Organizacja pracy laboratorium mikrobiologicznego
Zmywalnia - pomieszczenie przeznaczone do zmywania szkła laboratoryjnego
i przygotowywania go do sterylizacji termicznej suchej w suszarkach laboratoryjnych.
Pożywkarnia - pomieszczenie, w którym przygotowywane są podłoża mikrobiologiczne,
rozcieńczalniki, odczynniki chemiczne, barwniki.
Sterylizatornia czysta - pomieszczenie wyposażone najczęściej w autoklaw -
do termicznego wyjaławiania podłóż mikrobiologicznych, suszarkę laboratoryjną -
do sterylizacji szkła laboratoryjnego oraz aparat Kocha - do pasteryzacji.
Sterylizatornia brudna - pomieszczenie wyposażone w autoklaw przeznaczony
do utylizacji posiewów i hodowli mikrobiologicznych.
Kolekcja szczepów - pomieszczenie wyposażone w szafy chłodnicze i zamrażarki
do przechowywania szczepów na skosach agarowych, w formie liofilizatów
lub zamrożonych..
Sprzęt mikrobiologiczny
1. Aparat Kocha jest przeznaczony do pasteryzacji substancji w parze bieżącej o temperaturze do 1000 C przy ciśnieniu atmosferycznym. Aparat składa się z metalowego kotła parowego
z perforowanym dnem, pod którym znajduje się zbiornik z wodą i system grzałek. Grzałki
doprowadzają wodę do wrzenia, a powstająca para wodna znajduje ujście w nieszczelnej
porywie aparatu. Kocioł wyposażony jest we wskaźnik poziomu wody oraz termometr.
W dolnej części kotła wmontowane są grzałki.
Aparat Kocha służy do upłynniania pożywek mikrobiologicznych i przygotowywania podłóż
zawierających termolabilne składniki. Czas pasteryzacji zależy od objętości i rodzaju
materiału i wynosi od 15-60 min. W aparacie Kocha przeprowadza się”
-Pasteryzacja - to działanie na drobnoustroje temperaturą do 100°C w strumieniu pary wodnej. W procesie tym giną jedynie formy wegetatywne, natomiast nie ulegają zniszczeniu formy przetrwalnikowe bakterii, które wytrzymują wielogodzinne gotowanie. Pasteryzacja ma na celu zabicie bakterii chorobotwórczych w produktach spożywczych (głównie płynnych, np. mleku i jego przetworach , piwie, sokach owocowych) oraz przedłużenie trwałości tych produktów w wyniku zniszczenia większości drobnoustrojów saprofitycznych nieprzetrwalnikujących.
-Pasteryzacja UHT - błyskawiczne podgrzanie, 1-2 sekundowe do temperatury powyżej 100 C i równie szybkim ochlodzeniu do temperatury pokojowej.
-Tyndalizacja - to proces trzykrotnej sterylizacji przeprowadzanej w odstępach co 24 godziny w aparacie Kocha. Aparat Kocha jest to zamykany pokrywą kocioł z podwójnym dnem, którego spód stanowi zbiornik z wodą podgrzewaną do temperatury wrzenia. Gorąca para wodna ulatnia się przez dziurkowane dno zbiornika.
W pierwszej fazie (pasteryzacja w 100°C przez 30 minut) giną formy wegetatywne. Okres przerwy po pierwszej pasteryzacji pozwala na wykiełkowanie form przetrwalnikowych, które nie uległy zabiciu. Druga pasteryzacja zabija formy wegetatywne, które rozwinęły się z form przetrwalnikowych, a trzecia upewnia nas o zabiciu wszystkich drobnoustrojów.
2. Autoklaw - urządzenie ciśnieniowe przeznaczone do sterylizacji podłoży
3. Suszarki - służą do wyjaławiania szkla, naczyń oraz suszenia różnych substancji
4. Filtry - służą do wyjaławiania cieczy
5. Termostaty - służą do hodowli drobnoustrojów. Szafy z półkami zbudowane są z blachy stalowej
6. Anaerostaty - do hodowli drobnoustrojów beztlenowych. Powietrze zastepuje się mieszanina gazow
7. Lodówki - utrzymanie pożywek, płynów, szczepy bakterii.
8. Lampy kwarcowe - do odkazania pomieszczen, które maja zdolnosc emisji promieni ultrafioletowych dzialajacych bakteriobojczo
Sprzęt do szczepienia drobnoustrojów:
9. Eza (oczko) - przenoszenie materiału mikrobiologicznego na inne podłoża, do robienia preparatów
10. Głaszczka - wykorzystywana do procesów powierzchniowych.
11. Igła
12. Szkło - zapakowane w papier, czyste
płytki Petriego - szklane lub plastikowe, używane do hodowli, liczenia, badań
szkiełka podstawowe i kontaktowe
Metody wyjaławiania:
Fizyczne :
-cieplna
a) sucha - wyjaławianie przez wyżeranie, opalanie, wyjaławianie w suszarkach
b) mokra - sterylizacja w autoklawie- kocioł, w którym uzyskuje się wysokie cisnienie, manometr, termometr, pożywki sterylizuje się przewaznie pod nadcisnieniem 1,5 lub 1 atmosfer
-sterylizacja w aparacie Kocha - wyjaławianie w strumieniu pary wodnej
- promienie UV - lampy kwarcowe stosowane do sterylizacji powietrza pomieszczen.
- ultradzwieki
- promienie jonizujace
Chemiczne:
- Kwasy i zasady
- Środki utleniające
- Sole metali ciężkich
- alkohole
- aldehydy
- Związki fenolu i ich pochodne
- Czwartorzędowe związki amonowe
Mechaniczne
- wyjaławianie przez filtracje - Przez filtrację wyjaławia się najczęściej podłoża płynne lub ich składniki, które pod
wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyko-chemiczne np. surowica, krew, roztwór
mocznika, witaminy, aminokwasy, niektóre cukry. Metoda ta polega na mechanicznym
zatrzymaniu mikroorganizmów na powierzchni filtra o porowatości mniejszej od średnicy
drobnoustrojów, czyli około 0,22-0,45 µm.
Mikroskop
Powiekszenie mikroskopu - rowne jest iloczynowi powiekszenia obiektywu i powiekszenia okularu
Rozdzielczość - możliwość odroznienia dwoch punktow na preparacie - im jest ona wieksza tym obraz jest bardziej ostry
Kontrast - intensywnosc rozrozniania dwoch roznych czesci obrazu.
Na ściance obiektywu podane sa cyfry okreslajace powiekszenie obiektywu i jego aperture np. 40/0, 85. Pierwsza czesc ulamka okresla powiekszenie, druga - aperture. Zwiekszenie zdolnosci rozdzielczej mikroskopu osiagamy m.in. przez zastosowanie obiektywu. Wyrożniamy mikroskopy: optyczne, transmisyjne elektronowe, skaningowe elektronowe.
Barwienie drobnoustrojów
Cel barwienia - ulatwienie obserwacji waznych cech morfologicznych, diagnostycznych oraz liczenia.
Barwniki - zasadowe barwniki anilinowe, wykorzystujace ich powinowactwo do plazmy komorkowej charakteryzujacych się kwasnym odczynem np. blekit metylenowy. Barwniki kwasne - fuksyna kwasna, eozyna
Rodzaje barwienia
przyżyciowe - barwienie żywych komorek drobnoustrojow (sprawdzenie zywotnosci lub obecnosci substancji zapasowych)
preparatow utrwalonych:
a) proste - tylko jednym barwnikiem
b) złożone - kilka barwnikow
c)negatywne - zabarwienie tla, komorki drobnoustrojow nie sa zabarwione
Etapy barwienia
a) Wykonanie rozmazu:
- rozprowadzenie kropli hodowli cienka warstwa na srodku odtluszczonego szkielka
- krople wody naniesc na szkielko, pobrac material i rozprowadzic w kropli wody, pozostawic do wyschniecia
b) Utrwalenie preparatu:
metoda termiczna - polega na trzykrotnym powolnym przeciaganiu szkielka podstawowego z rozmazem w plomieniu palnika. Szkielko należy trzymac szczypcami zwrocone rozmazem do gory
metoda chemiczna - przy użyciu alkoholu, eteru, formaliny. Na wysuszony rozmaz należy wlac pare kropli zwiazku chemicznego, pozostawic kilka minut, potem można go zabarwic
c) Zabarwienie komorek drobnoustrojow:
barwienie proste - zabarwienie utrwalonego preparatu jednym roztworem barwnika. Barwnik się zlewa, splukuje woda i osusza paskami bibuly
złożone - zabarwienie roztworami wielu barwnikow
Schemat metoda Grona: Utrwalenie preparatu>fiolet krystaliczny>plyn Lugola>odbarwienie roztworem alkoholu>fuksyna zasadowa.
Barwienie negatywne - kontrast miedzy ciemnym tlem a nie zabarwionymi komorkami. Uzywa się tuszu chinskiego lub migrozyny. Po wysuszeniu preparatu nie utrwala się lecz bezposrednio oglada pod mikroskopem.
Pożywki
Pożywki
Badanie i obserwacja drobnoustrojów w warunkach sztucznych, laboratoryjnych, jest możliwa dzięki hodowli mikroorganizmów na pożywkach, zwanych inaczej podłożami.
Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach pozwala na wyosobnienie czystych kultur, na prowadzenie badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych, diagnostycznych oraz wszelkiego rodzaju hodowli doświadczalnych
Pożywka jest mieszaniną roztworów odpowiednio dobranych składników
Pożywka powinna spełniać następujące warunki:
Zapewnić odpowiednią ilość przyswajalnych składników pokarmowych, zarówno organicznych, jak i nieorganicznych
Zawierać określone czynniki wzrostowe
Mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne
Zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp tlenu
Wykazywać właściwe pH
Nie ma uniwersalniej pożywki dla wszystkich drobnoustrojów
Podłoża dla autotrofów są nieskomplikowane, zawierają tylko związki mineralne
Heterotrofy mają już większe wymagania, które można zaspokoić dodając kompleksowe substancje np. ekstrakt mięsny, pepton, ekstrakt drożdżowy.
Składniki pożywek
Substancje odżywcze
Źródło węgla
Najłatwiej przyswajalnym źródłem węgla i energii dla drobnoustrojów są cukry (glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza). Dodatek cukru do pożywki może służyć celom diagnostycznym lub wybiórczym, gdyż dany gatunek wykorzystuje określony rodzaj cukru. Zawartość cukru w pożywce waha się w ilości 0,5-2%.
Źródło azotu
Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych (sole amonowe, wodorotlenek amonu, azotany). Niektóre drobnoustroje mogą pobierać wolny azot z powietrza, a także azot ze związków organicznych (ekstrakty
z tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz hydrolizaty białek). Dodatek związków białkowych do pożywek wynosi 0,5-2%
Do źródeł azotu zaliczamy:
Ekstrakty mięsne - wodne wyciągi
z tkanki mięsnej, serc i wątroby (źródło N, węglowodanów i witamin)
Ekstrakty drożdżowe - źródło N, C, witaminy z grupy B
Peptony - produkty częściowej, enzymatycznej hydrolizy białka (źródło N, witamin i węglowodanów)
Hydrolizaty enzymatyczne lub kwasowe białek mięsa, kazeiny, nasion soi - bogate źródło aminokwasów,
Czyste białka (kazeina) oraz białka rodzime (białka jaja, surowicy krwi)
Wolne aminokwasy - czasami dodawane do podłoża
Sole mineralne
Dodawane do pożywek w niewielkich ilościach, są źródłem składników nieorganicznych: fosforu siarki, potasu, sodu, magnezu, żelaza i in. Niektóre z tych soli regulują ciśnienie osmotyczne (NaCl) lub działają buforująco i utrzymują właściwy odczyn pożywki (fosforany potasu)
Czynniki wzrostowe
Wprowadza się je do podłoża w postaci roztworów syntetycznych witamin (kosztowne) lub w formie wyciągu mięsnego, wątrobowego i drożdżowego, a także wyciągów roślinnych (sok pomidorowy, ekstrakt glebowy i ziemniaczany)
Związki korygujące pH
Większość bakterii rośnie w pH obojętnym lub lekko alkalicznym (6,8-7,4). Grzyby preferują środowisko lekko kwaśne
(pH 5-6). Korektę pH pożywek przeprowadza się najczęściej za pomocą 1-5 M roztworów NaOH i HCl
Substancje różnicujące i wybiórcze
Wprowadzone do podłoża czynniki różnicujące ulegają pod wpływem mikroorganizmów modyfikacji lub rozkładowi, co uwidacznia się zmianą barwy kolonii podłoża, lub powstaniu strefy przejaśnienia
Czynniki wybiórcze (sole kwasów żółciowych, niektóre barwniki) hamują rozwój pewnych grup bakterii umożliwiając rozwój tylko określonej grupie drobnoustrojów
2. Czynniki zestalające (pozwalają one na uzyskanie pożywek w formie stałej) Agar-agar
Jest to dostępny handlowo w formie proszku lub włókien, wielocukier otrzymywany
z glonów morskich. Odznacza się właściwościami żelującymi, silnie chłonie wodę
i w zależności od stopnia oczyszczenia upłynnia się w temp. 90-100°C, a zestala się w temp.
45 -48°C. W celu zestalenia podłoża wystarczy 1,5-3% agaru.
Składniki pożywek
Żelatyna
Jest to substancja białkowa, która powstaje w wyniku hydrolizy kolagenu, może być zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne (upłynnienie pożywki). Jako czynnik zestalający pożywkę dodaje się w ilości 12-15%
Rodzaje pożywek
Kryteria podziału pożywek:
Skład chemiczny i pochodzenie składników
Zawartość składników
Cel hodowli (zastosowanie i funkcja podłoża)
konsystencja
Podział pożywek w zależności od składu podłoża
Naturalne - przygotowane wprost
z surowca roślinnego lub zwierzęcego,
w sposób zapewniający jego jałowość, np.. Mleko, serwatka, bulion
Syntetyczne - wykonane z dokładnie określonych związków chemicznych,
o znanym składzie jakościowym i ilościowym. Należą tu podłoża mineralne dla autotrofów
Półsyntetyczne - podłoża syntetyczne z dodatkiem wyciągów z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, np.. Mleko z lakmusem
Ze względu na zawartość składników rozróżnia się podłoża:
Podstawowe (zwykłe) - stanowią bazę do przygotowania innych pożywek, np. bulion zwykły, brzeczka
Wzbogacone - to podłoża podstawowe wzbogacone dodatkowymi składnikami odżywczymi np.. Bulion odżywczy, agar
z krwią. Podłoża wzbogacone umożliwiają wzrost większości drobnoustrojów
Zależnie od celów, jakie mają spełnić określone podłoża, dzielimy na:
Namnażające lub namnażająco-wybiórcze - stosujemy wówczas, gdy liczba drobnoustrojów w badanej próbie jest niewielka lub poszukiwany drobnoustrój występuje z inna mikroflorą towarzyszącą.
Selektywne (wybiórcze)- zawierają składniki wybiórcze (oprócz składników odżywczych), hamujące wzrost drobnoustrojów przeszkadzających bez wpływu na pożądane
Zależnie od celów, jakie mają spełnić określone podłoża, dzielimy na:
Różnicujące -zawiera oprócz składników odżywczych substancję diagnostyczną, która może być enzymatycznie rozłożona tylko przez określone gatunki drobnoustrojów. Są to podłoża stałe, np.. Agar z krwią, Endo
Testowe - służą do oznaczenia witamin, aminokwasów i antybiotyków przy pomocy mikroorganizmów. Testowany czynnik nie występuje w podłożu co jest podstawą oznaczenia
Zależnie od celów, jakie mają spełnić określone podłoża, dzielimy na:
Identyfikacyjne (diagnostyczne) - na nie przesiewa się kolonie drobnoustrojów z poprzednich podłoży, umożliwiają identyfikację wyizolowanych szczepów w zależności od potrzeb gatunku, rodzaju czy określonej grupy, na podstawie określonych reakcji biochemicznych zachodzących pod wpływem danego organizmu
Podłoża pod względem konsystencji dzielimy na:
Płynne - powinny być klarowne, a więc składniki muszą być całkowicie rozpuszczone, np.. bulion płynny, brzeczka
Półpłynne - z dodatkiem 0,1-0,8% agaru
Stałe - zestalone za pomocą agaru lub żelatyny na płytce Petriego w postaci jednolitej, gładkiej warstwy bądź też
w postaci słupka lub skosu w probówce
Wzrost i charakter drobnoustrojów w pożywkach płynnych
Bezwzględne tlenowce - rosną na powierzchni pożywki w postaci pierścienia, błonki lub kożucha utworzonych z komórek. Kożuch może być biały, zabarwiony, suchy, sfałdowany, jednolity lub rozpadający się
Względne beztlenowce - charakteryzuje wzrost dyfuzyjny, objawiający się jednolitym zmętnieniem całej objętości pożywki
Wzrost i charakter drobnoustrojów w pożywkach płynnych
3. Bezwzględne beztlenowce - rosną w postaci osadu na dnie probówki. Po wstrząśnięci osad unosi się w sposób pylisty, osiadający
4. Mikroareofile - rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym oddaleniu od powierzchni probówki
Wzrost bakterii w hodowlach płynnych
Charakterystyka wzrostu kolonii bakterii na płytce Petriego
Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem, wyrosłe najczęściej z jednej komórki. W standardowych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami, uwzględnianymi w diagnostyce. Obserwacje kolonii przeprowadza się przy pomocy lupy lub binokularu.
Na podłożu Wilson-Blaira kolonie szczepów Salmonella rosną na kolor czarny , z metalicznym połyskiem, podłoża pod koloniami są wybarwione na brunatno
Czyste kultury bakteryjne
Pod pojęciem czystych kultur bakteryjnych należy rozumieć kolonie powstałe z pojedynczych komórek drobnoustroju.
Badania diagnostyczne, fizjologiczne i morfologiczne można prowadzić tylko na czystych kulturach.