Nina Gałek 12.01.2012r.
PROJEKT
Transformacji bakterii i klonowania DNA w komórkach Eschericha coli.
Wprowadzenie.
Klonowanie drobnoustrojów polega na namnażaniu przez podziały mitotyczne, wyselekcjonowanych komórek bakteryjnych w odpowiednich pożywkach. Powielanie odbywa się za pośrednictwem wektorów (np. plazmidów, wirusów lub ich pochodnych), mających zdolność do samodzielnej replikacji w komórce bakteryjnej. Klonowanie w komórkach bakterii wykonuje się w celu uzyskania DNA w dużej liczbie kopii, które można poddać dalszym badaniom. Celem projektu jest wyprodukowanie genu kodującego insulinę.
Przygotowanie insertu DNA.
Rozcieńczyć insert DNA do stężenia 200ng/µl. Do probówki Eppendorfa dodać 11µl wody destylowanej, 2µl buforu do trawienia, 5µl przygotowanego DNA, po 1µl każdego enzymu restrykcyjnego (KPN I i BspM I). Reakcję trawienia prowadzić przez 2 godz. W temperaturze 37ºC. Po zakończeniu trawienia DNA próbki inkubować przez 10 min. W temperaturze 65ºC w celu inaktywacji enzymów restrykcyjnych.
Przygotowanie plazmidu pUC19.
Rozcieńczenie insertu DNA do stężenia 500ng/µl. Do probówki Eppendorfa dodać 14µl wody destylowanej, 2µl buforu do trawienia, 2µl przygotowanego DNA, 1µl każdego enzymu restrykcyjnego (KPN I i BspM I). Reakcję trawienia prowadzić przez 1 godzinę w temperaturze 37ºC. Po zakończeniu trawienia DNA próbki poddać inkubacji przez 10 min. w temperaturze 65ºC w celu inaktywacji enzymów restrykcyjnych.
Ligacja.
Do probówki Eppendorfa zawierającej przecięty enzymami restrykcyjnymi wektor do klonowania DNA dodać mieszaninę z przygotowanego insertu DNA. Dodać 5µl Ligazy DNA faga T4. Mieszaninę ligacyjną delikatnie wymieszać przez pipetowanie i inkubować 2 godz. w temperaturze pokojowej. Po inkubacji mieszaninę umieścić na lodzie.
Transformacja kompetentnych komórek.
Rozmrozić jedną probówkę kompetentnych komórek DH5 na lodzie. Dodać 5µl mieszaniny ligcyjnej do rozmrożonej probówki kompetencyjnych komórek. Zawartość probówki delikatnie wymieszać. Powstałą mieszaninę inkubować na lodzie 20 minut. Przygotować SOC medium (nośnik) ogrzewając do 42°C. Zastosować szok cieplny w powstałej mieszaninie transformacyjnej w temperaturze 42°C przez 45 sekund. Następnie inkubować mieszaninę transformacyjną na lodzie przez 2 minuty i dodać 250µl ogrzanego SOC medium. Po tym etapie przez 1 godzinę regenerować w 37°C w łaźni wodnej z wytrząsaniem. Przygotować szalki Petriego z pożywką LB z dodatkiem ampicyliny. Na szalki nanieść 40µl 2% roztworu X-Gal (5bromo-4-chloro-3-indolilo-*-D-galaktozyd) i rozprowadzić na całej powierzchni płytki za pomocą głaszczki. Następnie do każdej szalki dodać 100µl mieszaniny transformacyjnej. Inkubować przez noc w 37°C. Skład pożywki LB przedstawia tabelka:
Składniki |
Ilość |
Woda destylowana |
950 µl |
Trypton |
10 g |
Ekstrakt drożdży |
5 g |
NaCl |
10 g |
5N NaOH |
Ilość potrzebna do uzyskania przez pożywkę pH 7,0 |
Analiza transformacji.
Po inkubacji z wysianych płytek wybrać kolonie koloru białego, zawierają one zrekombinowany plazmid. Kolonie te przeznaczyć do dalszych badań. Kolonie koloru niebieskiego odrzucić . Z wybranych kolonii sporządzić mini preparat DNA używając standardowych protokołów.
Podsumowanie.
Do wektora zostanie wprowadzony gen kodujący insulinę. Jest ona bardzo ważnym lekiem dla ludzi chorujących na cukrzycę - obniża stężenie glukozy we krwi zwiększając transport glukozy do wnętrza komórek. Zastosowanie ludzkiej insuliny ma przewagę nad insulina zwierzęcą, której podawanie może powodować produkcję przeciwciał skierowanych przeciwko insulinie zwierzęcej (obniżona przyswajalność, stan zapalny).