Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie 6

CUKRY

Charakterystyczną właściwością fizyczną cukrów, umożliwiającą nawet ich identyfikację, jest ich czynność optyczna, tj. zdolność do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego.

Wszystkie cukry mają w cząsteczce tzw. węgle chiralne (atomy węgla, które mają 4 różne podstawniki). Obecność chiralnego atomu węgla powoduje asymetrię cząsteczki danego związku oraz istnienie dwóch jego izomerów, które mają się do siebie jak przedmiot i jego odbicie w lustrze i nie dają się w żaden sposób na siebie nałożyć. Izomery takie, nazwane enancjomerami lub izomerami optycznymi mają identyczne właściwości chemiczne i fizyczne, a różnią się tylko kierunkiem skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego; mają tę samą skręcalność właściwą, ale o przeciwnym znaku. Izomer prawoskrętny oznacza się (+), a lewoskrętny (-). Równomolowa mieszanina enancjomerów nie skręca płaszczyzny światła spolaryzowanego (następuje wzajemna kompensacja obu skręcalności) i nosi nazwę racematu.

Oznaczanie skręcalności właściwej. Promień światła jest zespołem fal elektromagnetycznych drgających we wszystkich możliwych płaszczyznach, prostopadłych do kierunku ich rozchodzenia się. Światło, którego drgania zostały uporządkowane w ten sposób, że odbywają się tylko w jednej płaszczyźnie, nosi nazwę spolaryzowanego. Aby uzyskać światło spolaryzowane, należy promień światła przepuścić przez pryzmat Nicola.

Gdy światło spolaryzowane (drgające tylko w jednej płaszczyźnie) przechodzi przez roztwór związku chiralnego (optycznie czynnego) związek ten powoduje skręcenie płaszczyzny światła spolaryzowanego o pewien kąt w lewo lub w prawo. Kąt skręcenia można mierzyć przy użyciu przyrządu zwanego polarymetrem. Promienie światła o falach krótkich (np. fioletowe) skręcają silniej płaszczyznę polaryzacji, a promienie o falach długich (np. czerwone) skręcają słabiej. Najczęściej używa się do pomiarów skręcalności światła żółtego linii D płomienia sodowego.

światło płaszczyzna światła optycznie czynny kąt skręcenia

spolaryzowanego związek

Rys.4. Schemat drogi promieni świetlnych w polarymetrze.

Wielkość kąta skręcania jest proporcjonalna do stężenia danej substancji, grubości warstwy roztworu oraz do temperatury (prawo Biota):

α = k c l

gdzie α − kąt skręcania, c − stężenie w g/cm³, l − długość rurki w dm, k − współczynnik

proporcjonalności, zależny od temperatury i długości fali. W temperaturze 20^°C i w świetle sodowym współczynnik proporcjonalności nazywa się skręcalnością właściwą α₀ czyli:

α = α₀ c l

α₀ =

Skręcalność właściwa jest to kąt, o który skręca płaszczyznę spolaryzowanego światla sodowego w temp. 20^°C jedno-decymetrowa warstwa roztworu zawierającego 1 g substancji w 1 cm³.

Opis budowy i sposobu użytkowania polarymetru

Światło skierowane przez lusterko oświetlające (1) (rys. 1) zostaje spolaryzowane liniowo przez polaryzator (2). Płytka (3) dzieli pole widzenia na trzy części (rys. 2b). Filtr (4) umożliwia pracę przy długości fali zbliżonej do żółtej linii sodu. Optycznie czynna substancja znajdująca się w rurce polarymetrycznej (5) (rys. 1) skręca płaszczyznę polaryzacji o pewien kąt w zależności od stężenia i rodzaju substancji. Przez analizator (6) światło przedostaje się do układu (12, 11). Analizator jest sztywno związany z kręgiem (8) i pokrętką (13). Noniusz (7) jest nieruchomo umocowany w obudowie przyrządu. Polarymetr wyregulowany jest w ten sposób, że bez cieczy optycznie czynnej, trzy części pola widzenia są jednakowo jasne(rys. 2d), gdy zerowa kreska podziałki kątowej na kręgu (8) pokrywa się z zerową kreską podziałki noniusza (7) (rys. 2a).

Rys. 1. Schemat polarymetru

Po wstawieniu do przyrządu rurki polarymetrycznej wypełnionej substancją optycznie czynną zauważymy w polu widzenia przyrządu zaciemnienie środkowej części pola widzenia, a rozjaśnienie zewnętrznych lub odwrotnie (rys. 2b). Różnica jasności jest wynikiem skręcenia płaszczyzny polaryzacji przez ciecz wypełniającą rurkę polaryzacyjną. Obracając pokrętką (13), uzyskujemy ponownie jednakową jasność trzech części pola widzenia przyrządu.

Wartość kąta skręcenia odczytujemy przez lupę 10 z dokładnością do 0,05°. Odczytu dokonujemy po ustawieniu jednakowej jasności trzech części pola widzenia (rys. 2c, d).

Rys. 2

Mutarotacja glukozy

Glukoza może występować w formie łańcuchowej oraz w dwóch formach pierścieniowych, będących anomerami α i β. Jeżeli glukozę wykrystalizuje się z wody lub metanolu, otrzyma się czystą formę α. Natomiast krystalizacja z kwasu octowego lub pirydyny daje formę β. Formy α i β są diastereoizomerami i mają różną skręcalność właściwą. Jeżeli rozpuści się w wodzie krystaliczną α-glukozę i zmierzy jej skręcalność bezpośrednio po rozpuszczeniu i po pewnym czasie, to zaobserwuje się, że skręcalność stopniowo spada. Powtórzenie tego doświadczenia z czystą krystaliczną formą β daje wzrost skręcalności właściwej roztworu. Zjawisko to, które odnosi się nie tylko do glukozy, ale wszystkich monosacharydów, nazwane zostało mutarotacją.

Mutarotacja jest to zmiana skręcalności świeżo przygotowanych roztworów cukrów, wynikająca z ustalania się równowagi pomiędzy dwoma formami anomerycznymi (α i β) poprzez formę łańcuchową.

Forma α-glukozy ma skręcalność właściwą
, a forma β ma skręcalność właściwą
.

Rys. 3. Wzajemne przechodzenie form α- i β-glukozy

Po upływie pewnego czasu ustala się stan równowagi, po osiągnięciu którego
roztworu ma wartość
. W stanie równowagi roztwór glukozy zawiera 36% formy α i 64% formy β. Formy adehydowej z otwartym łańcuchem jest w nim tylko około 0,0035. Takie wytłumaczenie mechanizmu mutarotacji jest jednocześnie dowodem istnienia pierścieniowej budowy cukrów, a także występowania chociażby znikomej ilości odmiany aldehydowej, bez której niemożliwa byłaby przemiana formy α w formę β i odwrotnie.

Wykonanie ćwiczenia

Odczynniki i sprzęt laboratoryjny :

glukoza cz.d.a (krystalizowana z wody) 10 g

zlewka skalowana o objętości 250 cm³

waga

mieszadło magnetyczne

polarymetr

1. Przygotować około 10% roztwór glukozy w następujący sposób: odważyć 10g glukozy do zlewki na 250 cm³ i dodać wodę do 100 cm³ (zanotować czas) i wymieszać do rozpuszczenia cukru.

2. Napełnić rurkę polarymetryczną przygotowanym roztworem glukozy i dokładnie po 10 minutach od umieszczenia glukozy w wodzie zmierzyć kąt skręcenia światła spolaryzowanego.

3. Mierzyć skręcalność roztworu glukozy co 10 minut do czasu ustalenia się stałego wyniku.

4. Wykonać wykres zależności skręcalności roztworu od czasu (10, 20, 30 min. ,…itd).

5. Ekstrapolować krzywą z wykresu (z punktu 5) do czasu t = 0, odczytać kąt skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego przy t=0 oraz obliczyć faktyczne stężenie przygotowanego roztworu korzystając ze wzoru na skręcalność właściwą i wartości skręcalności właściwej.

Zaliczenie ćwiczenia: pisemne sprawozdanie z uzyskanymi wynikami, opisanym wykresem i obliczonym stężeniem procentowym glukozy.

Test na właściwości redukujące cukrów

(test Fehlinga)

Właściwości redukujące cukrów można sprawdzić przy pomocy testu Fehlinga na obecność grupy aldehydowej. Aldehydy reagują z jonami Cu²⁺utleniając się do kwasów karboksylowych a jony Cu²⁺ redukują się do Cu₂O, który wypada w postaci ceglastego osadu.

R-CHO + Cu²⁺ → R-COOH + Cu₂O↓

Aldozy, jak wszystkie aldehydy, łatwo utleniają się dając kwasy aldonowe.

Cukry nie-redukujące nie dają ceglastego osadu z odczynnikiem Fehlinga. Test Fehlinga pozwala ustalić, które z badanych cukrów mają właściwości redukujące.

Odczynniki:

Cukry: glukoza, fruktoza, maltoza, sacharoza

Odczynnik Fehlinga I  (roztwór CuSO₄) Odczynnik Fehlinga II (mieszanina roztworów winianu sodowo-potasowego i KOH).

Wykonanie doświadczenia.

Celem ćwiczenia jest zbadanie redukujących właściwości aldoz, ketoz oraz dwucukrów (maltozy i sacharozy).

Przygotować 4 probówki i do każdej dodać po 0.5 ml odczynnika Fehlinga I i Fehlinga II. Wymieszać zawartość probówek i umieścić je we wrzącej łaźni wodnej. Do probówek dodać po 1 ml badanego cukru (glukoza, fruktoza, maltoza, sacharoza). Ogrzewać probówki przez 5 min i obserwować wyniki.

Zaliczenie ćwiczenia: pisemne sprawozdanie z wykonania ćwiczenia zawierające wzory strukturalne użytych cukrów, reakcję danego cukru z CuSO₄ (jeżeli zachodzi) oraz omówienie, które z badanych cukrów dają dodatni test Fehlinga, a które nie dają i dlaczego.



---