.
Podstawowe zale\
ności
" Równanie, które podaje warunek rezonansu dla
swobodnego elektronu:
h�
�=g�B,
�
�
jest zbyt du\
ym uproszczeniem w przypadku
większości centrów paramagnetycznych.
Koniecznym jest uwzględnienie wielu dodatkowych
oddziaływań magnetycznych, które modyfikują
charakter wypadkowego widma EPR paramagnetyka.
Te dodatkowe oddziaływanie uwzględnia się
wprowadzając odpowiedni OPERATOR
HAMILTONA, którego wartości własne opisują
poziomy energetyczne elektronu
Podstawowe zale\
ności
" Wypadkowy Hamiltonian
H = HZ + HNS + HNO +...
Energia oddziaływań Zeemana: 0 -1 cm -1
Energia oddziaływań nadsubtelnych: 0 -10-2 cm -1
Energia oddziaływań spin-orbitalnych: 0 -103 cm -1
STRUKTURA NADSUBTELNA WIDMA EPR
" To wynik lokalnego pola magnetycznego, które pochodzi
od momentów magnetycznych pobliskich jąder
atomowych
Blok= B + amI
gdzie: a - stała sprzę\
enia nadsubtelnego, która zale\
y
od momentu magnetycznego jądra i jego odległości od
niesparowanego elektronu
mI = ą � dla I = � oraz ą1, 0 dla I = 1
hv1=g � (B+ �a), hv2=g � (B - �a),
hv1=g � (B+ a), hv2=g � B, hv3=g � (B - a)
Jedno- i dwu-elektronowe utlenianie kwasu askorbinowego
Pomiar nietrwałych wolnych rodników w warunkach stanu
stacjonarnego, w którym kwas askorbinowy i jego oksydaza
mieszane są bezpośrednio przed pomiarem i przepuszczane
przez wnęke rezonansowa spektrometru EPR
Schemat utlenienia
substratu (SH2) przez
H2O2 katalizowany
peroksydazą chrzanu;
widma EPR wolnych
rodników generowanych
w trakcie procesu
Podstawowe zale\
ności
" Dla centrów paramagnetycznych  unieruchomionych
względem zewnętrznego pola magnetycznego ( na
 10
skali czasu, którą rejestruje EPR, czyli 10-8 - 10 s),
nale\
y uwzględnić anizotropię właściwości
magnetycznych.
" Oznacza to, \
e oddziaływania Zeemana, nadsubtelne i
spin-orbitalne opisywane powinno być są tensorami a
nie parametrami skalarnymi.
Podstawowe zale\
ności
" W przypadku wolnego jonu współczynnik g
ma własności izotropowe, natomiast w
krysztale jego wartość zale\
y od kierunku
zewnętrznego pola magnetycznego w
stosunku do osi symetrii wewnętrznego pola
krystalicznego.
Wspólczynnik spektroskopowego
rozszczepienia
" Współczynnik g dla atomów:
J(J +1)+ S(S +1)- L(L +1)
g =1+
J
2J(J +1)
" Współczynnik g dla cząsteczek:
� L � � L �
0 i n 0 j n
g = g - 2
"
ij e
E - E
n 0
Widma EPR ró\
nych typów białek
zawierających jony \
elaza w
centrach aktywnych:
(a) wysoko-spinowe Fe(III) w
methemoglobinie,
(b) nisko-spinowe Fe(III) w
ferricytochromie c, oraz
(c) zredukowane białko zawierające
niehemowe \
elazo
Widma EPR ferrodoksyny z Micrococcus lactilyticus w stanie
częściowo i całkowicie zredukowanym, T = 77K
Widma EPR kompleksów
hemoglobiny z NO pod
nieobecność i w obecności
allosterycznego efektora
HB  sześciofosforanu
inozitolu (IHP); monitoro-
wanie zmian stanu
konformacyjnego HB
Pośrednia detekcja reaktywnych,
krótko\
yjących wolnych rodników
Zastosowanie pułapek spinowych:
ST + R. ST-R.
Nitronowe pułapki spinowe
" DMPO, 5,5-dimethylpyrroline N-oxide
H3C
R. H3C
H
H
N
N
H3C
H3C R
O
O.
" PBN/4-POBN, phenyl-N-t-butylnitrone
R
R.
C N C(CH3)3
C N C(CH3)3
H O
H O.
Dark
Light
0.01 mM BB6,
1.0 mM NADH,
100 mM DMPO,
75% DMSO
0.24 mM O2
Simultion
Wytwarzania wolnych
rodników tlenowych
i innych RFT w
peroksysomach
Mikrosomalny układ transpotu elektronów:
schemat procesów prowadzących do hydroksylacji
ksenobiotyków i generowania RFT
Detoksyfikacja chinonów
w procesie dwu-
elektronowej redukcji
oraz ich aktywacja do
form mutagennych w
wyniku jedno-
elektronowej redukcji
Stryktury chemiczne
niektórych kseno-
biotyków
Generowanie wolnych rodników
przez hepatocyty traktowane
czterochlorkiem węgla.
Zarejestrowane widma adduktów
PBN świadczą o generowaniu
przez układ mikrosomalny
hepatocytów rodnika .CCl3 oraz,
wtórnie, .OOCCl3
Wybuch tlenowy
Silnie zwiększona konsumpcja tlenu przez makrofagi
i inne komórki zdolne do fagocytozy po ich pobudzeniu.
Konsumpcja ta nie zale\
y od aktywności łańcucha
oddechowego mitochonrdiów kmórek.
Struktura neutrofilu obserwowana
przy pomocy TME; białe ciałka to
sfagocytowane kuleczki lateksowe
Zdjęcie makrofaga
śledziony zrobione
przy pomocy
skaningowego mikroskopu
elektronowego
Właściowości makrofagów
NADPH + 2O2 NADP+ + H+ + 2O2-.
" Przez pojęcie oksydazy NADPH granulocytów rozumie się zespół
co najmniej dwóch białek; flawoproteina przyjmuje elektrony od
NADPH i przekazuje je cytochromowi b558, który redukuje tlen.
" Pobudzony granulocyt obojętnochłonny mo\
e uwalniać 3,2 x106
cząsteczek O2-. i równowa\
ną ilość H2O2.
" Efektem braku aktywności oksydazy NADPH w fagocytach jest
dziecięca postać ziarnicy złośliwej.
" Zabijanie bakterii w wyniku wybuchu oddechowego mo\
e
zachodzić przy udziale:
H2O2 i O2-.
HOCl, HOBr, HOI generowanych w reakcjach nadtlenoazotynu,
CL- + H2O2HOCl +OH- lub
nadtlenoazotynu: O2-. + NO. ONOO-
Schemat struktury aktywnego kompleksu oksydazy NADPH
Widma EPR adduktu spinowego DMPO w zawiesinie aktywowanych
neutorfili; po 6 min (a) lub 12 min (b) od ich aktywacji oraz w
obecności SOD (c). 1  DMPO-CH3, 2  DMPO-OH, 3  DMPO-OOH