Ćwiczenie nr 4

mgr Bożena Kuran

Równowaga kwasowo-zasadowa w organizmie, bufory

Repetytorium

1. Woda i jej podział w ustroju. Różnice w składzie jonowym płynów ustrojowych.

2. Ciśnienie osmotyczne, prawa osmozy.

3. Bufory, pojemność buforowa, obliczanie pH i pojemności buforowej, wpływ rozcieńczenia na pojemność buforową.

4. Równowaga kwasowo-zasadowa w ustroju.

5. Równowaga membranowa Donnana.

Część praktyczna

1. Sporządzanie buforów: octanowego i fosforanowego i oznaczanie jego pH przy użyciu wskaźników.

2. Oznaczanie pH buforu przy użyciu pehametru.

3. Wpływ rozcieńczenia na pojemność buforową.

Repetytorium

1. Woda i jej podział w ustroju. Różnica w składzie

jonowym płynów ustrojowych

Woda jako składnik ustrojowy zajmuje ilościowo pierwsze miejsce, całkowita jej

ilość w organizmie wynosi w przybliżeniu ok. 45-65 % masy ciała. Woda wypełnia praktycznie cały ustrój, nawet tak „suche” tkanki jak tkanka kostna i tłuszczowa zawierają jej ok. 20 %. Ogromne znaczenie wody dla organizmów żywych przejawia się m.in. w tym, że stanowi środowisko, w którym przebiega większość niezbędnych dla życia reakcji chemicznych oraz odbywa się transport cząsteczek do miejsca, gdzie te reakcje mogą zachodzić.

Większość wody zawartej w ustroju stanowi rozpuszczalnik dla nieorganicznych i organicznych cząsteczek i jonów, a razem z białkami, tłuszczami i węglowodanami tworzy układy koloidalne właściwe strukturze komórkowej, a niezbędne dla prawidłowego przebiegu zjawisk biologicznych. Tylko dzięki odpowiedniej zawartości wody w komórkach możliwe jest zachowanie prawidłowych struktur cząsteczkowych i właściwości biochemicznych białek i kwasów nukleinowych, jonizacja związków organicznych itp. Dlatego też utrata niewielkiej ilości wody ok. 5 % prowadzi do zaburzeń w funkcji organizmu, utrata natomiast ok. 20 % nawet do jego śmierci.

Cały zasób wody ustrojowej i rozpuszczonych w niej jonów nieorganicznych jest rozdzielony między dwa obszary:

Płyn wewnątrzkomórkowy (śródkomórkowy) (ICF - intracellular fluid) obejmuje 2/3 całkowitej ilości wody. Stanowi środowisko dla wytwarzania, magazynowania i wykorzystania energii, procesów samonaprawczych, replikacji i wykonywania określonych funkcji komórki.

Płyn zewnątrzkomórkowy (pozakomórkowy) (ECF - extracellular fluid) zawiera 1/3 wody ustrojowej. Rozdzielony jest między osocze krwi i płyn śródmiąższowy. Ten płyn jest układem dostawczym. Tą drogą dostarczane są do komórek składniki odżywcze (np. glukoza, kwasy tłuszczowe, aminokwasy, tlen, jony, hormony). Płyn pozakomórkowy usuwa dwutlenek węgla, substancje odpadowe, składniki toksyczne ze środowiska komórek.

Różnica w składzie jonowym obu płynów jest bardzo znaczna. Środowisko wewnętrzne komórki jest bogate w kationy K⁺ i Mg⁺² a podstawowym anionem jest anion fosforanowy. Jest tutaj także kilkadziesiąt razy więcej białka i znacznie mniej glukozy. Płyn pozakomórkowy charakteryzuje się dużą zawartością kationów Na⁺ i Ca⁺² a podstawowym anionem jest Cl^-. Stężenie glukozy jest tutaj znacznie większe a białka znacznie mniejsze. Żeby utrzymać tę różnicę komórki utworzyły bariery - błony z wbudowanymi w nie pompami.

>Życie powstało w wodzie. Pierwotne oceany były bogate w jony K⁺ i Mg⁺², tak jak wnętrze komórek, sprzyjało to procesom enzymatycznym. Stopniowo skład zbiorników wodnych na ziemi zmieniał się, zaczęły przeważać jony Na⁺ i Ca⁺². Konieczne byłyby ogromne zmiany w budowie już powstałych komórek, zamiast tego komórki wytworzyły bariery - błony.<

Stały stosunek kationów K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ zapewnia stan równowagi jonowej niezbędny dla prawidłowych funkcji organizmu. Wszelkie zmiany w równowadze jonowej prowadzą do zaburzeń w procesach fizjologicznych różnych narządów, a w szczególności układu nerwowego.

Rozmieszczenie jonów po obu stronach błony komórkowej jest regulowane przez procesy transportu czynnego (pompa jonowa). Transport czynny odbywa się przeciwko gradientowi elektrochemicznemu i wymaga nakładu energii ze strony komórki. Energia uzyskana z hydrolizy ATP (proces katalizowany przez odpowiednie enzymy zwane ATP-azami) umożliwia przechodzenie odpowiednich jonów do środowiska odpowiednio jeszcze bardziej elektrododatniego lub elektroujemnego. Na drodze transportu czynnego odbywa się m.in. transport jonów K⁺ i Na⁺, który można zapisać następująco:

gdzie: symbol „w” oznacza wewnątrzkomórkową lokalizację jonu

symbol „z” oznacza zewnątrzkomórkową lokalizację jonu

P - fosforan nieorganiczny

E - energia

2. Ciśnienie osmotyczne, prawa osmozy

Osmoza to zjawisko polegające na samorzutnym przechodzeniu cząsteczek rozpuszczalnika przez błonę półprzepuszczalną, oddzielającą rozpuszczalnik od roztworu. Błonami półprzepuszczalnymi są błony komórkowe, nieprzepuszczalne dla substancji wielokocząsteczkowych obecnych w płynie komórkowym, ale przepuszczalne dla cząsteczek wody.

W organizmie żywym procesy osmozy warunkują prawidłowy poziom jonów w określonych przestrzeniach. Między innymi osmoza i towarzyszące temu zjawisku ciśnienie osmotyczne, są odpowiedzialne za stałość środowiska wewnętrznego, warunkującą prawidłowe funkcjonowanie komórek, narządów i całego organizmu. Ciśnienie osmotyczne zależy od stężenia substancji, temperatury i rodzaju substancji, a w szczególności czy rozpatrywana substancja jest elektrolitem czy nie.

Ciśnienie osmotyczne wyraża wzór:

Π = T R i c

Π - ciśnienie osmotyczne [atm]

c - stężenie molowe [mol/dm³]

R - stała gazowa [0.083 dm^{3 .} atm/mol ^. K]

T - temperatura [K]

i - współczynnik van't Hoffa, dla elektrolitów równy liczbowo ilości jonów na jakie dany elektrolit dysocjuje, a dla nieelektrolitów zawsze równy jedności.

Roztwory wywierające jednakowe ciśnienia osmotyczne nazywamy roztworami izotonicznymi.

Jeżeli zachodzi konieczność podania choremu płynów bezpośrednio do naczynia krwionośnego, to musi to być roztwór izotoniczny względem surowicy, w którym krwinki czerwone nie ulegają zmianom morfologicznym. Roztworem takim jest m.in. 0,9 % roztwór NaCl (roztwór fizjologiczny). Jest on płynem izotonicznym z płynami ustrojowymi, ale nie izojonowym.

Roztwór hipertoniczny to roztwór o wyższym ciśnieniu osmotycznym niż roztwór po drugiej stronie błony. Roztwór o niższym ciśnieniu osmotycznym od roztworu porównywanego nazywany jest roztworem hipotonicznym.

Kierunek przepływu wody przez błonę półprzepuszczalną odbywa się zgodnie ze schematem:

C1

C2

C₁ < C₂, po obu stronach błony znajduje się ta sama substancja, T=const

Woda zawsze przepływa w kierunku roztworu hipertonicznego. Jest to tzw. transport bierny gdyż odbywa się zgodnie z gradientem stężeń, czyli z przestrzeni o niższym stężeniu osmotycznym do przestrzeni o wyższym stężeniu, aż do momentu wyrównania stężeń. Z tego względu woda przenika swobodnie przez większość błon komórkowych.

3. Bufory, pojemność buforowa, obliczanie pH i pojemności buforowej. Wpływ rozcieńczenia na pojemność buforową.

Roztwory buforowe

Roztwory buforowe są to mieszaniny słabych kwasów i ich soli z mocnymi zasadami lub roztwory słabych zasad i ich soli z mocnymi kwasami. Rolę buforów spełniają również roztwory wodorosoli. Charakterystyczną właściwością roztworów buforowych jest to, że po dodaniu niewielkich ilości mocnych kwasów lub zasad nieznacznie zmieniają swoje pH.

Przykłady roztworów buforowych:

CH₃COOH/CH₃COONa - bufor octanowy

H₂CO₃/NaHCO₃ - bufor węglanowy

KH₂PO₄/K₂HPO₄ - bufor fosforanowy

NH₃aq/NH₄Cl - bufor amonowy

Utrzymanie stałej wartości pH jest bardzo ważne dla fizjologii każdego organizmu. Odczyn środowiska jest czynnikiem decydującym o aktywności enzymów i przebiegu reakcji enzymatycznych, co ma wpływ na prawidłowy przebieg metabolizmu żywej komórki. W komórkach znajduje się wiele substancji (sole mineralne, rozpuszczalne białka, kwasy organiczne i inne), które tworzą układy buforujące.

Głównym czynnikiem regulującym pH organizmu jest osocze krwi, w którym działają równocześnie trzy układy buforowe: bufor wodorowęglanowy, bufor fosforanowy i bufor białczanowy - białko/aniony białek oraz bufor hemoglobinianowy obecny tylko w erytrocytach.

pH buforów określa wzór Hendersona - Hasselbacha:

gdzie:

pK_a = -log K_a, K_a - stała dysocjacji słabego kwasu

c_s - stężenie soli

c_kw - stężenie kwasu

Wyrażenia na pH wybranych buforów:

bufor węglanowy

bufor fosforanowy

bufor amonowy

gdzie:

pK_b = -log K_b, K_b - stała dysocjacji zasadowej amoniaku

albo:

gdzie:

pK_a = -log K_a, K_a - stała dysocjacji kwasowej amoniaku

Podane powyżej wzory stosuje się tylko dla roztworów rozcieńczonych.

Dla roztworów o stężeniach wyższych od 0.01M, konieczne jest uwzględnienie poprawki i wzór przyjmuje postać:

gdzie:

A - stała Debye'a i Hückla

I - moc jonowa,

c_i - stężenie danego jonu

z_i - ładunek danego jonu

Mechanizm działania buforów

bufor octanowy:

CH₃COO^- + H₃O⁺↔ CH₃COOH + H₂O

CH₃COOH + OH^-↔ CH₃COO^- + H₂O

bufor fosforanowy:

H₂PO₄^- + OH^-↔ HPO₄^2- + H₂O

HPO₄^2- + H₃O⁺↔ H₂PO₄^- + H₂O

bufor węglanowy:

H₂CO₃+ OH^-↔ HCO₃^- + H₂O

HCO₃^- + H₃O⁺↔ H₂CO₃+ H₂O

↓

H₂O + CO₂

bufor amonowy:

NH_3aq + H₃O⁺↔NH₄⁺ + H₂O

NH₄⁺ + OH^- ↔ NH_3aq + H₂O

Pojemność buforowa

Właściwość utrzymania określonej wartości pH przez roztwór buforowy po wprowadzeniu z zewnątrz jonów H⁺ i OH^- jest ograniczona. Po wprowadzeniu nadmiaru tych jonów mogą zostać całkowicie wyczerpane wiążące je składniki buforu i wówczas następuje wyraźna zmiana pH. Roztwór ulega alkalizacji lub zakwaszeniu w zależności od tego jakie jony zostały wprowadzone.

Stabilizujące pH działanie roztworu buforowego, zależy od jego pojemności buforowej, którą określa się jako zdolność wiązania jonów H⁺ i OH^-.

Miarą pojemności buforowej jest stosunek ilości moli dodanego kwasu lub zasady do 1 dm³ buforu do zmiany pH, jaką wywołał dodatek tego kwasu bądź zasady.

gdzie:

A - pojemność buforowa

Δn - liczba moli dodanego kwasu lub zasady

ΔpH - zmiana pH

Pojemność buforowa zależy od stężenia roztworu. Im wyższe jest stężenie tym układ jest bardziej odporny na działanie kwasu bądź zasady, czyli wykazuje większą pojemność buforową.

4. Równowaga kwasowo-zasadowa w ustroju

Równowaga kwasowo-zasadowa gwarantuje, że w organizmie utrzymywane są stałe stężenia jonów wodorowych w przestrzeniach wodnych. Stężenie kationów H⁺ w płynach ustrojowych zależy pośrednio od nasilenia procesów katabolicznych w organizmie, a bezpośrednio od dysocjacji kwasów. W żywym organizmie produktami przemiany materii są głównie kwasy lotne - czyli kwas węglowy, reprezentowany przez CO₂ pochodzący z procesów dekarboksylacji, oraz kwasy nielotne. Należą do nich kwasy organiczne np. mlekowy, pirogronowy, moczowy oraz nieorganiczne np. kwas siarkowy - pochodzący z przemian aminokwasów siarkowych, także kwas fosforowy - pochodzący z przemian fosfolipidów, fosfoprotein a także mononukleotydów. Natomiast w płucach istotnym źródłem jonów H⁺ jest oksyhemoglobina. Przyłączeniu 4 cząsteczek tlenu do hemoglobiny towarzyszy odłączenie 2 jonów H⁺ od oksyhemoglobiny. Przyjmuje się, że 1 mol oksyhemoglobiny uwalnia 0,7 mola jonów H⁺. W warunkach fizjologicznych stężenie kationów H⁺ w przestrzeniach wodnych ustroju jest bardzo niskie w porównaniu z innymi jonami. W płynie wewnątrzkomórkowym stężenie jonów wodorowych wynosi około 100 nmol/l czemu odpowiada wartość pH około 7. W komórkach o zredukowanym metabolizmie stężenie kationów wodorowych jest niższe i wynosi około 65 nmol/l. W płynie pozakomórkowym stężenie jonów wodorowych utrzymywane jest w granicach od 35 do 45 nmol/l któremu odpowiada wartość pH od 7,35-7,45. W warunkach fizjologicznych pH ulega tylko nieznacznym zmianom, które są szybko wyrównywane dzięki sprawnie działającym mechanizmom regulującym. Stałość środowiska wewnętrznego czyli homeostazę zapewniają trzy czynniki:

• układy buforowe krwi

• układ oddechowy

• czynność nerek.

W różnych stanach chorobowych obserwowany zakres zmian stężeń jonów wodorowych we krwi mieści się w granicach od 160 do 20 nmol/l, czemu odpowiadają wartości pH w zakresie 6,8 - 7,7. Stan, w którym równowaga kwasowo-zasadowa ma tendencję do przesunięcia się w stan wartości pH niższych od normalnego, nazywa się kwasicą (acidosis), a stan w którym istnieje tendencja przeciwna, określa się jako zasadowicę (alcalosis).

Ocenę równowagi kwasowo-zasadowej przeprowadza się na podstawie pomiaru niektórych tylko parametrów tej równowagi, czyli pH i pCO₂ - tzw. badanie gazometryczne krwi tętniczej. W ciągu doby człowiek wytwarza aż 15 - 20 moli CO₂ i tyle samo wydala go przez płuca. Dwutlenek węgla powstający podczas metabolizmu w mitochondriach dostaje się drogą dyfuzji do cytoplazmy, po czym do płynu śródmiąższowego, dalej do płynu wewnątrznaczyniowego, skąd (z osocza) dyfunduje do erytrocytów. W erytrocytach pod wpływem specyficznego enzymu anhydrazy węglanowej następuje uwodnienie dwutlenku węgla do H₂CO₃. Dalej kwas węglowy dysocjuje do H⁺ i HCO₃^-. Anhydraza węglanowa poza erytrocytami występuje także w cytoplazmie komórek nerkowych, komórek okładzinowych błony śluzowej żołądka i komórek trzustki. W zależności od rodzaju i stanu funkcjonalnego komórek, w których występuje anhydraza węglanowa, jony H⁺ mogą być wydzielane poza komórki albo wiązane z anionami wewnątrzkomórkowymi. Aniony HCO₃^- są z reguły usuwane z tych komórek na drodze wymiany z Cl^-. Wymiana jonów zachodzi w stosunku 1:1 ma zatem charakter elektroobojętny.

Ilość nielotnych kwasów powstających w organizmie i przyjętych z pożywieniem w ciągu doby wynosi średnio 70 mmol/24 godziny. Jednocześnie taka sama ilość nielotnych kwasów zostaje wydalona z moczem w ciągu doby, przede wszystkim jako kationy NH₄⁺ i aniony H₂PO₄^-.

Podstawowymi roztworami buforowymi organizmu człowieka są: bufor wodorowęglanowy, bufor hemoglobinowy, bufor fosforanowy i bufory białczanowe. Większość uwalnianych jonów H⁺ w płynach ustrojowych jest natychmiast przyłączana przez składniki anionowe buforów białczanowych i fosforanowych w przestrzeni wewnątrzkomórkowej, natomiast w przestrzeni pozakomórkowej głównie przez HCO₃^- buforu wodorowęglanowego.

Bufor wodorowęglanowy H₂CO₃/NaHCO₃

Bufor wodoroweglanowy jest najważniejszym elementem równowagi kwasowo-zasadowej, zarówno ze względów ilościowych, jak i z uwagi na fakt, że jest najbardziej podatny na oddechowe i metaboliczne mechanizmy regulacyjne. Z całej puli dwutlenku węgla powstającego w organizmie około 75 % wchodzi w reakcje z wodą (reakcję katalizowaną przez anhydrazę węglanową), której produktami są jony H⁺ i HCO₃^-.

(tkanki)

Około 15 % dwutlenku węgla tworzy połączenia karbaminianowe z wolnymi grupami α-aminowymi N-terminalnych reszt waliny łańcuchów polipeptydowych, szczególnie hemoglobiny.

Jedynie 5 % dwutlenku węgla jest transportowane w postaci gazu fizycznie rozpuszczonego w wodzie przestrzeni wewnątrznaczyniowej.

Bufor wodorowęglanowy działa w organizmie w układzie otwartym, bezwodnik kwasu węglowego CO₂ jest usuwany przez płuca. W ten sposób kontrolowane jest stężenie kwasu. Natomiast poziom drugiego składnika kontrolowany jest działaniem nerek (poprzez resorpcję i regenerację HCO₃^-).

Transport dwutlenku węgla odbywa się dzięki dyfuzji zgodnej z gradientem stężeń CO₂ po obu stronach bariery pęcherzykowo-włośniczkowej, który jest utrzymywany poprzez perfuzję naczyń krwionośnych płuc i wentylację pęcherzyków płucnych. Wentylacja, a zatem eliminacja CO₂ są regulowane za pośrednictwem ośrodka oddechowego, którego chemoreceptory są wrażliwe na pCO₂ i pH krwi. Poprzez ten mechanizm narząd oddechowy może w szerokim zakresie regulować wydalanie CO₂ i przez to wpływać na równowagę kwasowo-zasadową. Wzrost bowiem ilości CO₂ wskutek niedostatecznej wymiany gazów w płucach powoduje obniżenie wartości pH. Stan taki występuje w tzw. kwasicy oddechowej. Spadek zaś CO₂ obserwowany podczas m.in. nadmiernej wentylacji płuc pociąga za sobą wzrost wartości pH krwi - zasadowica oddechowa. Regulacja metaboliczna równowagi kwasowo-zasadowej przede wszystkim sprowadza się do eliminacji jonów H⁺ poprzez nerki oraz do zapewnienia odpowiedniej ilości podstawowej zasady tego buforu - jonów HCO₃^-. Spadek ilości jonów HCO₃^- m.in. w następstwie nagromadzenia lub wytwarzania w ustroju nadmiaru niektórych kwasów (np. w cukrzycy) wywołuje obniżenie wartości pH krwi. Stan taki określany jest mianem kwasicy metabolicznej. Stan przeciwny czyli zasadowica metaboliczna występuje wówczas, gdy ilość jonów HCO₃^- w organizmie wzrasta powyżej wartości prawidłowej. Stan ten może wystąpić m.in. w następstwie spożywania substancji o charakterze zasadowym.

Bufor hemoglobinianowy KHbO₂/HHb

Bufor hemoglobinianowy współdziała z buforem wodorowęglanowym w regulacji równowagi kwasowo-zasadowej. Hemoglobina zawiera aż 38 reszt histydynowych, których pierścienie imidazolowe biorą bezpośredni udział w wiązaniu i uwalnianiu jonów H⁺. Bogactwo w reszty histydynowe hemoglobiny sprawia, że ma ona sześciokrotnie większy udział w buforowaniu płynu pozakomórkowego niż białka osocza. Oksyhemoglobina jest mocniejszym kwasem (pK=6,81) niż deoksyhemoglobina (pk=8,03). W płucach mol oksyhemoglobiny wiąże 0,7 mola jonow H⁺. Działanie hemoglobiny jako buforu jest zatem uzależnione od jej funkcji jako transportera tlenu. Procentowe nasycenie hemoglobiny tlenem jest zależne od pO₂ w osoczu. Przy ciśnieniu tlenu powyżej 60 mmHg nawet znaczne zmiany ciśnienia wywołują tylko małe różnice w nasyceniu tlenem hemoglobiny, co sprzyja prawie maksymalnemu pobieraniu tlenu w płucach. Jednak przy ciśnieniu parcjalnym niższym niż 60 mmHg zdolność wiązania tlenu gwałtownie spada. Sprzyja to uwalnianiu tlenu na obwodzie, natomiast utrudnia lub uniemożliwia pobieranie O₂ w płucach z powietrza o niskim pO₂. Jak już wiadomo CO₂ z tkanek dyfunduje do krwi, w erytrocytach powstaje z niego H₂CO₃, który dysocjuje na jon H⁺ i HCO₃^-. Zakwaszenie powoduje zmniejszenie powinowactwa hemoglobiny do tlenu w tkankach czego konsekwencją jest oddawanie tlenu tkankom, a wiązanie przez hemoglobinę jonów H⁺ które transportuje do płuc. Ten mechanizm wyrównania stężenia jonów H⁺ w erytrocytach nazywa się efektem Bohra. Jon HCO₃^- dyfunduje do osocza na wymianę z jonem Cl^-, stanowiąc stałe źródło uzupełniające poziom podstawowej zasady buforującej krwi. W naczyniach włośniczkowych płuc reakcje przebiegają w kierunku przeciwnym niż w innych tkankach. Z hemoglobiny powstaje oksyhemoglobina, mocniejszy kwas od którego oddysocjowują jony H⁺. Uwolniony jest także CO₂ z połączeń karbaminianowych. Aniony HCO₃^- przechodzą z osocza do erytrocytów na wymianę z jonami Cl^-. Powstały H₂CO₃ jest rozkładany przy udziale anhydrazy węglanowej do CO₂ i H₂O. Dwutlenek węgla dyfunduje do powietrza pęcherzykowego. Stężenie anionów HCO₃^- maleje. Działanie układu hemoglobinianowego sprowadza się więc do wiązania jonów H⁺ powstających w wyniku dysocjacji kwasu węglowego:

(tkanki)

oraz uwalniania CO₂

(płuca)

Zachodzą również reakcje pomiędzy układami buforowymi, które dostarczają jonów H⁺ i powodują dalsze (20-25 %) obniżenie poziomu anionów HCO₃^-:

Bufor fosforanowy H₂PO₄^-/HPO₄^2-.

Bufor fosforanowy jest buforem przestrzeni wewnątrzkomórkowej, stanowi około 6 % pojemności buforowej krwi. Dla buforu fosforanowego w zakresie pH około 7 ważna jest stała równowagi następującej reakcji:

W buforze fosforanowym krwi, którego pH =7,4 stosunek stężeń fosforanu II-rzędowego do fosforanu I-rzędowego wynosi 4:1.

HPO₄^2-/H₂PO₄^- = 4/1

Fosforany obecne w moczu pierwotnym warunkują wydalanie jonów H⁺ oraz powstawanie wodorowęglanów w nerkach. Bufor fosforanowy jest najważniejszym pod względem ilościowym buforem moczu, biorącym udział w wytwarzaniu kwaśności miareczkowej (kwaśność miareczkowa określa wydalanie jonu H⁺, wydalanego przez nerki w postaci NaHPO₄). W buforze fosforanowym moczu (pH około 6) stosunek stężeń fosforanu II-rzędowego do fosforanu I-rzędowego wynosi 1:4.

HPO₄^2-/H₂PO₄^- = ¼

Zmiana stosunku fosforanów w buforze fosforanowym moczu w porównaniu z ich stosunkiem w buforze krwi wynika ze zmiany fosforanu II-rzędowego w fosforan I-rzędowy na skutek wiązania jonów wodorowych wydzielanych przez kanaliki dystalne i zbiorcze podczas zaoszczędzania zasad przez nerki.

Wydalanie z moczem nadmiernych ilości fosforanów I-rzędowych (H₂PO₄^-) podwyższa pH krwi, natomiast nadmierne wydalanie fosforanów II-rzędowych (HPO₄^2-) obniża pH krwi. Zwiększone wydalanie jonów fosforanowych z moczem następuje w nadczynności przytarczyc. Fosforany tylko częściowo są resorbowane w kanalikach nerkowych. Jeżeli mocz ma odczyn alkaliczny, jony fosforanowe łatwo reagują z obecnymi w moczu jonami wapniowymi i magnezowymi tworząc nierozpuszczalne sole - będące najczęstszą przyczyną kamieni nerkowych.

5. Równowaga membranowa Donnana

Dowolna próbka płynu pobranego z organizmu żywego zawiera dokładnie równoważne ilości jonów dodatnich i ujemnych. Zasada elektroobojętności jest spełniona w organizmie także dla układów sąsiadujących ze sobą, ale oddzielonych od siebie błonami półprzepuszczalnymi dla jonów, a nieprzepuszczalnych dla wielocząsteczkowych biopolimerów.

Białka, jako wielkocząsteczkowe koloidy, nie mogą przenikać przez błony półprzepuszczalne, ale dzięki występowaniu w formie kationów lub anionów wpływają na rozmieszczenie dyfundujących przez błony półprzepuszczalne elektrolitów.

Dla przestrzeni oddzielonych błonami, które nie pozwalają na przechodzenie np. anionów białczanowych, zasada elektroobojętności jest spełniana nieco inaczej, a mianowicie: z tej strony, z której znajdują się jony koloidalne niezdolne do dyfuzji, stężenie jonów dyfundujących tego samego znaku, co polielektrolitu (anionu białczanowego), jest zawsze mniejsze, a stężenie jonów przeciwnego znaku większe, w porównaniu do stężeń jonów z sąsiadującej przestrzeni. To zjawisko, polegające na nierównomiernym rozmieszczeniu dyfundujących jonów elektrolitu, gdy w jednej z dwóch sąsiadujących i oddzielonych błoną przestrzeni znajdują się nie dyfundujące jony koloidalne, nazywamy równowagą Donnana.

Konsekwencje istnienia równowagi Donnana dla żywego organizmu

1. Skład elektrolitowy przestrzeni śródmiąższowej różni się od składu elektrolitowego osocza. Czynnikiem decydującym o różnicy stężeń jonów elektrolitu jest różna zawartość białek o charakterze polianionu. W osoczu, w którym stężenie białka jest dużo większe niż w płynie śródmiąższowym, stężenia anionów (Cl^-, HCO₃^-, anionów kwasów organicznych) przechodzących przez błonę są znacznie mniejsze niż w płynie śródmiąższowym.

2. Stężenia kationów, głównie H⁺, są dużo większe w krwince czerwonej niż w osoczu, bo stężenie białka o charakterze polianionu jest większe w erytrocycie niż w osoczu, stąd pH w erytrocycie jest niższe (7,19) niż pH osocza (7,4).

3. Istnienie równowagi Donnana ma także wpływ na wchłanianie leków występujących w postaci jonów. Jeżeli na przykład substancje leczniczą w postaci anionu podajemy pacjentowi doustnie, a stężenie anionu nie przechodzącego przez błonę jest w przewodzie pokarmowym dużo większe od analogicznego stężenia w osoczu, to substancja lecznicza (anion) zgodnie z równowagą Donnana będzie występowała w wyższym stężeniu w osoczu niż w przewodzie pokarmowym. W tym przypadku wchłanianie leku, np. z żołądka czy jelita do krwi będzie ułatwione.

Część praktyczna

1. Sporządzanie buforów: octanowego i fosforanowego i oznaczanie jego pH przy użyciu wskaźników.

2. Oznaczanie pH buforu przy użyciu pehametru.

3. Wpływ rozcieńczenia na pojemność buforową.

1. Sporządzanie buforów: octanowego i fosforanowego

i oznaczanie jego pH przy użyciu wskaźników.

Roztwory podstawowe

Bufor fosforanowy Bufor octanowy

A-1/15M Na₂ HPO₄ A- 0.2M CH₃COONa

B- 1/15M KH₂PO₄ B- 0.2M CH₃COOH

nr	A[cm^3]	B[cm^3]		nr	A[cm^3]	B[cm^3]
1.	7.40	32.60			1.	7.20	32.80
2.	10.60	29.40			2.	10.60	29.40
3.	15.00	25.00			3.	14.80	25.20
4.	20.00	20.00			4.	19.60	20.40
5.	24.40	15.60			5.	24.00	16.00
6.	28.60	11.40			6.	28.20	11.60
7.	32.20	7.80			7.	31.60	8.40

a. Z roztworów podstawowych przygotować roztwór buforowy zgodnie z numerem podanym przez asystenta według powyższych tablic.

2. Wyznaczyć orientacyjną wartość pH buforu za pomocą papierka wskaźnikowego.

3. Ustalić wartość pH otrzymanego roztworu buforowego za pomocą zestawu wskaźników. Badanie wykonujemy, stosując specjalną płytkę porcelanową z zagłębieniami, do których wprowadzamy bufor, a następnie dodajemy po jednej kropli odpowiednich wskaźników.

Wskaźniki dostępne na pracowni

Wskaźnik	Barwa przy niższym pH	Zakres zmiany pH	Barwa przy wyższym pH
Błękit tymolowy (zakres kwaśny)	różowoczerwona	1.2-2.8	żółta
Odczynnik Töpfera	czerwona	2.8-4.6	żółta
Oranż metylowy	czerwona	3.1-4.4	żółta
Zieleń bromokrezolowa	żółta	3.8-5.4	ciemnoniebieska
Czerwień metylowa	czerwona	4.2-6.3	żółta
Lakmus	czerwona	5.0-8.0	niebieska
Błękit bromotymolowy	żółta	6.0-7.6	ciemnoniebieska
Czerwień krezolowa	pomarańczowa	7.2-8.8	fioletowa
Czerwień obojętna	fioletowo-czerwona	6.8-8.0	brunatna
Czerwień fenolowa	pomarańczowa	6.8-8.4	fioletowo-czerwona
Błękit tymolowy	żółta	8.0-9.6	niebiesko-fioletowa
Fenoloftaleina	bezbarwna	8.3-10.0	malinowa
Tymoloftaleina	bezbarwna	9.3-10.5	ciemnoniebieska

4. Na podstawie wzoru Hendersona-Hasselbacha wykonać obliczenie pH sporządzonego przez siebie buforu, korzystając z wartości:

dla kwasu octowego - pK_a = 4.74

dla kwasu fosforowego - pK_a = 7.21.

2. Oznaczanie pH buforu przy użyciu pehametru

Pomiar pH wykonuje się za pomocą pehametru (metodą potencjometryczną), przy użyciu dwóch elektrod: szklanej i kalomelowej.

Elektroda szklana jest elektrodą membranową i pełni funkcję elektrody wskaźnikowej. Jej potencjał zależy od stężenia jonów wodorowych.

E = E^o_sz - 0.059 pH

Budowa elektrody szklanej

Elektroda szklana zbudowana jest z rurki szklanej zakończonej cienkościenną banieczką. W środku tej rurki umieszczony jest roztwór o znanym pH (najczęściej 0.1M HCl), w którym zanurzona jest elektroda wyprowadzająca w postaci drutu pokrytego chlorkiem srebra. Koniec rurki jest umocowany hermetycznie w oprawce. Elektroda wyprowadzająca jest połączona z bolcem metalowym, który jest zewnętrznym kontaktem elektrody.

Drugą elektrodą zwaną odniesienia, o stałym potencjale jest najczęściej elektroda kalomelowa (równie popularna jest elektroda chlorosrebrowa). Elektroda kalomelowa jest elektrodą drugiego rodzaju, odwracalną względem anionu. Zbudowana jest z rurki szklanej, w której znajduje się drucik platynowy zanurzony w rtęci otoczonej osadem kalomelu Hg₂Cl_2.

Elektroda szklana zanurzona w roztworze o nieznanym pH i zestawiona z elektrodą porównawczą tworzy ogniwo o następującym schemacie:

Ag,AgCl/0,1M HCl // roztwór badany / elektroda odniesienia (NEK)

Obecnie stosuje się wygodniejszą elektrodę kombinowaną zwaną czasem zespoloną. Jest to zespół dwóch elektrod w jednej wspólnej oprawce, co upraszcza przeprowadzenie pomiaru, wykonywanego bez dodatkowej elektrody porównawczej. Elektroda kombinowana po zanurzeniu do roztworu badanego jest ogniwem, a nie półogniwem.

Do przyrządzonego wcześniej roztworu buforowego należy zanurzyć wykalibrowaną elektrodę kombinowaną. Przed i po każdym pomiarze elektrodę należy obficie opłukać wodą destylowaną i osuszyć bibułą. W czasie pracy trzeba unikać zetknięcia elektrody ze ściankami naczynka pomiarowego oraz zwracać uwagę, aby podczas pomiaru pH w badanym roztworze zanurzona była cała czynna powierzchnia elektrody. Wyznaczoną wartość pH zanotować w zeszycie.

3. Wpływ rozcieńczenia na pojemność buforową

1. Przygotować 4 suche probówki o jednakowej grubości ścian i średnicy. Pipetą odmierzyć do każdej z nich: 5,0 cm³, 2,5 cm³, 1,0 cm³, 0,5 cm³ sporządzonego przez siebie buforu, a następnie uzupełnić wodą destylowaną do łącznej objętości 5,0 cm³.

2. Znając z ćwiczenia 1 i 2 pH przygotowanego buforu, dodać do każdej probówki po 3 krople odpowiedniego wskaźnika. Porównując optycznie zabarwienie roztworów, stwierdzić jaki jest wpływ rozcieńczenia na pH roztworu.

3. W zależności od zakresu zmiany barwy użytego wskaźnika roztwory buforowe we wszystkich probówkach miareczkować mianowanym roztworem HCl lub NaOH do zmiany barwy wskaźnika. We wszystkich 4 przypadkach roztwory po miareczkowaniu powinny mieć jednakowe zabarwienie. Miareczkowanie można wykonać pipetą. Zanotować objętości zużyte do miareczkowania roztworów.

4. Obliczyć pojemność buforową dla każdego roztworu i ocenić wpływ rozcieńczenia na pojemność buforową.

Δn - liczba moli HCl lub NaOH przypadająca na 1 dm³ buforu

ΔpH - zakres zmiany barwy wskaźnika obliczamy jako różnicę pH sporządzonego roztworu przed miareczkowaniem (wartość wyznaczona z pomiaru pehametrycznego) i wartości pH na końcu miareczkowania (barwa wskaźnika odpowiada określonej wartości pH roztworu).

5. Wyniki doświadczenia wpisać do poniższej tabeli:

F. Ocenić wpływ rozcieńczenia na pH buforu i jego pojemność.

A
Δn
Vzużytego kwasu lub zasady (cm^3)
ΔpH
barwa roztworu	po reakcji
		przed reakcją
pH roztworu z pH-metru
cm^3 wody
cm^3 buforu
nr		1.	2.	3.	4.

1

---