Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny.
Wykonanie:
Celem ćwiczenia jest zapoznanie praktyczne z metodyką oznaczania aktywności endopeptydaz na przykładzie trypsyny,
Hydroliza enzymatyczna kazeiny.
Otrzymany w kolbce roztwór trypsyny, dopełniony do kreski, mieszamy. Do 3 czystych enzymatycznie probówek odmierzamy po 2 ml kazeiny i umieszczamy w łaźni wodnej w temp. 37°C na pięć minut. Po tym czasie do 2 probówek z kazeiną (próby pełne) dodajemy po 1 ml enzymu z kolbki miarowej, szybko mieszamy i inkubujemy wszystkie 3 próby w tej samej temperaturze jeszcze przez 15 minut. Następnie do wszystkich 3 prób dodajemy po 2 ml kwasu trichlorooctowego, wyjmujemy probówki z łaźni wodnej i do próby kontrolnej dodajemy 1 ml enzymu z kolbki. Wszystkie 3 próby mieszamy i pozostawiamy na 30 minut w temperaturze pokojowej, by całkowicie mógł wytrącić się osad białka. Próby przesączamy do czystych probówek przez sączki bibułowe po tym czasie.
Fotometryczne oznaczanie tyrozyny w produktach hydrolizy enzymatycznej.
Do kolejnych 3 czystych probówek odmierzamy po 1 ml klarownego przesączu z dwóch prób pełnych i z próby kontrolnej. Do wszystkich dodajemy po 2 ml 0,5 M NaOH oraz po 0,6 ml odczynnika Folina. Wszystko dokładnie mieszamy. Po 10 minutach odczytujemy absorbancję dla długości fali 670 nm.
Wyniki i obliczenia:
Próba pełna 1 |
Próba pełna 2 |
Średnia absorbancja |
0,173 |
0,138 |
0,155 |
Ilość moli tyrozyny odczytana z krzywej wzorcowej: 0,112 μmola
w 1 ml przesączu 0,112 μmola tyrozyny
w 5 ml x
x = 0,56 μmola
0,56 μmola 1 ml
y 10 ml
y = 5,6 μmola
1,5 ml 5,6 μmola
40 ml buforu z
z = 149, 33 μmola
7 mg 149, 33 μmola
1 mg m
m = 21,33 μmola
21,33 μmola / 15 min = 1,422 μmol/min
2