Wirusologia ogólna

Prowadzący Zofia Rodkiewicz pok. 137

Zaliczenie pisemne na prawach egzaminu = wykłady + ćwiczenia

WYKŁAD 1

Historia wirusologii -> choroby

- choroba Heinego Medina - poliomyelitis - stopa końsko-szpotawa 1400 p.n.e. - pierwsza choroba

- Mumia Ramzesa V - zmiany na twarzy

- hrabina Mary Wartley Montaque ospa prawdziwa - zabieg wariolacji 1717r. - zastąpiona szczepieniami (wakcynacja)

- XVIII w. Edward Jenner - szczepienia ospą krowią zapobiega zachorowaniu na ospę prawdziwą - wakcynacja = szczepienia

- XX w. - Polska wolna od czarnej ospy - dzięki szczepieniom na szeroką skalę

- Pasteur - szczepionka przeciwko wściekliźnie - badania na neuronach rdzenia królików

- 1892r. - Dymitr Iwanowski - pierwszy odkrywca wirusów - choroby roślin (tym się zajmował) - przesączył przez filtr bakteryjny materiał roślinny chorobowy - tym przesączonym materiałem zakaził następnie rośliny - wniosek = zakaża cos mniejszego od bakterii - wirusy = czynnik przesączalny; wykrył wirusa mozaiki tytoniowej; 7 lat później zrobił to Beijerinch

- Pierwszy przesączony zarazek u zwierząt wykrył Loffler i Frosch - był to wirus pryszczycy w 1898r.

W 1901r. Reed i Corall - wirus żółtej febry

- Bakteriofagi wykazali niezależnie od siebie w 1915r. Twort, a w 1917r. d-Herredle.

Wprowadzenie nowych metod pozwoliło na wyosobnienie jak też poznawanie właściwości biologicznych i fizycznych tych czynników.

- W 1925r. Parker i Nye uzyskali namnożenie wirusa krowianki w hodowlach tkanek.

- W 1931r. Woodruff i Goodpasture wykazali przydatność zarodków kurzych do namazania wirusów. Ten okres to tzw. „pierwszy, złoty wiek wirusologii”.

- W 1933r. Elford opracował metodę sporządzania sączków gradoholowych o porach odpowiednich wielkości.

- W hodowlach tkankowych szybciej namnażały się bakterie niż wirusy, ale około roku 50 jak wykryto antybiotyki, wtedy nastąpiło doskonalenie wzrostu wirusów było lepsze.

- W 1939r. Kausche, Pfankuch i Ruska uzyskali obrazy elektromikroskopowe.

- 1935r. Stanley uzyskał w postaci krystalicznej wirus mozaiki tytoniowej, dowód, że wirus mozaiki uzyskali w czystej postaci.

- 1949r. Endess, Weller i Robins wprowadzili uproszczoną hodowlę komórek ssaków In vitro, w następnych latach 1950-1957 wprowadzono je do pracowni wirusologicznej.

- 1952r. Dulbecco i Vogt - jednowarstwowe hodowle komórkowe jako niezwykle wrażliwe i znacznie standaryzowane podłoże.

Lata 1950-1957 - „drugi, złoty wiek wirusologii”.

- 1952r. Hershey i Chase uzyskali aktywny kwas nukleinowy z DNA fagów.

- 1956r. Gierrer i Schramm oraz Fraenkel-Canrat uzyskali aktywny RNA z wirusa mozaiki tytoniowej, stanowiło to dowód, że nośnikiem informacji genetycznej jest kwas nukleinowy RNA.

Wirusy według Burneta

- mikroorganizmy, które w swojej najmniejszej, zakaźnej postaci mają najdłuższą średnicę, nieprzekraczającą 400nm

- mogą namnażać się tylko wewnątrz żywych komórek

- ulegają przemianie w formę nie zakaźną, czyli przechodzą fazę eklipsy, co jest koniecznym stadium ich namnażania

- mają jeden typ kwasu nukleinowego RNA lub DNA, inne oba

- wirusy nie rosną i nie rozmnażają się przez podział bezpośredni

- reprodukują się tylko z ich kwasu nukleinowego - inne organizmy z całej sumy ich części składowych

- cząsteczki wirusa nie zawierają informacji genetycznej dla syntezy enzymów przeprowadzających procesy energetyczne, czyli nie maja własnej przemiany materii

- mają białko wiążące receptor na komórce „białko wiązania”

- wykorzystują rybosomy komórek gospodarza do swojego namnażania, co jest wyrazem bezwzględnego pasożytnictwa

- nie są wrażliwe na działanie chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybicznych

Pochodzenie wirusów

-> teoria endogeniczna - wirusy powstały z elementów komórkowych, które opanowały inne komórki i przestawiły je do syntezy własnych białek, albo na skutek mutacji własne elementy genetyczne wykazują działanie destrukcyjne wobec własnej komórki - „bunt genów”

-> teoria ewolucji postępującej - wirusy powstały z protobiontów - przedkomórkowych form życia

-> ewolucja wsteczna - wirusy uważane są za produkt degeneracji wyższych form pasożytniczych na skutek upraszczania się ich struktury

Według Fennera: bakterie->riketsje->chlamydie->wirusy

Morfologia

Wielkość - stwierdza się znaczne różnice wielkości między poszczególnymi rodzajami wirusów. Wymiary najmniejszej wynoszą około 10nm, a największej do 400nm.

Kształt - kolisty, cylindryczny, dwudziestościenny, ciegiełkowaty.

Bakteriofagi bywają bardziej złożone - mogą mieć główkę i ogonek.

A) Symetria kubiczna - ikozaedralna, tzw. nagie wirusy, bo nie zawsze mają otoczkę.

B) Symetria helikalna - zawsze posiadają dwuwarstwową otoczkę białkowo-lipidowo-węglowodanową

Kapsyd wirusa

- ochrania kwas nukleinowy będący rdzeniem wirusa

- bierze udział w adsorpcji i wnikaniu wirusa do komórki przez interakcje z receptorami błony komórkowej wirusowych „białek wiązania”

Budowa chemiczna

Zasadniczym składnikiem jest kwas nukleinowy i białka. Małe wirusy są czystymi nukleoproteinami, średnie i duże mają węglowodany i lipidy.

1) Białka wirusów: nie wykazują cech wyróżniających je od białek gospodarza

- składają z aminokwasów z szeregu L

- przeważają dwukarboksylowe aminokwasy kwaśne

- cechą charakterystyczną łańcucha białka jest „maskowanie” obu aminokwasów końcowych lub jednego z nich, C- lub N- końcowego (utrudnienie znoszenia przez proteazy komórkowe)

- białkowe podjednostki i kwas nukleinowy wykazują zdolność samoistnego łączenia się

- są nośnikami właściwości antygenowych

Białka wirusowe dużych, złożonych wirusów wykazują niejednorodność i różnią się między sobą: funkcją, wrażliwością na działanie enzymów proteolitycznych, antygenowo.

Białka wirusowe dzielimy na białka strukturalne i białka funkcjonalne. Białka strukturalne tworzą kapsyd, otoczkę, wypustki, główkę, ogonek u bakteriofagów, są niezbędne do tworzenia zakaźnych cząstek. Białka funkcjonalne są to różne enzymy wirusowe3.

Enzymy wirusowe

-> polimerazy wirusowe - są niezbędne w procesie replikacji kwasu nukleinowego. Jeżeli wirusowy kwas nukleinowy może być „czytany” przez polimerazy komórkowe, wirusowe polimerazy ulegają ekspresji w zakażonych komórkach, lecz nie może być „czytany” przez polimerazy komórkowe, winion będzie musiał zawierać niezbędną polimerazę.

-> proteazy - są wykorzystywane przez niektóre wirusy w procesie modyfikacji potranslacyjnej dużych protein

-> endonukleazy i ligazy - są wyspecjalizowanymi enzymami niezbędnymi w procesie replikacji niektórych wirusów

Kwasy nukleinowe wirusów

W skład winiona może wchodzić albo RNA albo DNA. Procentowa zawartość w winionie jest bardzo różna np. 1% u winiona grypy i 50 % u niektórych fagów.

RNA wirusa u większości jest jednołańcuchowy (tylko u Rea- i Brinaviridae - dwułańcuchowy). Może występować jako pojedynczy segment lub kilka segmentów (np. wirus grypy ma 8 segmentów).

DNA wirusa

- w większości genom jest dwułańcuchowy, tylko u parwowirusów i faga fiX174 jednołańcuchowy

- u większości liniowy, tylko u Papowawirusów i bakteriofaga fi X174 genom kulisty

2) Tłuszczowce wirusów

Zawartość lipidów waha się znacznie w zależności od rodzaju wirusa (od 0,4 - 64%). Fakt obecności tego składnika w winionie decyduje o jego wrażliwości na działanie organicznych rozpuszczalników tłuszczowych, detergentów i enzymów (lipazy). Lipidy występują w postaci luźno związanej z winionem.

3) Węglowodany

- wchodzą w skład kwasów nukleinowych, otoczki i innych

RNA- fagi

Wykryto je w 1960 roku przy okazji prowadzenia badań nad czynnikiem płciowości F u E. Coli. Zawierają RNA, jednoniciowy o dodatniej polarności. Ich genom zbudowany jest z 3600 nukleotydów, nie jest długa nicią lecz jest zwinięty w kłębek. Około 75% zasad tego RNA jest ze sobą sparowanych tworząc tzw. Szpilki podzielone fragmentami jednoniciowymi. Symetria kubiczna.

Są to wirusy najlepiej poznane w sensie ich funkcjonalności. Ich poznanie umożliwiło wejrzenie w mechanizmy między komórką gospodarza a wirusem.

Przebieg infekcji RNA- fagiem

1. RNA- fagi absorbują się do fimbrii płciowych swoim białkiem wiązania A (nawet do 1000 wironów)

2. Przenikanie do komórki. Do komórki dostaje się tylko kwas nukleinowy wirusa. Proteazy fimbrii rozcinają białko A uwalniając kwas nukleinowy, który dostaje się do komórki dzięki obkurczaniu się fimbrii (zostaje ono wciągane) przy pomocy białka leżącego u podstawy fimbrii wiążąc się z białkiem A. Zwykle infekcje wywołuje jedna cząsteczka RNA. Ale w odpowiednich warunkach może się ich dostać więcej. W czasie penetracji fimbrie ulegają częściowej degradacji i to jest powód, że ilość przenikających nici kwasu nukleinowych jest ograniczona.

3. Translacja RNA wirusowego na rybosomach komórki gospodarza ponieważ jest to RNA + (dodatnia polarność) to RNA wirusa jest od razu mRNA.

Białka wirusa są syntetyzowane w następującej kolejności:

• Białka kapsydu

• Białka polimerazy

• Białko lityczne

Białka kapsydu regulują syntezę białek polimerazy. Synteza białka A zachodzi niezależnie od syntezy pozostałych białek na replikujących się niciach RNA fagowego. Na jedną nić RNA fagowego przypada jedno białko. Białko lityczne jest kodowane przez tzw. Gen zachodzący. Leżący na pograniczu genów białka kapsydu i RNA repliakazy, odczytywany jest on w innej fazie ( faza odczytu przesunięta o jeden nukleotyd w prawo, zwana frazą +1)

Białko kapsydu:

• Represor replikacji RNA

• Modulator translacji białek fagowych

• Element strukturotwórczy

Replikaza RNA- modulator translacji wypiera we wczesnej fazie z nici plus rybosomy i tym samym potęguje replikację. Później zostaje sama wyparta przez białko kapsydu z nici plus, transkrybuje nici minus tworząc nowe porcje nici plus.

W badaniach nad genomem tego wirusa, okazało się że geny są przedzielone i poprzedzone fragmentem RNA nie ulegającymi translacji. Było to zagadką. Dziś wiadomo że rejony te odgrywają ważną rolę. Decydują o polarności translacji, wiążą swoiście rybosom ( w przypadku tych fagów białko kapsydu) decydując o zjawisku represji translacji i replikacji, wiąże RNA replikazę, koduje dodatkowo białko lityczne. Jest to region o prawie całkowitej konserwatywności genetycznej.

RNA- fagi „minimalne wirusy” posiadają minimum informacji niezbędnej aby wirus infekował, namnażał się i zachowywał ciągłość genetyczną. Każda faza cyklu życiowego jest związana z produktem innego genu.

• Białko A- adsorpcja i penetracja

• Replikaza- namnażanie

• Białka kapsydu tworzące kapsyd- identyczne podjednostki

• Białko lityczne- uwolnienie wirusa

Do syntezy swoich białek wirus wykorzystuje komórkowy system translacji.

DNA- fagi

Są to wirusy o złożonej budowie. Winion składa się z główki zawierającej DNA i długiego ogonka zaopatrzonego w 6 wici i jedną płytkę podstawową. Ich genom stanowi liniowa cząsteczka 2-niciowego DNA zawierającego około 170 genów. Funkcje większości tych genów są poznane.

Wirusy te efektywnie wyłączają poszczególne procesy życiowe komórki. Infekcja tym fagiem prowadzi do rozpadu DNA komórkowego. Późne okresy rozwoju wirusa odbywają się w komórce pozbawionej własnego genomu. Aparat replikacyjny faga jest całkowicie niezależny od aparatu bakteryjnego.

Zakażenie komórki:

Wirus za pomocą wici adsorbuje się na komórce, dochodzi do kontaktu pomiędzy powierzchnią bakterii a płytką podstawową wirusa. Następuje skurcz ogonka- otoczka ogonka zbudowana jest z identycznych podjednostek białkowych ułożonych spiralnie. Rdzeń ogonka wbija się w ścianę komórki bakterii, poczym DNA zostaje wstrzyknięty do komórki przez kanał rdzenia.

Etapy namnażania:

1. Transkrypcja DNA na mRNA wczesne

2. Translacja „wczesnych” białek (funkcjonalnych)

3. Replikacja wirusowego DNA

4. Transkrypcja na mRNA (późne)

5. synteza białek późnych (strukturalnych- białek główki, ogonka, wici, płytki podstawowej)

6. Składanie potomnych cząsteczek bakteriofaga

Wczesne białka to:

• Nukleazy degradujące DNA gospodarza

• Enzymy biorące udział w metabolizmie nukleotydów etylujących i glikozylujących DNA wirusowy

• Enzymy biorące udział w replikacji, są to: fagowa polimerazy DNA, topoizomeraza, białka topiące, ligazy, białka kompleksu replikującego.

Bakteriofagi o genomie w postaci pojedynczej kołowej nici DNA na przykładzie faga ΦX174

Są to wirusy o symetrii kubicznej. Ich genom koduje od 9-11 białek wirusowych. Są to 2 białka strukturalne budujące kapsyd, białko wypustek, a także białko będące w kompleksie z wirusowym DNA. Oprócz białek strukturalnych, genom tego faga zawiera informacje dla 7 białek niestrukturalnych, rola tych białek nie jest do końca poznana.

Białko A- niezbędne do replikacji, DNA nukleaza która przecina 2- niciową formę replikacyjną DNA

Białko E- peptyd lityczny, ułatwiający rozpad komórki gospodarza

Proces infekcji rozpoczyna się od adsorpcji wirusa na powierzchni bakterii za pośrednictwem hydrofobowych wypustek zbudowanych z białka H

Faza eklipsy DNA w komórce, synteza makromolekuł wirusowych, organizacja wironów potomnych i liza komórki. Wkrótce po infekcji w zakażonej komórce zachodzi synteza nici minus DNA- komplementarnej do infekcyjnej nici plus DNA. Powstaje dwuniciowa, kołowa forma zwana replikacyjną RFI. Powstaje około 20 kopii RFI, w sposób semikonserwatywny.

Formy RFI zapoczątkowują syntezę potomnych kołowych, jednoniciowych nici fagowego DNA. Przy czym nie odbywa się to już w sposób semikonserwatywny, tylko według mechanizmu toczącego się koła. Białko A rozcina nić plus i to miejsce jest początkiem, koniec 3' OH służy jako starter, stąd polimeraza syntetyzuje nić komplementarną.

Transkrypcja faga:

• Swoiste mRNA powstają pod wpływem RNA polimerazy E. Coli

• Transkrypcji ulega dwuniciowa forma replikacyjna i ma charakter asymetryczny bowiem na mRNA przepisywana jest wyłącznie nić DNA- w rezultacie komplementarny mRNA do nici

• Wirus DNA ma taką samą sekwencję co infekcyjny plus DNA

Wirusowy mRNA ma charakter policistronowy

Dokładne badania- sporządzenie mapy genetycznej (1977r.) pozwoliła ustalić że:

• Genom składa się z 5386 nukleotydów

• Występują geny zachodzące

• Występują obszary wysokiej specyficzności do rybosomów komórki gospodarza

• Do odczytywania różnych białek wykorzystuje są różne fazy odczytu tych samych odcinków DNA

• Za badania nad tym wirusem Nagroda Nobla 1980r.

Bakteriofag λ

Wiron złożony jest z dwu części: kubicznej główki i cienkiego niekurczliwego ogonka zakończonego cienkim centralnie położonym włókienkiem. Brak płytki podstawowej i charakterystycznych wypustek jak u faga T- parzystego. Wirionowy DNA to liniowa, 2-niciowa cząsteczka- 57 genów o komplementarnych końcach. Na obu końcach występują jednoniciowy, wzajemnie komplementarne odcinki DNA w skład których wchodzi po 12 par zasad. Dzięki obecności tych tzw. lepkich końców po przedostaniu się do komórki, DNA tego wirusa ulega cyrkulacji i za pośrednictwem ligazy jest łączone i we wczesnych stadiach zakażenia występuje w postaci kołowej.

Ogonek bierze udział w rozpoznawaniu swoistych receptorów na powierzchni komórki, po czym DNA zostaje wstrzyknięty do komórki.

Ten bakteriofag jest prototypem tzw. wirusa lizogenicznego, tzn. takiego który może wystąpić w zakażonej komórce w postaci utajonej tzn. wbudować się do komórki gospodarza jako tzw. profag i wraz z chromosomem bakteryjnym być przekazywanym komórkom potomnym. Nie prowadzi do zaburzeń metabolizmu komórki.

Komórkę w której chromosomie znajduje się bakteriofag lambda, nazywamy komórkę lizogenią a faga, łagodnym lub lizogennym.

Genom wirusowy ulega integracji poprzez rekombinację między swoistymi odcinkami DNA faga lambda i E. Coli zwanymi miejscami wiążącymi. Stwierdzono, że w genomie faga lambda i bakterii E. Coli występuje wspólna sekwencja 15 nukleotydowa, która służy do utworzenia kompleksu między rekombinującymi nićmi DNA faga lambda i E. Coli. Są tez odpowiednie rejony łatwo ulegające rozpleceniu co znacznie ułatwia rekombinację .

Bakteriofag ten może również w komórce namnażać się i powodować jej lizę.

O losach bakteriofaga lambda decyduje wczesne stadium zakażenia. DNA faga ulega w komórce gospodarza cyrkulacji. Ta kołowa forma ulega wczesnej replikacji i powstaje kilka kopii genu. Następnie w fazie transkrypcji powstaje mRNA dla konkretnych białek. Miedzy innymi powstaje represor faga lambda, który wiążąc się z genomem hamuje transkrypcję wszystkich mRNA poza informacyjnym dla syntezy białka represora, powstaje enzym biorący udział w integracji genomu profaga z chromosomem.

Z drugiej strony mogą powstać białka antagonistyczne, hamujące gen białka represora i wtedy wirus odbywa normalny cykl lityczny, który przebiega podobnie jak u innych bakteriofagów.

- faza replikacji zgodnie z mechanizmem toczącego się koła

III faza- synteza białek strukturalnych

IV faza- kompletowanie cząsteczek potomnych

Komórka bakterii która w swoim genomie posiada bakteriofaga w stanie profaga nie luega zakażeniu przez inne bakteriofagi.

Profag w pewnych warunkach ulega indukcji, najczęściej pod wpływem czynników niekorzystnych dla bakterii np. temperatura, promieniowanie, szok toniczny. Komórka uruchamia mechanizm obronny, syntetyzuje enzymy inaktywujące wszystkie represory w komórce przez proteazy komórkowe. Wtedy genom profaga ulega transkrypcji. Są tworzone enzymy biorące udział w wycięciu profaga i litycznym rozwoju wirusa.

Z taką indukcją bakteriofaga wiąże się zjawisko tzw. transdukcji. Bakteriofag może być niedokładnie wycięty i zabrać część materiału genetycznego do innej komórki i przenieść nowe cechy np. lekooporność.

Bakteriofag może też dać komórce nowe właściwości wtedy znajduje się w chromosomie- tzw. konwersja lizogeniczna. Np. maczugowiec błonicy jest chorobotwórczy kiedy posiada faga lizogenicznego, bo wytwarza toksyny.

Bakteriofagi- mechanizmy replikacji, składanie fagów o złożonej strukturze i uwalnianie cząstek fagowych.

Jednoniciowy DNA b-fagów zawsze jest przekształcany w kolistą formę DNA, a następnie jest replikowany podobnie jak DNA dwuniciowy. Wytworzenie formy kolistej DNA- jest to ochrona przed działaniem egzonukleaz komórkowych i ułatwienie ewentualnej integracji DAN profaga z chromosomem komórki.

Tworzenie form kolistych odbywa się na drodze specyficznych mechanizmów inicjacji i elongacji. Przekształcenie do formy kolistej odbywa się dzięki obecności na końcach DNA jednoniciowego komplementarnych sekwencji (tzw. miejsca cos, lepkie końce). W czasie replikacji kolistych form DNA powstają struktury konkatamerowe, odpowiadające wielu kopiom DNA, które ulega cięciu do form pełnogenomowych.

Genom wszystkich fagów posiadających ogonek jest zbudowany z liniowego dsDNA. Proces ich namanżania prowadzi na ogół do lizy komórki.

Cykl lityczny tych fagów obejmuje:

• Adsorpcję

• Wprowadzanie genomu do cytoplazmy

• Transkrypcję

• Translację

• Replikację DNA

• Morfogenezę

• Składanie cząsteczek wirusowych i ich uwalnianie

Proces transkrypcji obejmuje zwykle 3 częściowo nakładające się etapy- wczesny, średni i późny.

Wczesny: ekspresja genów kodujących białka przygotowujące komórkę do namanżania faga. Zahamowanie syntezy makrocząsteczek komórkowych, degradacja DNA gospodarza, białka związane inicjacją replikacji DNA fagowego, białka regulacyjne. Większość fagów wykorzystuje do syntezy fagowego mRNA komórkową RNA zależną polimerazę RNA.

Średni: białka związane z replikacją genomowego DNA, ich aktywność jest kontrolowana przez geny fagowe.

Późny: białka strukturalne, lityczne oraz związane z pakowaniem i składaniem cząstek fagowych

Składanie cząsteczek fagowych o złożonej strukturze

W początkowym okresie morfogenezy składanie główek fagowych i struktur ogonka przebiega oddzielnie, dopiero w końcowej fazie następuje ich łączenie się. Proces morfogenezy obejmuje również pakowanie DNA. Najpierw powstają pregłówki, które są zawsze okrągłe o grubych ścianach. W wyniku cięcia proteolitycznego głównego białka kapsydu pregłówki ulegają rozciągnięciu przyjmując typową strukturę o cienkich ścianach.

Pakowanie DNA do główek fagowych jest ostatnim etapem ich tworzenia. Pregłówki zawierają białko łącznikowe i enzym tnący DNA- terminaza. Siłą motoryczną jest rozszerzanie się główki, ruchy obrotowe białka łącznikowego i terminazy.

Terminazy to specyficzne białka które łączą się z DNA i tną w specyficznych miejscach ułatwiających translokację do główki fagowej przez specjalny otwór utworzony przez białko wejściowe. Koniec DNA jest pakowany jako ostatni, ale jest pierwszym wprowadzanym do komórki. Pakowanie odbywa się do momentu wypełnienia główki.

Uwalnianie cząsteczek fagowych z komórki

Dwa podstawowe mechanizmy: fagi, które uwalniają genom w postaci dsDNA kodują dwa białka endolizynę degradującą mureinę ściany komórkowej oraz holinę, która ułatwia transport endolizyny do ściany komórkowej. W momencie rozpoczęcia degradacji ścinany komórkowej następuje liza komórek co jest wywołane działaniem siły osmotycznej.

Druga grupę stanowią taki fagi jak ØX174 kodujące tylko jeden gen- białko lityczne E nie degraduje ściany komórkowej tylko hamuje syntezę mureiny. Jeszcze inne fagi degradują ścianę komórek w sposób dokładnie jeszcze nie poznany.

Bardzo ważna jest regulacja procesu lizy komórki, zbyt wczesna liza prowadzi do zahamowania najbardziej produktywnej części cyklu komórkowego, jakim jest składanie cząstek fagowych. Z drugiej strony zbyt późna liza- utrata możliwości zakażania następnych komórek. Istnieje presja na optymalny moment lizy.

Fagi jako modele do badań w zakresie biologii molekularnej: szybkie namnażanie i bardzo prosta budowa (białko i kwas nukleinowy). Badania nad fagami umożliwiły uzyskanie cennych, podstawowych informacji w zakresie wirusologii, biologii molekularnej a szczególnie genetyki:

• Dowód roli kwasów nukleinowych ( zarówno DNA jak i RNA) jako jedynego nośnika informacji genetycznej

• Poznano ich morfologie, cechy chemiczne i funkcjonalne

• Poznano szczegółowo ich genomy co dało początek poznawaniu genomów organizmów wyższych

• Znalazły zastosowanie jako wektory w inżynierii genetycznej

Znaczenie bakteriofagów

• Naturalne oczyszczenie środowiska z bakterii- dotyczy to tez organizmu człowieka i zwierząt

• Metoda izotypii do typowania bakterii- wykorzystywana bardzo duża swoistość bakteriofagów

• Izotypia w dochodzeniach epidemiologicznych, ustalenie źródeł zakażenia- wykrywanie nosicieli zarazków

• W terapii chorób bakteryjnych ludzi i zwierząt (wolno narasta oporność na bakteriofagi). Nie mogą być stosowane bakteriofagi, które mają geny dla toksyn i łatwo ulegają zjawisku lizogenii

• W zwalczaniu infekcji roślin wywołanych przez fitopatogenne bakterie

• Do walki z drobnoustrojami np. Salmonella czy E. Coli w przemyśle spożywczym

• W inżynierii genetycznej do syntezy różnych substancji biologicznych

Ujemne działanie

Bakteriofagi mogą być przyczyną dużych strat w przemyśle serowarskim, mleczarskim, winnym ponieważ mogą niszczyć bakterie i grzyby zaangażowane w procesy fermentacji.

Skutki biologiczne cyklu lizogenicznego- są bardzo poważne i różnorodne gdyż kwas nukleinowy faga zostaje inkorpowany do materiału genetycznego komórki bakteryjnej, a ponadto fag może przekazywać bakterii biorcy chromosomalnie i pozachromosomalne elementy biorcy zabrane z bakterii biorcy

Dwa zjawiska:

• Transdukcja- przeniesienie przez faga fragmentów materiału genetycznego komórki dawcy do komórki biorcy

• Konwersja lizogeniczna- oddanie komórki biorcy części własnego materiału genetycznego faga

Oba te zjawiska powodują ważne z punktu widzenia lekarskiego zmiany właściwości bakterii:

1. wzrost zjadliwości bakterii np. u maczugowca błonicy wskutek przekazania informacji własnej faga pojawia się nowa cecha- zdolność produkowania toksyn (zjawisko to spotyka się u innych bakterii np. Clostridium, mykoplazm)

2. Powstanie lekooporności (przeniesienie genu, oporności na dany chemioterapeutyk)

3. Zmiana właściwości biochemicznych bakterii- trudności diagnostyczne

4. Zmiana właściwości antygenowych bakterii

5. Bakterie w stanie lizogenii nie są wrażliwe na zakażenie fagami zjadliwymi tego samego gatunku. A więc te ostanie nie wywierają ograniczającego wpływu na liczebność takich bakterii w danym środowisku.

6. Obecność fagów w żywych szczepionkach, może zmieniać właściwości bakterii jak też niszczyć je.

Wykorzystanie bakteriofagów w leczeniu chorób człowieka i zwierząt

Zalety:

• Wybiórcze działanie na określony gatunek a nawet typ fagowy zarazka przy braku wpływu na komórki leczonego organizmu

• Wybiórcze działania bakteriofagów nie uszkadza fizjologicznej flory organizmu

• Szybko uzyskuje się poziom terapeutyczny bakteriofagów i długo utrzymuje się w organizmie, ponieważ bakteriofagi się namnażają

• Z chwilą zniszczenia bakterii bakteriofagi są eliminowane z organizmu

• Bakteriofagi mogą się rozprzestrzeniać na nie leczone zwierzęta będące w kontakcie z leczonymi, co ułatwia zapobieganie i leczenie zakażeń bakteryjnych

• Mutacje bakterii w kierunku oporności na bakteriofagi zachodzą rzadziej aniżeli na antybiotyki

• Brak oporności krzyżowej na bakteriofagi i antybiotyki, a także równoczesne pojawienie się oporności na antybiotyki i bakteriofagi jest bardzo małe

• Możliwość stosowania kompozycji dwóch fagów lub stosowania enzymów produkowanych przez bakteriofagi zamiast bakteriofagów

• Możliwość stosowania bakteriofagów łącznie z antybiotykami

• Istnieje możliwość wyprodukowania tzw. „koktajlów bakteriofagowych” cechujących się szerszym spektrum działania przeciwbakteryjnego, jak super bakteriofaga który cechuje się selektywnym niszczeniem równocześnie kilku gatunków bakterii i szczepów bakterii

• Brak reakcji alergicznych przy stosowaniu leczenia bakteriofagami

Ograniczenia terapii fagami:

• Nie można wykluczyć replikacji bakteriofagów w komórkach ssaków

• Mogą wywierać niekorzystne działanie na efekty uodparniania przy stosowaniu żywych atenuowanych szczepionek

• Wystąpienie zjawiska transdukcji- przekazywanie genów z komórki do komórki ( lekooporność, zjadliwość, inwazyjność)

• Bakteriofagi wzbudzają wytwarzanie przeciwciał przeciwko ich antygenom, które pojawiają się po kilku tygodniach i mogą interferować z fagami w przypadku terapii fagowej trwającej kilka do kilu tygodni

• Z terapii muszą być wykluczone bakteriofagi które posiadają geny o dużym stopniu homologii ze znanymi genami lekooporności bakterii, czy też geny kodujące toksyny lub czynniki wirulencji, a także takie które łatwo poddają się lizogenii

• Przy masowym zabijaniu bakterii prze bakteriofagi uwalniane endotoksyny mogą wpływać niekorzystnie na organizm ( wzrost temperatury ciała, bóle wątroby)

Perspektywy, stosowanie terapii genowej

Fagi będą zapewne stosowane jako leki ostatniego ratunku w leczeniu infekcji opornej na antybiotyki. U zwierząt gdzie konieczny jest okres karencji nie będzie potrzeby oznaczania pozostałości leków.

Wirusy roślinne

Komórki roślinne (eukariotyczne) wyposażone w organella komórkowe, posiadające wydzielone jądro , DNA skompleksowane z histonami i swoisty aparat translacyjny, są w zasadniczy sposób odmienne od budowy i właściwości komórki bakteryjnej.

Badania nad ekspresją genetyczną wirusów roślinnych, które są głównie RNA- wirusami pozwoliły poznać wiele mechanizmów komórkowych u Eukariontów i poznać różnicę między tymi mechanizmami.

Wśród wirusów roślinnych stwierdzono występowanie tylko dwóch rodzajów zawierających jako genom DNA i jednego zawierającego dwuniciowy RNA, pozostałe to wirusy RNA jednoniciowe zawierające genom + RNA. Poznanie zależności między wirusem a gospodarzem- rośliną okazało się znacznie trudniejsze bowiem w chorej roślinie rożne komórki w rożnym stopniu ulegają zakażeniu wirusowemu. Komórki w rożnych tkankach są rożnie zbudowane i znajdują się w rożnych fazach rozwoju i takie doświadczenia są czasochłonne. Jednakże wirusy roślinne są również obiektem intensywnych badan biologów molekularnych, bowiem wirusy namnażają się w znacznych ilościach, łatwo je otrzymać i nie są groźne dla badających. Badania nad tymi wirusami pozwoliły na stwierdzenie, ze u wirusów roślinnych:

- brak jest zjawiska trofizmu, swoistości gatunkowej. Jeden wirus roślinny może zakażać różne gatunki roślin

- brak wyraźnego etapu adsorpcji

- wirus sam nie może zakażać rośliny, potrzebne jest uszkodzenie ściany komórkowej

W warunkach laboratoryjnych zakażenie wirusowe wywołuje się przez uszkodzenie mechaniczne- wcieranie w liść zdrowej rośliny- uszkodzenie karborundem. Z komórki do komórki wirus dostaje się przez plazmodesmy- wypustki cytoplazmatyczne, przechodzące przez grube ściany komórkowe. Po roślinie rozprzestrzenia się jej systemem naczyniowym, toteż zakażenia obejmują najczęściej cala roślinę (są to zakażenia systemiczne). Młode rośliny pochodzące z rozmnażania wegetatywnego będą również zakażone. Nasiona są bardziej oporne.

W warunkach naturalnych zakażenie odbywa się:

a) mechanicznie- potarcie delikatnych liści, uszkodzenie korzeni, uszkodzenie przez wiatr delikatnych włosków na liściach

b) przez owady- główni sprawcy roznoszenia chorób wirusowych, niektóre wirusy mogą się rozmnażać w tkankach owadów

c) przez szczepienie

d) przez pasożytujące rośliny np. kanianka- pnącze pozbawione liści

e) przez nasiona (ok. 15% znanych wirusów)

W glebie:

- przez nicienie glebowe

- przez grzyby (zarodniki pływkowe)

Owady głównie mające aparat gębowy typu kłująco- ssący. Główni przenosiciele- mszyce maja często w rozwoju dwóch gospodarzy: drzewa i krzewy, drugie to rośliny zielne (niektóre rośliny wydzielają substancje, które przyciągają mszyce). Przenoszą około 100 wirusów.

• Skoczki przenoszą tzw. wirusy krążeniowe

• Przylżeńce

• Roztocze

Przebieg i objawy zakażenia

Wprowadzenie wirusa do rośliny nie jest jednoznaczne z zakażeniem. Musi się namnażać wirus i musi być podatna roślina.

Budowa i ekspresja genetyczna

Mogą być wieloskładnikowe, pseudowieloskladnikowe i policistronowe jak u bakteriofagów.

Wirusy roślinne z rozdzielonymi genomami

Są to wirusy wieloskładnikowe, genom w postaci osobnych odcinków nici plus RNA.

Wirus mozaiki stokłosy- zakaża rożne gatunki roślin. W laboratorium hodowane zwykle na jęczmieniu, gdzie wywołuje infekcje systemiczne. W mikroskopie elektronowym preparat wirusa wydaje się być homogennym, złożony z kubicznych cząstek o średnicy około 25 mikrometra. Każda z tych cząstek zawiera RNA o masie około 160000, kapsyd zaś zawiera 180 kapsomerów, tak wiec odpowiadają wielkością RNA-fagom. Dokładna analiza (wirowanie w chlorku cezu) wykazała, ze te cząstki nie są jednakowe, rozdzielają się na trzy klasy wirionów, natomiast RNA ekstrahowane preparatu wirusowego składa się z 4 rodzajów łańcuchów rybonukleinowych o rożnej masie cząsteczkowej. Dalsze badania wykazały, że każda z klas wirionów jest niezbędna do zakażenia i każdy wirion zawiera inny rodzaj RNA. Każde z tych RNA pełni funkcje mRNA, tak wiec genom tego wirusa złożony jest z 4 rożnych nici plus RNA.

Badania nad infekcyjnością rożnych form RNA wykazały, ze każda z nich osobno zakażenia nie wywołuje i do infekcji niezbędne są RNA 1, 2 i 3, natomiast RNA 4 nie jest potrzebny do zakażenia, ale zawsze się odtwarza w roślinie zakażonej RNA 1+2+3. wskazuje to, ze informacja dotycząca budowy RNA-4zawarta jest w jednej z cięższych nici wirusowego RNA. Bliższe badania wykazały, ze w końcowej RNA 3 znajduje się odcinek będący dokładnym powtórzeniem RNA 4. Tak wiec jest to wirus o genomie podzielonym, bowiem informacja genetyczna niezbędna do namnażania się wirusa zlokalizowana jest w trzech niezależnych niciach RNA.

Synteza białek tego wirusa ma charakter monocistronowy. Każdy RNA to nić plus, daje informacje do syntezy innego białka- ich rola jest nieznana, uważa się, że biorą udział w replikacji wirusa. Nić RNA 4 odpowiada za syntezę białek kapsydu. Jednakże gen białka kapsydu jest powtórzony w RNA 3, jednakże jest niedostępny dla rybosomów. Replikacja RNA tego wirusa słabo poznana- tworzą się komplementarne nici -RNA kierujące syntezą potomnych nici plus wirusowego RNA. Wydaje się więc, że niestrukturalne białka wirusowe biorą udział w replikacji- stwierdzono w roślinach zakażonych wirusem enzym specyficznie replikujący wyłącznie RNA tego wirusa. Wskazuje to, ze RNA wirusy roślinne podobnie jak bakteriofagi niosą informacje do utworzenia aparatu replikującego.

Przebieg zakażenia: do komórki wnikają 3 cząstki wirusa z 4 RNA:

• Synteza białek niestrukturalnych replikazy

• Replikacja kwasów nukleinowych

• Synteza białek późnych kapsydu

• Tworzenie cząstek wirionu

Wirion ten jest bardzo podobny do bakteriofagów, jednakże znajdują się struktury służące przystosowaniu do eukariotycznych komórek:

- na końcach 5' cząsteczki RNA znajduje się struktura (z ang.) cap, taka struktura znajduje się we wszystkich dotąd poznanych komórkowych eukariotycznych mRNA

- na końcach 3' cząstek RNA znajdują się rejony nie odczytywane przez rybosomy. Pierwsze 161 nukleotydów w każdej z 4 nici ma taką samą sekwencję. Fragmenty te nie ulegają translacji, ale pełnią ważną rolę w rozwoju wirusa, bowiem ich uszkodzenie powoduje utratę infekcyjności. Fragmenty te dają się zwinąć w strukturę przypominającą cząsteczkę tRNA z wolnym końcem 3'CCAOH i antykodonem tyrozynowym zlokalizowanym na szczycie pętli podobnej do typowej pętli antykodonowej tRNA. Można przypuszczać, że 3' końcowe miejsca służą do przyczepu RNA- replikazy, rozpoczynającej powielenie wirusowego RNA.

- mRNA wirusów eukariotycznych odczytywane jest w postaci monocistronowej

- rybosomy eukariotyczne nie mogą w odróżnieniu od bakteryjnych doczepiać się do kodonów AUG wewnątrz cząsteczki mRNA.

Wirus mozaiki lucerny

• Wirus wieloskładnikowy

• Cztery klasy wirionów pałeczkowatych o tej samej średnicy, ale różnej długości, nie mają symetrii kubicznej

• Genom rozdzielony między różne cząstki, stanowią go cztery różnej długości nici RNA, najkrótsza z tych nici RNA 4 koduje syntezę białek kapsydu. W mieszaninie infekcyjnej musza się znaleźć nie tylko trzy ciężkie nici RNA, ale również 4. informacja dla białek kapsydu jest powtórzona w nici 3, ale nie ulega ekspresji. W mieszaninie zakaźnej muszą się znaleźć wszystkie nici albo zamiast genu białka kapsydu samo białko kapsydu. Białko kapsydu pełni role w replikacji wirusowego RNA- wspomaga rozpoznanie końców 3' RNA przez replikazy. W tego wirusa 3' końcowe fragmenty RNA nie mają struktury plus RNA podobnej.

Wirus mozaiki tytoniu- zespół szczepów wirusów o zbliżonych właściwościach, różniących się rodzajem zakazanego gospodarza i rodzajem symptomów. Wirus ten był pierwszym wykrytym wirusem roślinnym, pierwszym otrzymanym w postaci krystalicznej (Stanley 1935)- nagroda Nobla. Uważał, ze wirus ten to samo białko, dlatego bardzo długo badał strukturę, sposób organizacji i autoorganizacji tej cząsteczki. Wirus ten ma kształt pałeczki i budowę heliakalna. Inny uczony, laureat nagrody Nobla, odtworzył ten wirus in vitro mając składniki wyjściowe RNA i białko (Nobel 1982)- stwierdził zjawisko autoagregacji białek wirusowych, białka łączą się w większe skupiska tworząc tzw. dyski, które łatwo łączą się i tworzą kapsyd.

Ekspresja genetyczna jest słabo poznana, ponieważ głównie badano strukturę tego wirusa. Ustalono mapę genetyczna tego wirusa na podstawie produktów jego translacji. Wirus ten posiada jednoniciowy RNA o dodatniej polarności, czyli pełni role mRNA. RNA tego wirusa zawiera 6500 nukleotydów. Stwierdzono, że na końcu 5' znajduje się struktura cap, a na końcu 3' fragment nieulegający translacji tRNA podobny. Stwierdzono w badaniach in vitro, ze nic tego wirusa stymuluje powstanie dwóch białek: mniejszego i większego, to większe postaje z odczytu około 70^o matrycy przy czym z odczytu tego samego fragmentu- odbywa się to podobnie jak u bakteriofagów. Białka te maja wspólne sekwencje N końcowe a rożne C, nie wiadomo nic o funkcji tych białek. Prawdopodobnie są to białka funkcjonalne biorące udział w replikowaniu genomu, będące albo składnikiem replikazy RNA albo aktywatorami replikaz RNA już istniejących w komórce. Stwierdzono, ze ta nic nie stymuluje in vitro syntezy białek kapsydu. Gen białka kapsydu jest ukryty wewnątrz cząsteczki, toteż rybosomy nie inicjują jego translacji. Aby nastąpiła ekspresja ukrytego genu musi nastąpić pofragmentowanie genomu wirusa, czyli musza się pojawić monocistronowe odcinki RNA. I rzeczywiście stwierdzono, ze w czasie namnażania się tego wirusa pojawiają się monocistronowe mRNA, który posiada koniec cap i tRNA. Czyli po zakażeniu na długiej nici RNA tworzą się dwa białka biorące udział w replikacji, po czym tworzy się nic RNA, a następnie nic plus, a także krótkie odcinki genomu odpowiadające białku kapsydu. Jednakże te krótkie cząstki nie są niezbędne do zakażenia. Oczywiście obok monocistronowych mRNA pojawiają się również pełnej długości potomne nici plus RNA, które tworzą nowe wiriony. W długiej nici RNA występuje rejon o wysokim powinowactwie do białek kapsydu (rejon eukapsydacji) i tworzą się pałeczkowate, potomne wiriony. Czasami może się zdążyć, ze białko kapsydu nie

Schemat budowy TMV

Wokół heliakalnie zwiniętej nici RNA (złożonej z nukleotydów) o masie cząsteczkowej również helikalnie upakowane jest identycznych podjednostek białka kapsydu. Podjednostka to pojedynczy łańcuch białkowy o masie cząsteczkowej 17 500, złożony ze 158 reszt aminokwasowych. Każda z podjednostek jest w kontakcie z RNA, wiążąc ze sobą prawie trzy nukleotydy.

Wirusy namnażające się w roślinach podzielono na grupy, a nie na rodziny, rodzaje i gatunki.

Zgrupowania dokonano na podstawie wspólnych cech morfologicznych i biochemicznych. Wyróżniono 20 grup wirusów namnażających się w roślinach.

Wirusy należące do dwu rodzin Reoviridae i Rhabdoviridae namnażają się zarówno w roślinach jak i bezkręgowcach.

Np. Bromovirus- wirus mozaiki stokłosy

Tobamovirus- wirus mozaiki tytoniu

Grupa wirusa nekrozy (martwicy tytoniu)- wirus nekrozy tytoniu

Grupa wirusa plamistej rdzy pomidorów

Grupa wirusa mozaiki lucerny

Grupa wirusa pasiastej mozaiki jęczmienia itp.

Grupa Potervirus- wirus X ziemniaka (symetria helikalna).

Wirusy roślinne II

Następstwem infekcji jest choroba, której towarzyszą charakterystyczne objawy. Namnażający się wirus w komórce powoduje wyraźne zmiany fizjologiczne i biochemiczne. Z komórki zakażonej, wirus przenosi się do sąsiednich komórek, tkanek organów rośliny. Wirus może zmienić pokrój każdego organu, funkcje i proces metabolicznych. W niektórych roślinach o małej wrażliwości- łagodne objawy- tolerancja, u innych wrażliwość może być tak duża, że następuje zamieranie komórek, hamując jego dalsze przemieszczanie.

Zakażone komórki dają obraz tzw. plamek lokalnych. Pierwszą reakcją na zakażenie jest rozpad chlorofilu i innych barwników. Tworzą się w liściach przejaśnienia jedne bardzo mało widoczne pod mikroskopem inne widoczne gołym okiem. Plamki się powiększają a środkowe komórki zamierają dając zjawisko nekrozy i w przypadku powiększających się plamek może spowodować zamieranie liści. Plamki nekrotyczne różnią się pomiędzy sobą wielkością i barwą od brunatnej lub czerwonej do czarnej, plamki nekrotyczne mają postać współśrodkowych pierścieni.

Z chwilą gdy wirus poprzez tkanki miękiszowe liścia przedostaje się do wiązki przewodzącej i dosięgnie floemu zaczynają się zmiany w organizmie rośliny noszące nazwę wtórnych lub systemicznych.

Wirus jest transportowany głównie przez wiązki sitowe wraz z substancjami odżywczymi do rosnących organów rośliny. Gdy dosięgnie górnych liści, jego transport się kończy i następuje dalsze przemieszczanie w miękiszu liścia z komórki do komórki. Dlatego objawy systemiczne zaczynają się często w najbliższym sąsiedztwie wiązek przewodzących. Nerwy liściowe pod wpływem wirusa mogą ulegać przejaśnieniu, chlorozie lub zżółknięciu (mogą reagować tez nekrozą).

Zmiany chlorotyczne mogą powodować mozaikę lub układać się koncentrycznie w postaci smug, stąd nazwy: wirus mozaiki tytoniu, brązowa plamistość pomidorów.

Wirusy mogą powodować:

• Zmiany barwy liścia- wirus żółtaczki buraka ( rozkład chlorofilu związany ze wzmożoną produkcją karotenów i ksantofilów).

• Zmiana barwy kwiatów- rozbicie barwy w płatkach kwiatów. Wirus pstrości tulipana- jasne białe smugi ( zahamowanie syntezy antocyjanu, bądź gromadzenie się intensywniejsze barwników w skórce). U mieczyków- porażenie przez wirus mozaiki ogórka

• Objawy chorobowe na owocach- wskutek porażenia owocni powstającej z dna kwiatowego ścian zalążni- te same objawy co na liściach, łodygach i kwiatach.

Np.

1. dojrzałe pomidory- porażone przez wirus mozaiki tytoniu są żółte lub pomarańczowe

2. Brzoskwinie- mają intensywniejszą barwę

• Wirusy mogą powodować całkowita bezpłodność roślin

• Zahamowanie wzrostu- może dotyczyć wszystkich organów rośliny

• Zniekształcenia- zaburzenia harmonii budowy morfologicznej rośliny mogą się objawiać nadmiernym rozwojem organu lub tkanki lub przeciwnie na zahamowaniu rozwoju, brak równowagi w procesie wzrostu poszczególnych części liścia jak ogonek, blaszka, nerw główny.

• Objawy miotlastości, proliferacji ( tzw. czarcia miotła) rozwój pędów z uśpionych pąków, pęd szczytowy przestaje rosnąc i cała roślina zmienia pokrój. Objawy te mogą występować na drzewach, krzewach, ziemniakach.

• Zielenienie kwiatów- rozwój chloroplastów w płatkach

• Narośle- wirus narośli przyrannych- kuliste zgrubienie mogące powstać na nerwach liści, płatkach kwiatów0- nadmierne podziały komórek

Roślina nie jest biernym gospodarzem ale w różny sposób reaguje na zakażenie:

• Zakażenie może zakończyć się śmiercią, jeżeli jest silna inwazja wirusa

• Zakażenie może przejść w zakażenie chroniczne z małymi objawami

• Może nastąpić wyzdrowienie rośliny (mogą dominować szczepy łagodne, warunki klimatyczne, ekologiczne)

Oprócz zmian morfologicznych na roślinie można wyróżnić zmiany w poszczególnych komórkach w mikroskopie świetlnym- zmiany cytologiczne.

Wewnątrz zakażonych komórek mogą występować:

• Zmodyfikowane poszczególne elementy komórki

• Ciałka wtrętowe

Iwanowski w 1903r. opisał dwa rodzaje specyficznych ciałek wtrętowych w komórkach liści porażonych wirusem mozaiki tytoniu:

• Ciała krystaliczne

• Skupienia galaretowate bez określonych kształtów. Te bezpostaciowe inkluzje nazwano później ciałkami X

Ciałka X mogą być obserwowane pod mikroskopem w żywych komórkach włosków skórki liścia porażonych różnymi wirusami. Są to guzełkowate, galaretowate skupienia o nieustalonym kształcie, średnicy od 5μm do 30μm unoszone prądem cytoplazmy. Uwidacznia się je 0,5% roztworem różu bengalskiego lub fuksyny. Nie są to twory jednolite. Są to nieuporządkowane, nieobłonione skupienia zarówno pojedynczych elementów komórkowych (rybosomy, mitochondria) oraz cząstki wirusów w mniejszej lub większej ilości. Te ciałka mają dużą wartość diagnostyczną. Opisano 45 wirusów wywołujących w roślinach ciałka wtrętowe.

Inkluzje Krystaliczne można je obserwować w mikroskopie świetlnym umieszczając tkankę w kropli soli fizjologicznej. Różnią się od normalnie występujących ciał krystalicznych np. szczawianów tym, że:

• Nie rozpuszczają się w środowisku kwaśnym

• Pod działaniem słabych kwasów rozpadają się na krystaliczne igły, które mają zdolność do tworzenia agregatów w formie większych lub mniejszych wiązek. W mikroskopie elektronowym stwierdzono, że są one zbudowane wyłącznie z cząstek wirusa ułożonych w szeregach, stykających się pod kątem na kształt jodełki. Inkluzje te mogą mieć różnorodną budowę u różnych wirusów.

Zmiany anatomiczne:

Zewnętrzne objawy chorób wirusowych roślin znajdują swoje odbicie w zmianach anatomicznych,. Zmiany anatomiczne dzielimy na:

• Nekroza lub śmierć komórek albo całych tkanek

• Nadmierny wzrost i różnicowanie komórek czyli hiperplazje

• Zahamowanie wzrostu komórek aż do zupełnej ich degeneracji- hipoplazje

• Przekształcenie się już istniejących komórek np. korkowacenie komórek skórki u jabłek

Pseudowirusy- małe wiriony, zamiast RNA wirusowego zawierają tRNA pochodzący z komórki gospodarza ( wirus mozaiki oberżyny pseudowieloskładnikowy)

Wirusy satelitarne (wirus nekrozy tytoniu) nie są one infekcyjne, zawierają tylko informacje dla syntezy białek kapsydu, nie ma informacji dla białek funkcjonalnych. Jego rozwój uzależniony jest od wirusa nekrozy tytoniu, który zawiera jednoniciowy RNA plus policistronowy, brak struktury cap jak u bakteriofagów. Wirus satelitarny nie jest nie jest fragmentem genomu wirusa nekrozy ani wytworem gospodarza. Jest to autonomiczna jednostka genetyczna, pochodzenie nie jest znane. Być może pochodzi od wirusów wieloskładnikowych, wirusów RNA, ma większe powinowactwo do rybosomów aniżeli wirus pełny nekrozy tytoniu. Wirus ten interferuje z pełnym wirusem. Zjawisko to występuje też u zwierzęcych.

WIRIODY

Wiriody- czynniki subwirusowe, samoreplikujące się, nagie kwasy nukleinowe RNA.

Są one czynnikami patogennymi dla roślin wyższych, wywołując objawy podobne do powodowanych przez wirusy roślinne. Wykryto aż 9 takich czynników u roślin. Najwcześniej wykryto jako czynnik odpowiedzialny za chorobę ziemniaka. Zakażenie wirusem zachodzi przez mechaniczne uszkodzenie rośliny, rzadziej przez pyłek. Gospodarzami wiriodów może być większość roślin jednorocznych ,ale rozwieź rośliny cytrusowe. We wszystkich przypadkach zakażenie przebiega jako systemiczne z objawami ogólnymi.

Cząsteczka wiriodowego RNA (na podstawie analiz chemicznych) jest wydłużona, kołowa i charakteryzuje się dużą ilością heliakalnych odcinków dwuniciowych występujących na przemian z wewnętrznymi pętlami jednoniciowymi. Zwarta struktura chroni go przed degradacją nukleolityczną, z drugiej strony obszary niesparowane prawdopodobnie uniemożliwiają rozpoczęcie replikacji RNA.

W świetle badań należy założyć, że replikacje oraz cyrkulacje Wiriody prowadzone jest przez enzymy gospodarza ponieważ RNA Wiriody jest za małe aby kodować specyficzne białka. Replikacja zachodzi w jądrze komórkowym z użyciem komórkowej polimerazy RNA zależnej od DNA.

Nie wiadomo z czego wynika patogenność wiriodów. Trudno przypuścić by wpływał znacząco na metabolizm komórki gospodarza być może RNA Wiriody wchodzi w interakcje z pewnymi komponentami komórek gospodarza. I wpływa na ich metabolizm.

Aby doszło do zakażenia komórki muszą być spełnione warunki:

• Komórka musi mieć na swojej powierzchni receptory dla „białka wiązania wirusa” (klucz + zamek), które pozwolą na adsorpcję i wniknięcie wirusa do komórki

• Komórka musi zapewnić odpowiednie warunki do replikacji wirusa (niekiedy wirus replikuje się tylko wtedy, jeżeli komórka również się replikuje). Białka komórkowe mogą aktywować promotory wirusowe i pomagają w ekspresji genów wielu wirusów; ponadto odpowiednią temperaturę, pH itp.

Fazy replikacji wirusowej:

1. Adsorpcja - wirus za pomocą „białek wiązania” przylega do swoistych receptorów zwykle glikoprotein na błonie komórkowej.

2. Przenikanie wirusa do komórki następuje za pomocą następujących mechanizmów:

• wirusy otoczkowe mające glikoproteiny powierzchniowe dostają się za pomocą fuzji otoczki z błoną komórkową gospodarza

• pinocytozy (endocytozy, wiropeksji). Wirus połączony z receptorem zostaje zintegrowany w pęcherzykach błony pokrytych białkiem zwanym klatryną, które się stają pęcherzykami wewnątrzkomórkowymi.

• bardzo małe wirusy przenikają przez pory w błonie komórkowej

3. Rozbieranie wirusa - uwalnianie kwasu nukleinowego wirusa:

Nukleokapsydy migrują do cytoplazmy

1. - bezpośrednio jeżeli wirus dostał się drogą fuzji otoczki z błoną komórkową

2. - jeżeli droga endocytozy - wiropeksji, następuje fuzja z wodniczkami komórkowymi, których kwaśne pH powoduje uwolnienie nukleokapsydu do cytoplazmy. Proteazy komórkowe i wirusowe trawią białka ochronne, uwalniają kwas nukleinowy, kapsydy zostają zniszczone w kwaśnym środowisku wodniczki.

Po odpłaszczeniu zaczyna się faza eklipsy - kiedy wirusa nie można wykryć w komórce - trwa ona do chwili powstania wirionów potomnych.

4. Faza eklipsy - obejmuje replikację kwasu nukleinowego oraz syntezę białek wirusowych. Białka wirusowe powstają w cytoplazmie, miejsce replikacji kwasów nukleinowych jest zmienne.

Cykl replikacyjny wirusa zależy od genomu wirusowego.

Wirusy DNA o podwójnej nici.

• Wirusowy DNA w jądrze komórkowym ulega transkrypcji na mRNA, z udziałem komórkowych polimeraz RNA zależnych od DNA

• Translacja prowadzi do syntezy białek „wczesnych” tzw. białek regulatorowych, polimeraz kodowanych przez wirusa. Białka regulatorowe hamują syntezę DNA, RNA i białek komórki gospodarza, jednocześnie wzmagając ekspresję genomów wirusowych

• Synteza potomnych nici kwasu nukleinowego odbywa się z udziałem polimeraz kodowanych przez wirusy. Cząsteczki nowego DNA są przeznaczone dla nowych wirionów, część zaś ulega transkrypcji na mRNA (późne) i następuje

• Ekspresja białek późnych - białek strukturalnych tworzących kapsyd, jak też wchodzących w skład glikoprotein otoczki

Wirusy o pojedynczej nici DNA+

• wkrótce po infekcji w komórce zachodzi synteza nici minus DNA, komplementarnej do nici +DNA

• powstaje 2 niciowa kołowa forma zwana replikacyjną RFI

• ulega ona transkrypcji na mRNA - komplementarnej do nici -DNA

• synteza potomnych kołowych jednoniciowych nici +DNA i dalej jak u wirusów z 2niciowym DNA

Wirusy zawierające RNA+ (o dodatniej polarności)

• Maja genomy, które ulegają bezpośrednio translacji z udziałem komórkowych polirybosomów na duże białka, które przechodzą podział podczas modyfikacji potranslacyjnej

• Faza wczesna - w wyniku modyfikacji poliprotein przez proteazy wirusowe i komórkowe są tworzone enzymy: wirusowa polimeraza RNA zależna od RNA, proteazy.

• Faza późna - następuje przepisanie nici RNA+ na nić -RNA, które służą jako matryce do syntezy nowych nici RNA+. Nowy RNA+ zostaje wcielony do wirionów potomnych oraz służy do syntezy białek strukturalnych.

Wirusy zawierające RNA- (o ujemnej polarności)

• Transkrypcja (-RNA) na nić +RNA z użyciem wirusowych, własnych polimeraz

• translacja na niciach +RNA (spełniają rolę mRNA) - białka funkcjonalne

• nici +RNA służą jako matryce do syntezy -RNA dla wirusów potomnych

• nici -RNA służą również jako matryce do syntezy +RNA (mRNA) a te z kolei do syntezy białek późnych (strukturalnych) oraz wirusowej polimerazy, które będą umieszczone w potomnych cząstkach

Retrowirusy zawierają nić +RNA ale też odwrotną transkryptazę. Replikacja tych wirusów jest procesem unikatowym. Na nici +RNA przy pomocy odwrotnej transkryptazy syntetyzowane są nici:

• DNA (-) wskutek odczytu w kierunku 3'-5'

• powstają komplementarne nici +DNA, wskutek czego tworzy się 2niciowe DNA - dostaje się do jądra komórki gospodarza następnie ulega integracji z DNA komórki - prowirus, po czym następuje transkrypcja i powstają nici +RNA służące do budowy nowych genomów, jak też stanowią mRNA do syntezy białek wirusa.

Dojrzewanie (morfogeneza)

Tworzenie potomnych wirusów oznacza koniec fazy eklipsy. Wirusy potomne żeby były zakaźne muszą zawierać kwas nukleinowy. Łączenie się kwasu nukleinowego z kapsydem jest uwarunkowane swoistą sekwencją wirusowego kwasu nukleinowego, które określają interakcje między kwasem nukleinowym a białkiem kapsydu.

Tworzenie się kapsomerów a później kapsydu również jest zapisane w genomie wirusa. (Białka wirusa mają zdolność samoagregacji). Dojrzewanie wirusów bezotoczkowych odbywa się w jądrze lub w cytoplazmie, skąd uwalniane są w wyniku lizy komórki.

Wirusy otoczkowe proces dojrzewania kończą na błonie cytoplazmatycznej komórki.

Białka otoczki wirusowej ulegają glikozylacji i są transportowane i umieszczane w błonach komórkowych (w błonie jądrowej w przypadku herpes wirusów). Glikoproteiny otoczki wirusa umieszczone są na zewnętrznej warstwie nukleokapsydu odpowiednimi wiązaniami a następnie odrywają z błon komórkowych fragmenty podwójnej błony lipidowej co prowadzi do utworzenia otoczki - kończąc proces dojrzewania wirusa.

Uwalnianie wirusa

Może się odbywać w dwojaki sposób:

1. Pączkowanie - cząstki wirusowe pączkujące z błony komórkowej uwalniane są bezpośrednio do płynu zewnątrzkomórkowego zaś pączkujące z błony jądrowej, błon rybosomalnych są transportowane w cytoplazmie a następnie uwalniane z komórki. (Zaangażowany jest system transportu biorący udział w wydzielaniu innych białek komórkowych). Wirusy te uwalniane są w sposób ciągły.

2. Liza zakażonej komórki przez enzymy lityczne. Uwalnianie wirusów w sposób wybuchowy, komórka ulega zniszczeniu. Tak uwalniane są wirusy nagie.

3. Pewne wirusy nie są uwalniane do przestrzeni międzykomórkowych, ale dostają się do sąsiednich komórek przez pory łączące błony komórkowe.

Wirusowe zakażenie organizmu

Aby wywołać chorobę wirus musi dostać się do organizmu gospodarza - są to wrota zakażenia. Są nimi skóra albo błony śluzowe. Przy czym skóra a właściwie nabłonek płaski skóry jest barierą. By mogło dojść do zakażenia niezbędny jest uraz.

Natomiast w przypadku błon śluzowych nie jest konieczny uraz ponieważ wirusy absorbują się bezpośrednio do komórek nabłonka, w którym zachodzi cykl replikacyjny i niekiedy występują zmiany chorobowe - zakażenie miejscowe np. spojówki. Jednakże układ przez który wirus się dostaje na ogół nie jest dotknięty chorobą.

Zakażenie przez uszkodzony naskórek (wtarcie):

• wirusy brodawek

• wirusy herpes simplex - opryszczka na twarzy, palcach, narządach płciowych

Zakażenie na wskutek ugryzienia:

• przez owada: Arbowirusy - wirusy przenoszone przez komary, kleszcze - zapalenie opon mózgowych, goraczki tropikalne.

• przez ssaka: wirus wścieklizny

Otarcie naskórka lub wprowadzenie wirusa zakażoną igłą:

• wirus zapalenia wątroby typu B i C

• wirus HIV

Wnikanie przez układ oddechowy (kichanie - aerozol z zarazkami, kaszel, bliski kontakt)

• wirus grypy

• wirus odry

• wirus świnki

• wirusy przeziębień, katar - Rhinowirusy

Wnikanie przez układ pokarmowy. Wirusy te oporne są na inaktywację w przewodzie pokarmowym.

• wirus choroby Heinego-Medina (Poliomielitis)

• inne enterowirusy - choroby gorączkowe z zajęciem mięśni (mięśnia sercowego) lub ośrodkowego układu nerwowego.

• wirusy zapalenia żołądka i jelit (Rotavirusy). Wirusy, które kolonizują przewód pokarmowy mogą być wydalane z kałem przez wiele dni i tygodni

Wnikanie przez spojówki

• wirus zapalenia spojówek i rogówki - Adenowirusy, Enterowirusy

Wnikanie przez układ moczowo-płciowy: wirus HIV, zapalenia wątroby typu B, wirus opryszczki płciowej, wirus brodawek szyjki macicy.

Transplantacja szpiku kostnego, nerek: cytomegalowirusy i wirus Epsteina Barr.

Transfuzje krwi: wirusy hepatis B i C, wirus HIV

Zakażenie z matki na płód:

• przez łożysko: wirus różyczki, cytomegalowirus

• w trakcie porodu: cytomegalowirus, wirus opryszczki, HIV, wirus zapalenia wątrobyB

• z mlekiem matki: cytomegalowirus, HIV

Zakażenia miejscowe - skóry, spojówek, błon śluzowych układu oddechowego - zmiany we wrotach zakażenia, objawy po 1-3 dniach.

Zakażenia ogólnoustrojowe

Patogeneza wielu zakażeń nie znana: brak odpowiednich modeli do badań, trudnosci w pracy z niebezpiecznymi patogenami - gorączki.

Jednakże dla wielu wirusów ich drogi szerzenia się w organizmie przebiegają wg modelu:

1. zakażenie i wstępna replikacja we wrotach zakażenia, namnażanie się w węzłach chłonnych miejscowych

2. wirus we krwi - pierwotna wiremia

3. wirus dostaje się do narządów układu siateczkowo-śródbłonkowego (wątroba, śledziona, szpik kostny) i tu się namnaża

4. dostaje się do krwi - wtórna wiremia

5. z krążenia wirus dostaje się do narządu docelowego, rodzaj którego zależy od tropizmu i tu występują objawy kliniczne.

Narządy docelowe to:

• wątroba - hepatis A, B, C

• ośrodkowy układ nerwowy - poliomielitis, arbowirusowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (drogą krwi), wirus opryszczki, półpaśca, wścieklizny (drogą nerwów)

• skóra, błony śluzowe - różyczka, odra, ospa, ospa wietrzna

Okres inkubacji:

• krótki okres inkubacji w dniach: przeziębienie, grypy 1-3; przez arbowirusy 3-6

• średni czas inkubacji w dniach: odra 13-14, różyczka 14-16, ospa wietrzna 13-17, świnka 14-18

• długi okres inkubacji w tygodniach: zapalenie wątroby typu A 3-5, typu B 10-12, manonukleoza zakaźna 4-6, wścieklizna 4-7.

Bardzo długie okresy inkubacji - wirusy powolne - w latach, np. wirus odry: podostre stwardniające zapalenie mózgu

Zjawisko latencji wirusowej

Polega ono na tym, że wirusowy kwas nukleinowy może integrować się z komórkowym kwasem nukleinowym lub występować w postaci episomalnej jako kolista cząsteczka niezależna od DNA gospodarza. Wirus ukrywa się w ten sposób przed mechanizmami obronnymi organizmu i wtedy organizm pozostaje trwale zakażony.

Zależnie od rodzaju wirusa zajęte są różne rodzaje komórek. Takie utajone zakażenia mogą powstać szybko po zakażeniu pierwotnym (np. wirus opryszczki) lub mogą być opóźnione o 2-3 lata - wirus hepatis B.

Wirusy opryszczki, ospa wietrzna, półpasiec - neurony w zwojach korzeni tylnych.

Epsteina Barr - limfocyty B

Zapalenie wątroby typu B - hepatocyty

Wirus brodawek - nabłonek skóry

Wirusy onkogenne RNA - komórki somatyczne i rozrodcze

Wirus HIV - limfocyty T, makrofagi, komórki mózgowe

Zakażenia utajone (latentne):

• mogą nie spowodować choroby

• mogą ulegać reaktywacji nawet kilkakrotnie i powodować objawy choroby

• niektóre utajone zakażenia mogą prowadzić do choroby nowotworowej

Następstwa przebycia zakażeń wirusowych

Zakażenie wirusowe może zakończyć się:

1. Śmiercią, jeżeli wirus osiągnie przewagę w organizmie, proces odnowy następuje wolniej niż proces niszczenia komórek, nastąpi uszkodzenie narządu życiowo ważnego, wskutek wykrwawienia się organizmu.

2. Pacjent zostaje przy życiu, ale mogą pozostać trwałe uszkodzenia narządów i tkanek.

3. Rozwój zakażenia może być zahamowany dzięki wzbudzonym mechanizmom nieswoistej odporności (interferon) oraz swoistych reakcji immunologicznych, zakażenie może przejść w zakażenie bezobjawowe.

4. Wirus może się ukryć przed układem immunologicznym integrując się z genomem komórki gospodarza, zjawisko latencji.

5. Zakażenia wirusowe mogą osłabiać odporność organizmu przez uszkodzenie narządów immunologicznych.

6. Zakażenia wirusowe mogą doprowadzić do uszkodzenia zarodków i płodów w następstwie zakażenia ciężarnej macicy.

7. Zakażenia wirusowe mogą być komplikowane przez zakażenia bakteryjne i grzybicze.

8. Zakażenia wirusowe mogą wywołać chorobę nowotworową.

Odporność przeciwwirusowa nieswoista.

Bariery fizjologiczne:

• Skóra nieuszkodzona (niskie pH, pot, tłuszcz, łój)

• Błony śluzowe - część wirusów znajduje receptory

• Bariera krwio-mózgowa - hamuje rozprzestrzenianie się wirusów neurotropowych

• Ruch rzęsek nabłonka (uszkodzony przez wirusy otwiera drogę bakteriom)

• pH żołądka, np. enterowirusy są niewrażliwe, Rhino - wrażliwe

Układ dopełniacza

Białka dopełniacza maskują lub pokrywają miejsca wiązania na wirusie i uniemożliwiają przyczepienie się do komórki

• mają zdolność lizy wielu wirusów otoczkowych

• wzmagają fagocytozę przez receptor C₃D

Układy komórek

Fagocytoza - nie zawsze giną wirusy, mogą namnażać się w leukocytach i stanowić źródło zakażenia różnych tkanek po przejściu przez ściany naczyń krwionośnych - z drugiej strony przenoszą wirusy do węzłów chłonnych - pobudzają odporność swoistą.

• Komórki NK - powstają i różnicują się w szpiku kostnym, powodują cytolizę komórek zakażonych wirusem, wzmaga tą cytolizę interferon γ, nie podlegają restrykcji MHC, wydzielają INF α, INF γ, TNF-α.

• Cytotoksyczne makrofagi - aktywowane makrofagi (przez cytokiny, INF γ, TNF-α) mogą niszczyć wybiórczo komórki zakażone niektórymi wirusami.

• Dużą rolę odgrywają makrofagi tkankowe w zapobieganiu rozwoju zakażenia (np. komórki Kupffera, makrofagi płuc)

• Makrofagi produkują interferon i limfokiny.

• Rola makrofagów zależy od rodzaju wirusa i od gospodarza

TNF - czynnik martwicy nowotworów, wywiera działanie przeciwwirusowe.

Nieswoiste inhibitory zawarte w surowicy mogą wywierać hamujący wpływ na rozprzestrzenianie się wirusa. Są indywidualne różnice w ich zawartości u różnych gospodarzy.

Oporność na zakażenie wzrasta z wiekiem co może być uwarunkowane:

• zmianą metabolizmu komórek

• większą ilością receptorów dla wirusa u młodych osobników

• mniejszą zdolnością do produkowania interferonu u młodych

• pojawieniem się z wiekiem nowych enzymów utrudniających namnażanie

• wzrostem szczelności bariery krwio-mózgowej

• stabilizacją mechanizmów termoregulacji cieplnej u noworodków

Interferencja wirusowa

W 1957r. Isaacs i Lindenmann wykazali, że za to zjawisko odpowiada interferon. Syntezą interferonu (INF) koduje genom komórki gospodarza. Pod wpływem obcego kwasu nukleinowego wirusa następuje derepresja odpowiedniego cistronu DNA gospodarza → transkrypcje mRNA i translacje dla produkcji interferonu. Interferon opuszcza komórkę i reaguje z receptorami błon komórek sąsiednich i tych, które go wytworzyły, w efekcie w tych komórkach następuje derepresja genów kodujących syntezę, tzw. drobin AVEM (antivirial effector molecules), które powodują stan rezystencji na zakażenia wirusowe.

Te drobiny to:

• kinaza białkowa, która hamuje syntezę białek wirusowych

• polimeraza oligonukleotydowa, powoduje aktywację endonukleaz trawiących mRNA, co zapobiega replikacji wirusa.

Białka te hamują translację wirusowego mRNA.

Interferony mogą hamować inne etapy replikacji wirusowej.

Inne działanie przeciwwirusowe to aktywacja genu Mx, który jest obecny w komórkach wszystkich ssaków. Produkt tego genu hamuje w nieznany sposób replikację wirusa grypy i innych wirusów RNA.

Interferon - właściwości:

• jest glikoproteidem - cześć węglowodanowa decyduje o jego wiązaniu się z komórką a białkowa determinuje biologiczną aktywność

• zabezpiecza komórki przed różnymi wirusami - brak swoistości

• wykazuje swoistość gatunkową, działa tylko w organizmie w którym powstał, nie ma swoistości tkankowej.

• powstaje pod wpływem obcego kwasu nukleinowego

• może powstawać w różnych komórkach

• nie działa bezpośrednio na wirus tylko na komórkę czyniąc ją niewrażliwą na zakażenia

RNA - wirusy są bardziej wrażliwe niż DNA na działanie interferonu.

Interferony można dzielić np. ze względu na źródło pochodzenia - ludzki, kurzy, bydlęcy itp.

Na podstawie swoistości antygenowej dzielimy je na:

• interferon typu α (alfa) leukocytarny

• interferon typu β (beta) fibroblastyczny

• interferon typu γ (gamma) immunologiczny.

Interferony α i β są indukowane przez wirusy i syntetyczne nukleotydy. Są oporne na pH 2.0 i powodują szybko stan niewrażliwości, już po kilku minutach.

INF γ - immunologiczny jest indukowany w uczulonych limfocytach przez swoiste antygeny, jest wrażliwy na pH 2, a stan niewrażliwości na zakażenie powoduje dopiero po kilku godzinach kontaktu z komórkami.

Interferon γ działa przeciwwirusowo za pośrednictwem następujących procesów:

• Indukcji syntetazy tlenku azotu, która hamuje replikacje wirusową, podwyższając wewnątrzkomórkowe stężenie azotu

• Zwiększania ekspresji antygenów obu głównych układów zgodności tkankowej MHC-1, MHC-2, ułatwiając tym samym aktywację i funkcje efektorowe cytotoksycznych limfocytów T, zdolnych do niszczenia komórek zakażonych wirusem

• Aktywacji monocytów, makrofagów i komórek NK niszczących komórki zakażone wirusem bez udziału mechanizmów immunologicznych.

Ponad to interferony oprócz działania przeciwwirusowego mogą:

• hamować podziały komórkowe (do leczenia nowotworów) - sposób bezpośredni i pośredni - wzmaganie genów MHC

• modulować działanie układu immunologicznego - aktywują limfocyty Tc, makrofagi, komórki NK - czynnik immunostymulujący

• zwiększają ekspresję antygenów MHC

Interferon α i β działają w bardzo wczesnych stadiach zakażenia, kiedy brak przeciwciał, później interferon γ stanowi jeden z komponentów odpowiedzi immunologicznej.

Wykład8

Swoista odporność przeciwwirusowa

Wirus jest dla organizmu antygenem, jest rozpoznawany jaki obcy i wzbudza odpowiedź układu immunologicznego.

Nośnikiem właściwości antygenowych u wirusa są białka kapsydu, otoczka i wypustki otoczki, białko hamaglutyniny, neyramidazy.

W zakażeniach wirusowych odgrywa rolę odporność humoralna (ogólnoustrojowa i miejscowa) oraz odporność komórkowa- ogólnoustrojowa, także i miejscowa.

Organizm jest odporny na dane zakażenie wirusowe, jeżeli przeciwciało lub populacja immunologicznie czynnych komórek znajdzie się w takim miejscu i takiej ilości, że może reagować z wirusem zanim on osiągnie te komórki, których uszkodzenie daje charakterystyczne objawy chorobowe.

Ponieważ większość wirusów najpierw namnaża się w narządach pierwotnego powinowactwa i stąd się przenosi, ważne jest aby czynniki obronne były gotowe nim nastąpi druga faza.

Działanie ochronne przeciwciał polega:

1. na swoistym wiązaniu się z wirusem wskutek czego traci on zdolność adsorpcji na komórce

2. również nawet po dostaniu się wirusa do komórki, przeciwciało może hamować jego namnażanie się (zaburzony proces opłaszczania)

3. wraz z dopełniaczem następuje wiroliza u wirusów otoczkowych

4. kolejny mechanizm to immunologiczna cytoliza- rozpuszczenie komórek zakażonych wirusem. Ma to szczególne znaczenie w sytuacji kiedy wirusy przechodzą bezpośrednio z komórki do komórki

5. przeciwciała jako opsoniny wzmagają jego fagocytozę.

Generalnie przeciwciała odgrywają rolę w zakażeniach kiedy wirus musi przejść przez krwioobieg.

W sytuacji kiedy czynnik zakażny wchodzi bezpośrednio w kontakt z komórką będącą ostatecznym celem ataku (grypa, katary nosa, krowianka) w tych przypadkach podanie przeciwciał nie daje efektu.

Lokalna odporność humoralna , szczególnie sekrecyjna (IgG w mleku matki) działają np. na wirus polio,neutralizują wirusa na błonach śluzowych przewodu pokarmowego.

Odporność komórkowa:

- limfocyty cytotoksyczne - rozpoznają komórki zakażone wirusem przez MHC I

- limfocyty helpery- wydzielają interleukinę 2, 4, 5,6, aktywują inne limfocyty Th jak też LC, limfocyty b, makrofagi.

Odporność miejscowa komórkowa- limfocyty znajdują się na wydzielniczych powierzchniach błon śluzowych, może być pobudzona niezależnie od ogólnoustrojowej.

Trudność zabezpieczenia organizmu przeciw chorobom wirusowym:

1. duża liczba serotypów wirusów wywołujących syndrom danej choroby np.: łagodne zakażenia górnych dróg oddechowych

2. duża plastyczność antygenów wirusów (wirusy grypy , pryszczycy)

3. interferencja między szczepami

4. pojęcie pierworodnego grzechu immunologicznego: organizm reaguje najsilniej na antygeny wirusa z którym zetknął się już w przeszłosci.

Preparaty przeciwwirusowe

Leki przeciwwirusowe hamują bądź blokują kolejne etapy zakażenia i replikacji wirusów w komórce:

Mogą one:

1. interferować z adsorpcją wirusa do receptorów komórkowych, hamować penetrację i odpłaszczanie

2. hamować enzymy kodowane przez wirus, np. odwrotną transkryptazę

3. hamować transkrypcję genomu

4. hamować proces translacji wirusowego mRNA

5. interferować z genami regulatorowymi wirusa

6. interferować z glikozylacją białek wirusowych

7. interferować z organizacją nukleokapsydu

8. interferować z uwalnianiem wirusa z komórki.

Nie wchodzi w grę działanie preparatów na wirus pozakomórkowy (preparaty dezynfekcyjne) - silne środki uszkadzały by komórki.

Wyjątek stanowią barwniki powodujące fotodynamiczną inaktywację wirusa opryszczki. Proflawina i czerwień obojętna wiąże się z wirusem i czyni go wrażliwym na działanie światła. Generalnie gdzie można należy unikać styczności z wirusem.

I etap zakażania- adsorpcja wirusa na zasadzie- białko wiązania - receptor komórkowy.

Dokonuje się prób syntetyzowania białek wiązania ( drogą inżynierii genetycznej ), które blokowałyby receptory komórek i nie dochodziłoby do zakażenia komórki, Są próby w przypadku HIV - syntetyczne receptory komórkowe wiązały by się z receptorami,Anie limfocytami T.

II etap - przenikanie, takie preparaty jak: amantadyna, rymantadyna przy grypie, tromantadyna - w leczeniu zakażeń skóry i błon śluzowych wirusem opryszczki.

III etap- odpłaszczanie (rozbieranie)- amantadyna, rymantadyna podwyższa pH w wodniczkach wewnątrzkomórkowych uniemożliwiając uwolnieni kwasu nukleinowego.

IV- faza eklipsy

Transkrypcja

Replikacja Kwasów nukleinowych

Translacja

Na tym etapie stosuje się:

• analogi nukleozydów - dzięki podobieństwu do zasad purynowych lub pirymidynowych są wbudowywane do kwasu nukleinowego i takie kwasy nie mogą pełnić właściwie swoich funkcji, albo blokuja centrum aktywne enzymu. Należą tu:

- jododezoksyurydyna JDU- w miejsce tymidyny,

- rybawiryna - analog guanozyny współzawodniczący z guanozyną o enzymy zaangażowane w wytwarzanie guanozynotrójfosforanu. GTP jest związkiem, od którego zaczyna się synteza mRNA. Stosowana w formie aerozolu w infekcjach dolnych dróg oddechowych ( grypa A, B, RS).

• Inhibitory polimerazy DNA

- arabinozyd adeniny (Ara A) - w zakazeniach herpeswirusami (opryszczkowe zapalenie mózgu, półpasiec, opryszczka)

- Acyklovir - acykliczny nukleozyd guaniny - w leczeniu zakażeń herpeswirusami

Gromadzi się tylko w komórkach zarażonych wirusem Herpes (opryszczka), ospy wietrznej. Preparat ten do komórki dostaje się w formie nieaktywnej, dopiero enzym kinaza tymidynowa kodowana przez wirus herpes przeprowadza go w formę jednofosforanową pochodną, a ta przekształcona przez enzymy komórki w trójfosforanowy acyklowir. Acyklovir jest jednym z podstawowych leków w leczeniu zakażeń wirusem Herpes simplex, ale nie działa na zakażenia latentne.

- Ganeyklovir - podobne działanie

- Widarabina - nukleozyd purynowy, stosuje się w postaci wlewów dożylnych, przy zakażeniach wirusami Herpes: Cytomegalowirus, Epsteina - Barr

- Foskarnet - hamuje aktywność polimerazy DNA wirusów z rodziny Herpesviridae - leczenie zakażeń Cytomegalowirusami.

→ Inhibitory odwrotnej transkryptazy o budowie nukleozydowej

• Azytotymidyna AZT - zydowudina, pierwszy lek przeciwko retrowirusom, który wszedł na rynek, też ulega wewnętrznej fosforylacji Polimeraza odwrotna HIV jest około 100 x bardziej czuła na trifosforan

AZT w porównaniu z ludzką DNA polimerazą. Lek dosyć toksyczny. Poprawia stan kliniczny.

• Stawudina (HIV)

• Lamiwudina - działa na szczepy oporne na AZT

• Didanozyna (HIV)

• Zalcytabina (HIV)

→ Preparaty działające na biosyntezę białka, analogi aminokwasów:

• pfuoroalanina zniekształca płaszcz białkowy (kapsyd), niemożność wpudowania DNA

• Ampligen - dwuniciowy RNA o niciach nie w pełni komplementarnych, powoduje deformację mRNA wirusa HIV in vitro

→ Inhibitory proteaz - hamuja degradację dużych białek, które są prekursorami, np. białek otoczki wirusa

Tworzenie otoczek - inhibitory

Analogi glukozy: 2 dezoksy-2 glukoza zostaje wcielona do wirusowych swoistych glikoproteidów, hamuje syntezę wirusów otoczkowych

Uwalnianie wirusa - brak preparatów

PERSPEKTYWY: problem wczesnego wykrycia zakażeń wirusowych, najwięcej wirusów namnaża się w okresie inkubacji - rozwój choroby, gdy są objawy chorobowe wirusowa replikacja jest zwolniona. Leczenie w tym okresie spóźnione, raczej objawowe niż przyczynowe. Drugi problem to pojawianie się szczepów lekoopornych.

Wykład 9

Pierwsze nowotwory o etiologii wirusowej odkryto u kur - Rous w 1910r. męsaks Rousa (dopiero w 1966r. nagrodzono Noblem), później wykrył inne: sadzono, że wirusy mogą powodować nowotwory tylko u ptaków.

W 1933 r. Shope wykrył wirus wywołujący u dzikich królików nowotwory dobrotliwe (brodawczaki), u królików domowych zazwyczaj ulegają zezłośliwieniu.

Bitner- rak gruczołu mlekowego, 1951 r. limfotyczna, 1957 r. szpikowa białaczka myszy.

W każdej komórce organizmu znajdują się geny onkogeny c-onc (około 20), czynne w życiu płodowym i u młodych organizmów, później są w stanie supresji.

Geny onkogeny komórkowe - protoonkogeny kodują białka związane z podziałami, wzrostem i różnicowaniem komórek.

Przejście protoonkogenu w c-onc może nastąpić pod wpływem czynników:

• Endogennych - czynniki genetyczne, mutacje w genach supresorowych, upośledzenie systemu immunologicznego, zaburzenia hormonalne

• Egzogenne - czynniki:

• Fizyczne - radioaktywne

• Chemiczne - kancerogenne

• Wirusy

Obecnie ocenia się, że wirusy około 180 z 650 poznanych wykazuje potencjał onkogenny. Należą one do DNA: Pox, adeno, hepadna, papova, Herpes, RNA - retrowirusy.

Onkogenne działanie DNA wirusów:

• Wirusy wnoszą informację własną dla syntezy białek, które inaktywują białka kodowane przez geny supresorowe transformacji nowotworowej, np. białka F6, E7, wirus Papiloma

• Mogą tworzyć kompleksy z białkami supresorowymi gospodarza i w ten sposób aktywować komórkowe onkogeny, EBNA-3, EBNA-2, inaktywują białko p53, które w komórce hamuje podziały komórkowe

• Wbudowanie nowych sekwencji wirusowych do genomu komórki zmienia konformację chromatyny, translokację w genomie, delecję genów supresorowych lub ich mutacje

• Destabilizuje strukturę genomu komórki

Wirusy RNA nowotworowe Retrovirusy

Ich genom składa się z dwóch identycznych segmentów RNA. W komórce ich RNA zostaje przepisane na DNA i dopiero on stanowi matrycę dla mRNA, dla translacji białek, jak też do syntezy nic potomnych DNA i RNA - posiadają one DNA zależną polimerazę.

Te wirusy też mogą mieć cykl lityczny albo wbudowywać się do genomu gospodarza. Genom tych wirusów koduje trzy białka:

• gag - wewnętrzne struktury białkowe

• pol - polimerazy

• env - otoczkowy

Jednakże u niektórych stwierdzono obecność czwartego genu v - onc odpowiedzialnego za właściwości onkogenne. Prototypem tego wirusa jest wirus męsaks Rausa, któ®ego genom składa się z genów gag-pol-env-vonc.

Takie wirusy powodują transformację bardzo szybko w ciągu 2-5 tygodni genom koduje syntezę tyrozynoswoistej fosfokinazy uważanej za enzym rakowy. Powoduje on drastyczne zmiany w komórce. Stwierdzono, że geny v-onc są identyczne jak komórkowe c-onc.

Mechanizm onkogennego działanie tego typu wirusów opiera się na amplifikacji onkogenów (jest ich więcej). Ponadto przechwycony przez wirus komórkowy c-onc może ulec licznym modyfikacjom po wcieleniu do genomu retrowirusa, może być zdekompletowany lub nieprawidłowo rozbudowany, może zawierać mutacje punktowe. Zmiany sekwencji v-onc przejawiają się w zakażonej komórce synteza nieprawidłowych produktów białkowych, a ponieważ dotyczą białek regulatorów wzrostu i rozwoju komórki, prowadza do transformacji nowotworowej.

Do transformacji nowotworowej mają zdolność również ….., które nie maja onkogenu. Powodują one powolną transformację. Należą tu wirusy białaczek bydła i kotów. Indukują zmiany po 6-12 miesiącach w komórkach układu krwiotwórczego w określonych stadiach różnicowania.

Jest to następstwem aktywacji onkogenów komórkowych, czyli protoonkogenów.

Onkogenne retrowirusy mogą być przenoszone przez gamety lub mogą pochodzić z zewnątrz.

Cechy komórek transformowanych:

• zmieniony charakter wzrostu - utrata hamowania kontaktowego

• zmieniona morfologia

• przyspieszona szybkość wzrostu

• zmieniony metabolizm

• anomalie chromosomalne

• zdolność wywołania nowotworów w organizmie po przeszczepieniu

• pojawienie się nowych antygenów: antygenu T w jądrze komórki, antygen TSTA w błonie komórkowej, przy wirusach RNA antygen gs w cytoplazmie i błonie komórkowej odpowiadający TSTA

Rola odporności w nowotworach:

• pojawiające się nowe antygenu wzbudzają powstawanie przeciwciał

• działają limfocyty cytotoksyczne

• aktywne są naturalne komórki zabijające (NK), które wydzielają rozpuszczalne czynniki cytotoksyczne: perforyna, proteazy, TNF

• przeciwciała działają jak opsoniny - ułatwiają fagocytozę

• w zwalczaniu komórek nowotworowych odgrywają ważną rolę interferony gamma i alfa, które aktywują komórki NK, K, makrofagi, LTc i działają antyproliferacyjnie

• powstaje TNF alfa i beta - białko indukujące martwicę guza (indukuje apoptozę, hamuje proliferację, pobudza odpowiedź immunologiczną przeciwnowotworową, pobudza komórki do wydzielania interleukin: 1, 6, 8, INF beta.

Do zwiększenia immunogenności nowotworów modyfikuje się komórki nowotworowe:

• podaje się odpowiednio spreparowane komórki nowotworowe (forma szczepionki)

• podawanie przeciwciał antyidiotypowych

• wprowadza się do komórek nowotworowych geny dla cytokin ( IL-2, 4, INF gamma, TNF)

• wprowadza się geny dla antygenów nowotworowych do wirusów, np. krowianki

• zakaża się guzy wirusami, które się namnażając niszczą go, odsłaniając nowe antygeny, wbudowują integryny guza do otoczek, wzbudzają powstawanie interferonu

• zastosowanie przeciwciał monoklonalnych (dla antygenu guza), połączone z czynnikami toksycznymi działają bezpośrednio toksycznie, np. połączone z toksynami roślinnymi (rycyną, abryną i inne) czy też toksynami bakteryjnymi

• połączone z lekami cytotoksycznymi, z radioizotopami itp.

Stosuje się też immunoterapię nieswoistą, np. podając cytokiny, które mają zdolność proliferacji i funkcji wielu typów komórek:

• TNF, INF gamma, IL-2 ( aktywacja makrofagów i komórek NK i K)

• Podawanie immunoliposomów wypełnionych chemioterapeutykami (trawienie komórek nowotworowych)

Przeszkody w zwalczaniu nowotworów:

• Szybki wzrost nowotworu pozwala wyprzedzić odpowiedź immunologiczną, która powstaje wolniej

• Nowotwór uwalnia czynniki immunosupresyjne

• Przeciwciała w surowicy mogą blokować dostęp komórkom cytotoksycznym

• Antygeny nowotworowe szybciej aktywują komórki Ts niż Tc

• Niedobory odpornościowe ( np. HIV) u starszych ludzi i noworodków

• Odpowiedź immunologiczna eliminuje komórki o największej ekspresji antygenowej lecz nie jest tak skuteczna przeciwko komórkom o mniejszej ekspresji.

Czy wirusy onkogenne mogą się przenosić ze zwierzą t na człowieka??

Problem: wirusy białaczek bydła

Wirusy białaczek kotów

Wirusy białaczek ptasich

Nie stwierdzono przypadków, które wykazywałyby na bezpośredni kontakt między wirusem onkogennym zwierząt a nowotworem człowieka, chociaż spożywany produkty, sporządzamy szczepionki na zwierzętach czy w hodowlach komórkowych.

Wszystkie dane wskazują na istnienie bariery wirusowej która opiera się na:

• Braku odpowiednich receptorów umożliwiających wniknięcie wirusa do komórki

• Niemożności utrzymania się wirusowego genomu po wniknięciu do komórki i odwrotnej transkrypcji - zakażenie poronne

• Niemożność utworzenia zakażonego winiona

• Surowice mogą mieć właściwości lityczne dla wirusów

ZMIENNOŚĆ

Istota: pojawienie się w populacji wirusa nowych cech, których nie było w generacji rodzicielskiej.

Główną przyczyna zmienności wirusów tak jak i innych organizmów są mutacje - dziedziczne zmiany układu genetycznego. Środowisko wywiera wpływ na częstość mutacji i zapewnia odpowiednie warunki do utrzymania się nowych form. Stanowi sito biologiczne, wskutek czego zachodzą zmiany jakości populacji.

Selekcja: wybiórcze, szybsze namnażanie się wariantów już istniejących w populacji wyjściowej, którym dane warunki odpowiadają lepiej niż innym.

Mutacje mogą być spontaniczne i indukowane (letalne). Podstawą mutacji są zmiany w genomie wirusa:

Tranzycja - puryna na inną purynę

Transwersja - puryna na pirymidynę

Delecja - wypadnięcie

Addycja - dodanie

Translokacja - zmiana położenia danego genu lub jego fragmentu

Mutacje na ogół powodują małe zmiany, ale zachodzą one ciągle. Drugą przyczyną zmienności jest wzajemne oddziaływanie wirusów na siebie. Ma to miejsce kiedy w komórce namnażają się jednocześnie dwa wirusy. Wskutek tego występują zmiany w potomnej …. Wirusów. Mogą to być trwałe zmiany genetyczne dziedziczone bądź też zmiany nie trwałe.

Dziedziczna postać zmienności uwarunkowaną wzajemnym oddziaływaniem genetycznie różniących się od siebie cząsteczek wirusowych nazywa się rekombinacją (cząstki wirusowe różnią się ale są ze sobą spokrewnione). Rekombinacji towarzysz przerwanie ciągłości nici kwasu nukleinowego i wymiana jago fragmentów.

Formy potomne - rekmobinanty uzyskują cechy obu form rodzicielskich. Cech są trwałe.

U wirusów mających segmentowane genomy zachodzi tzw. Reesortacja genów, np. u wirusa grypy 8 segmentowy genom 254 kombinacji. W tym wypadku również wirusy potomne mają trwałe zmiany.

Zmiany powstałe w wyniku rekombinacji czy rearanżacji genów są bardzo duże i powstają nagle. Zmiany w genomie wirusa powstałe czy to w skutek mutacji czy rekombinacji pociągają za sobą zmiany:

• Antygenowe - mutacje mówmy o ucieczce w odmianę „antygenową”

• Rekombinację - duże zmiany „przesunięcie antygenowe”

Następstwem pojawienia się nowych mutantów są epidemie, zaś rekombinantów pandemie - zachorowania na dużych obszarach, kontynentach, ponieważ populacja jest wrażliwa na nową odmianę wirusa. Brak skutecznych przeciwciał dla nowego wariantu. Zmienność wirusów decyduje też o zmianie ich zjadliwości w trakcie trwania epidemii. Szczep zjadliwy zabija organizm i ginie. Pozostają szczepy mniej zjadliwe, które powodują dłużej trwającą chorobę. Ustala się równowaga między wirusem a gospodarze, również wzrasta populacja bardziej opornych zwierząt.

Zmianą wrażliwości kieruje człowiek poprzez atenuację - pasaże - wirus wścieklizny zjadliwy dla psa i ludzi poprzez pasaże na królikach stał się zjadliwy dla królików a nie dla psów. Dzisiaj atenuacja na drodze inżynierii genetycznej (usuwa się gen odpowiedzialny za zjadliwość).

Oprócz rekombinacji przy równoczesnym namnażaniu się dwóch różnych wirusów spokrewnionych mogą zachodzić zjawiska:

• Heterozygozy

• Fenotypowego zmieszania

Po których nie powstają trwale zmienione warianty wirusów. Po pasażach pojawiają się obie formy rodzicielskie.

Wykład 10

Wirusy stawonogów

Są czynnikiem etiologicznym wielu chorób owadów, roztoczy, roślin, czy kręgowców.

Dwie grupy:

I namnażają się tylko w tkankach stawonogów

II przenoszona przez wektory owadzie powoduje choroby roślin i zwierząt

I grupa Bakulowirusy

Rodzina: Baculoviridae

- Opisano 500 gatunków tych wirusów. Namnażają się w larwach owadów głównie motyli i muchówek. Podział opiera się na zdolności (Eubaculovirinae) i braku zdolności wytwarzania charakterystycznych ciał wtrętowych w zakażonych komórkach (Nudibaculovirinae).

- Materiał genetyczny tych wirusów stanowi dwuniciowy, kolisty DNA.

- Genom koduje 12-30 polipeptydów strukturalnych.

- Wiriony przedstawicieli Eubaculovirinae składają się z jednego lub wielu pałeczkowatych nukleokapsydów zamkniętych w pojedynczej otoczce.

Nudibaculovirinae

Wiriony występują w 2 postaciach:

1. Pierwsza postać wirionu zawiera w swej budowie długi i wąski ogonopodobny występ przyczepiony do jednego końca nukleokapsydu.

2. Drugi typ wirionu nieokluzyjnego jest podobny do formy okluzyjnej lecz prawie dwukrotnie większy.

Eubaculovirinae

NPV (nuclear polyhedrosis virus) GV (granulosis virus)

Wirus poliedrozy jądrowej Wirus granulozy

MNPV (multiple nucleocapsid viruses) SNPV (single nucleocapsid viruses)

Wirusy zawierające wiele Wirusy zawierające pojedynczy

nukleokapsydów w otoczce nukleokapsyd w otoczce

Wirusy poliedrozy jądrowej i wirusy nieokluzyjne replikują się wyłącznie w jądrze zakażonych komórek, zaś wirusy granulozy mogą również (oprócz jądra) replikować się w cytoplazmie.

W toku infekcji wirusem wytwarzającym ciałka wtrętowe powstają dwie funkcjonalne i morfologiczne formy wirionów. We wczesnym stadium pojedyncze nukleokapsydy pączkują przez błonę cytoplazmatyczną (BV-buddet virus, forma pączkująca) później (20-70 godzin) pojawiają się formy okluzyjne (OV-occluded virus) zamknięte w otoczce polihedrynowej.

Infekcja komórek zarówno in vivo jak i in vitro, odbywa się za pośrednictwem formy BV, która wnika na zasadzie endocytozy bądź fuzji z błona komórkową przenoszą się one drogą poziomą (z komórki do komórki) - rozprzestrzenianie zakażenia wewnątrz organizmu.

Otoczka polihedrynowa chroni wirusy przed niekorzystnym oddziaływaniem środowiska poza organizmem owada , a także przed działaniem enzymów proteolitycznych w pierwszym etapie zakażenia.

Formy inkluzyjne zakażają organizm owada per os lub poza jelitowo do jamy ciała w warunkach laboratoryjnych.

Bakulowirusy można namnażać przez infekcję wrażliwych owadów oraz hodowli komórkowych uzyskanych z tkanek owadzich.

Procedura namnażania w owadach.

Jaja złożone przez samicę dezynfekuje się np. 70% etanolem, umieszcza się je na sterylnej pożywce i inkubuje do czasu wylęgnięcia gąsienic. (Pożywka zawiera kiełki pszeniczne, kazeinę, glukozę, witaminy i sole mineralne - zestalone agarem). Gąsienice zakaża się (w sterylnych warunkach) drogą zależną od rodzaju wirusa:

• do ustnie - replikujące się w jelicie

• injekcja w odcinku odwłokowym

Po wystąpieniu objawów (czytaj: śmierci owada) izoluje się wirusy lub ciałka wtrętowe.

I Homogenizuje się całe owady lub wybrane narządy

II Filtruje się przez gazę

III Wirowanie różnicowe, dalej w gradiencie sacharozy.

Po oczyszczeniu poliedrów można je ropzpuścić w zasadach, a wirusy uwolnić przez sedymentację.

Hodowanie w hodowlach komórek owadzich.

Hodowle komórek owadzich otrzymuje się z narządów gąsienic, poczwarek i form dojrzałych: jajników, jelit, ciał tłuszczowych hemolimfy.

Są opracowane specjalne podłoża do uzyskiwania linii komórkowych. Są to podłoża syntetyczne wzbogacone w hemolimfę owadów, lizat laktoalbuminy, płodową surowicę bydlęcą.

Optymalna temperatura hodowli waha się w granicach 25-30^OC, pH 6,25-7,25.

Opisano ponad 200 linii komórkowych otrzymanych z 75 gatunków stawonogów.

Hodowle komórek owadzich stosuje się obecnie do ekspresji obcych białek przy zastosowaniu bakulowirusów jako wektorów (szczepionki przeciwwirusowe, cytokiny). Bakulowirusy są też stosowane do zwalczania owadów-szkodników roślin.

Choroby owadów.

Wirusy poliedrozy jądrowej atakują larwy i poczwarki motyli, owadów dwuskrzydłych i błonkoskrzydłych.

Wirusy poliedrozy cytoplazmatycznej są patogenami wielu gatunków motyli i owadów dwuskrzydłych.

Wirusy granulozy-choroby motyli.

Wirusy nie wytwarzające wtrętów komórkowych- motyle, owady i chrząszcze.

Np.: choroby gąsienic jedwabnika morwowego: poliedroza jądrowa robaczek ma biegunkę.

W pierwszym etapie przygotowania wektora z genomu wirusa usuwa się gen kodujący białko polihedryny- co nie wpływa na właściwości zakaźne wirusa. Obce geny wprowadza się do genomu wirusowego stosując wektory plazmidowe, które wykorzystują promotor genu polihedryny do ranskrypcji obcego genu.

Komórki owadzie hodowane in vitro poddaje się w dalszym etapie transfekcji mieszaniną DNA wirusowego i DNA plazmidowego. W rezultacie takiej kombinacji uzyskuje się wirusy, które nie wytwarzają ciał wtrętowych, a namnażając się w komórkach owadzich dają produkty, które są pod względem immunologicznym i funkcjonalnym podobne do ich naturalnych odpowiedników.

Od ponad 20 lat bakulowirusy wykorzystuje się jako insektycydy do zwalczania owadów- szkodników roślin. Do tego celu nadają się ciała wtrętowe, które chronią wrażliwe wiriony przed niekorzystnum działaniem środowiska. Zamknięte w poliedrach wiriony zachowują aktywność przez lata. Ważnym elementem tej metody jest wysoka specyficzność bakulowirusa w stosunku do gospodarza-szkodnika oraz nieszkodliwość dla człowieka, zwierząt domowych i leśnych. Dzieki temu nie narusza się naturalnej równowagi w biocenozie jak to ma miejsce w przypadku stosowania środków chemicznych.

Biologiczne zwalczanie szkodników polega na rozsiewaniu z powietrza nad zagrożonymi uprawami roślin preparatów zawierających okludowane wirusy.

Problemem jest otrzymanie takiej dużej liczby ciał wtrętowych- konieczna jest masowa hodowla gąsienic bądź też hodowla komórek owadzich metodą biotechnologiczną z zastosowaniem bioreaktorów o dużej pojemności.

PRIONY

PrP^SC=białkowa zakaźna cząstka

Składają się z normalnych białek PrP występujących w komórce nerwowej, ale maja zmienioną konfigurację przestrzenną.

Białko PrP ma charakterystyczne cząsteczki 3αhelisy w strukturze trzeciorzędowej, natomiast w strukturze trzeciorzędowej białek prionowych PrP^SC dominują obszary β-fałdowe.

Budowa cząsteczki prionu

• 254 reszty AA, zawiera mostek dwusiarczkowy, 2 reszty oligocukru, resztę glukozylofosfatydyloinozytolu.

• Nie zawierają DNA, ani RNA

• Geny odpowiedzialne za syntezę białek prionowych występują u wszystkich ssaków, ptaków, niektórych owadów, a także w komórkach drożdży.

Właściwości białek prionowych (oporność wynika z konformacji)

• Oporne na działanie proteaz (powstaje 141 AA fragment oporny na dalszą proteolizę)

• Oporne na wiele czynników fizycznych i chemicznych, między innymi na temperaturę. Giną dopiero w 360^OC po godzinie lub po godzinie w temp. -131 ^OC

• Oporne na działanie światła UV i promieniowania jonizującego w dawkach i czasie 100x większym niż działających inaktywująco na kwasy nukleinowe.

• Oporne na działanie wszystkich czynników chemicznych inaktywujących kwasy nukleinowe (RNazy, DNazy, itp.)

• Oporne na niektóre czynniki uszkadzające białka (mocznik, siarczan dodecylu sodu(SDS), fenol i inne)

• Inaktywacja 4% roztworem Wodorotlenku sodu po 1h

• Brak właściwości immunogennych

• Brak reakcji zapalnej

• Brak zmian histopatologicznych innych tkankach, tylko w CUN

Skąd się biorą priony?

- mutacja w genie odpowiedzialnym za białko PrPc, w późniejszym etapie białko PrP^SC oddziaływuje na białko PrPc (heterodimery)-które ulega przekształceniu z formy normalnej na PrP^SC

- przez zakażenie prionem od chorych ludzi- przez tkanki przeszczepiane, z krwią, preparaty hormonalne, narzędzia chirurgiczne itp.

-przez zakażenie prionem BSE od chorych zwierząt po spożyciu zakażonych produktów

Uszkodzenie mózgu jest rezultatem gromadzenia się w komórkach nerwowych

patologicznego białka

Choroby prionowe ludzi

Kuru- występowała w Nowej Gwinei w latach 50 XXw. u ludzi zjadających w trakcie rytualnych kanibalistycznych uczt mózg i inne części ciała zabitych ludzi.

Po zakazie takich praktyk liczba przypadków tej choroby zmalała w istotnym stopniu.

Choroba Creutzfelda-Jakoba (CJD)- stopniowa demencja umysłowa, zaburzenia motoryczne, 1 przypadek na 10⁶ ludzi. Średnia wieku osób chorych to 57 lat, minimalny wiek 27 lat (przyczyną najczęściej jest mutacja lub po ransplantacji lub podawaniu hormonu wzrostu). Znane są również przypadki tzw. rodzinnej, dziedzicznej choroby CJD-np. wsród Żydów pochodzących z Libii-mutacje w kodonie 200 zmieniające Glu na Leu. W paru rodzinach na Słowacji i w Chille. Wszyscy, którzy takie mutacje posiadają-zachorują.

Choroba Gerstmana-Strausslera-Scheinkera- rzadszy typ choroby, który może być przekazany do małp i do naczelnych. Mutacje w kodonie 102: Pro-Leu.

Nieuleczalna rodzinna bezsenność- mutacja w kodonie 178, u dorosłych powyżej 50 rż., przeciągające się zaburzenia snuśmierć w ciągu roku od wystąpienia objawów.

Zwierzęce choroby prionowe

• Scrapie u owiec- (trzęsawka) najstarsza forma już w XVIIw.

• Zakaźna encefalopatia u norek

• Gąbczasta encefalopatia kotów

• Gąbczasta encefalopatia dzikich przeżuwaczy (jelenie, łosie)

• Gąbczasta encefalopatia bydła (choroba szalonych krów)

U ludzi odmiana Choroby Creutzfelda-Jakoba- czynnik vCJD różni się od pozostałych form CJD i wykazuje bardzo duże podobieństwo z białkiem prionowym BSE.

Różnice między zakażeniem vCJD a CJD:

• zapadają młodzi ludzie (30-40lat), a nawet występuje u dzieci

• dłuższy czas rwania 10-24 ms

• przewaga ataksji nad otępieniem

Możliwość zakażenia prionami BSE u ludzi

Najbardziej skuteczna metoda: bezpośrednio domózgowe wprowadzenie czynnika zakaźnego (nie wystepuje w naturze)

Naturalnie: Droga przez przewód pokarmowy- być może kumulacja i replikacja białek prionowych może odbywać się w tkance limfoidalnej migdałków, kępki Pyera, w węzłach chłonnych krezkowych i śledzionie.

Panuje pogląd, że :

- powielanie patologicznego białka prionowego dokonuje się w komórkach układu retikulo- limfatycznego i te komórki odgrywają rolę w transporcie białka infekcyjnego do CUN.

- Bądź wędrówka prionów odbywa się wzdłuż nerwów obwodowych

• Bądź po pokonaniu bariery jelitowej wędrują naczyniami limfatycznymi do śledziony, skąd przez synapsy nerwów śledzionowych przedostają się do ich osłonek i tą drogą docierają do CUN.

Wrażliwość wirusów na działanie czynników fizycznych i chemicznych.

Poszczególne wirusy a nawet szczepy tego samego wirusa wykazują znaczne różnice na działanie czynników fizycznych i chemicznych.

• Działanie temp. 56^OC niszczy zakaźność większości wirusów, chociaż są wyjątki np. wirus żołtaczki zakaźnej w temp. 100^OC dopiero po 20 min. Są też wirusy, które ulegają inaktywacji już w temp. pokojowej.

• Wirusy są bardzo wrażliwe na wysychanie

• Wykazują dużą wrażliwość na działanie światła słonecznego i promieni UV (260nm)

• Promieniowanie jonizujące uszkadza wirusy (działanie bezpośrednie i pośrednie)

• Działanie ultradźwięków powoduje destrukcję wirusa w preparatach oczyszczonych, znajdujący się w tkankach nie ulega uszkodzeniu

• Wirusy wykazują bardzo różną wrażliwość na zmiany pH, niektóre nie ulegają inaktywacji w zakresie 2-12, inne jak np. wirus grypy ulega uszkodzeniu przy nieznacznym odchyleniu

• Większość wirusów jest odporna na działanie glicerolu- płyn do przechowywania materiałów wirusowych zakaźnych

• Działanie przeciwwirusowe środków powodujących koagulację białka jest słabe jeśli wirus znajduje się w tkankach (np. alkohol)

• Silne działanie przeciwwirusowe wykazują silne zasady, nadmanganian potasu oraz preparaty chlorowe

• Rozpuszczalniki tłuszczowe (organiczne) oraz związki powierzchniowo czynne inaktywują wirusy zawierające tłuszcze (wirusy otoczkowe). Dobrym środkiem wirusobójczym jest formalina, która w niskich stężeniach powoduje inaktywację wirusa- zastosowanie do produkcji szczepionek

• Wirusy wykazują zupełną niewrażliwość na niskie temperatury, co wykorzystywane jest do przechowywania preparatów przez długie okresy. Zastosowanie pojemnika z suchym lodem (-70OC), z płynnym azotem (-170OC), zamrażarki (-80OC). Niektóre wirusy ulegają inaktywacji przy zamrażaniu i rozmrażaniu kilkakrotnym.

• Liofilizacja (wysuszenie w próżni ze stanu zamrożenia) jest dobrym sposobem przechowywania większości wirusów.

• Wirusy nie są wrażliwe na chemioterapeutyki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe

---