Konspekt wykładu 14

Inżynieria genetyczna (rekombinacyjna technologia DNA)

Tok postępowania mający na celu uzyskanie bakterii ze sklonowanym obcym genem:

1) Otrzymanie DNA, który chcemy sklonować;

2) Wybór i izolowanie DNA odpowiedniego wektora do klonowania (np. plazmidowy DNA;

3) Wybór odpowiedniej endonukleazy restrykcyjnej i trawienie obu DNA;

4) Połączenie cząsteczek DNA klonowanego i wektora z udziałem ligazy - uzyskanie zrekombinowanego plazmidu, zawierającego DNA dawcy;

5) Wprowadzenie zrekombinowanego plazmidu drogą transformacji do komórek bakteryjnych;

6) Wyselekcjonowanie spośród kolonii transformantów takiej, która zawiera zrekombinowany plazmid niosący właściwą wstawkę;

7) Namnożenie wyselekcjonowanego klonu bakterii w dużej ilości i uzyskanie produktu kodowanego przez sklonowany gen.

Otrzymywanie donorowego DNA

DNA, który chcemy sklonować, może być:

1. wyizolowany z komórek wybranego organizmu;

2. zsyntetyzowany in vitro z nukleotydów;

3. produktem PCR;

4. cDNA (complementary DNA), otrzymanym z zastosowaniem mRNA i odwrotnej transkryptazy (jeśli chcemy uzyskać ekspresję kodowanych białek w E. coli).

Wybór wektora zależy od pochodzenia klonowanego DNA i celu, jaki sobie stawia eksperymentator. Mogą to być:

1. plazmidy (zarówno bakteryjne jak i drożdżowe);

2. zmodyfikowane wirusy, zarówno bakteryjne (np. zmodyfikowany fag  czy M13), jak i wirusy eukariotyczne (np. SV40, bakulowirusy, retrowirusy);

3. sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC, bacterial artificial chromosome);

4. sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC, yeast artificial chromosome) - do klonowania bardzo dużych fragmentów eukariotycznego DNA.

Niezbędne cechy wektora:

1) zdolność do autonomicznej replikacji w danym gospodarzu;

2) obecność unikatowego miejsca do klonowania;

3) możliwość selekcji klonów zawierających wektor - obecność genu selekcyjnego:

a) nadającego komórce oporność na jakiś toksyczny związek (np. antybiotyk);

b) umożliwia syntezę jakiegoś związku, bez którego komórka nie może rosnąć (np. YAC zawiera geny komplementujące mutacje auksotroficzne w Saccharomyces cerevisiae).

Ponadto wektor powinien być:

1. niewielki, aby łatwo było go izolować i wprowadzać do różnych bakterii;

2. mieć względnie dużą liczbę kopii, aby można go było łatwo izolować w wystarczającej ilości.

Systemy restrykcji i modyfikacji

1) występują u większości prokariotów;

2) składają się z 2 elementów:

1. endonukleaz restrykcyjnych, niszczących obcy DNA, przedostający się do komórek;

2. metylaz, chroniących genom gospodarza przed działaniem własnych enzymów restrykcyjnych poprzez jego modyfikację (metylację);

3) nazwy endonukleaz pochodzą od trzyliterowego skrótu nazwy mikroorganizmu, który je wytwarza, np. Eco, Hin (dalsze symbole oznaczają szczep i numer enzymu, np. EcoRI, HindIII, SmaI).

Sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy

1) liczą 4-8 par zasad;

2) mają charakter palindromowy, a miejsca cięcia są usytuowane symetrycznie;

3) przecięcie DNA może prowadzić do powstania

1. lepkich końców, jeśli cięcie w obu niciach powstaje z przesunięciem;

2. tępych końców, jeśli cięcie w obu niciach powstaje dokładnie naprzeciw siebie.

Połączenie DNA wektora z DNA klonowanym

1. zmieszanie w odpowiednich proporcjach DNA wektora i DNA klonowanego, przeciętych odpowiednią endonukleazą restrykcyjną;

2) dodanie ligazy DNA (np. ligazę faga T4), która tworzy wiązania diestrowe i łączy na trwałe oba rodzaje DNA.

2. otrzymanie wektora zawierającego wstawkę obcego DNA.

Wprowadzenie zrekombinowanego wektora do komórek biorcy

1) Zrekombinowane plazmidy wprowadza się metodą transformacji lub elektroporacji do komórek biorcy, którym najczęściej są różne, specjalnie wyselekcjonowane, szczepy E. coli:

a) nie mające funkcjonalnych systemów restrykcji-modyfikacji;

b) dobrze się transformujące metodą chemiczną.

2) selekcjonuje się klony, które uzyskały plazmid, wykorzystując cechy kodowane przez plazmid. Nie wiemy, które klony niosą plazmid zrekombinowany.

Na szczęście istnieją wektory, które pozwalają na wyselekcjonowanie plazmidów zrekombinowanych. Jednym z pierwszych był skonstruowany w 1976 roku plazmid pBR322.

Plazmid pBR322

1. ma system replikacyjny z plazmidu pMB1 oraz gen oporności na ampicylinę i tetracyklinę;

2. jest mały (4,36 kb) i w komórce występuje w 16 kopiach;

3. w obrębie genu warunkującego oporność na tetracyklinę znajdują się 3 miejsca restrykcyjne, a w obrębie genu -laktamazy (oporność na ampicylinę) - jedno;

4. jeśli klonowany fragment DNA zostanie wprowadzony do sekwencji kodującej któregoś z tych genów oporności, to gen ulegnie insercyjnej inaktywacji i bakteria niosąca taki plazmid będzie wrażliwa na ten antybiotyk.

Ryc. Klonowanie w pBR322. Na przykład po trawieniu pBR322 i DNA donorowego enzymem PstI, a następnie po ligacji i transformacji, wysiewa się komórki na podłoże zawierające tetracyklinę. Uzyskane transformanty Tc^r mogą nieść albo odtworzony plazmid pBR322 (i wtedy będą Tc^rAp^r) albo plazmid zrekombinowany i wtedy są Tc^rAp^s. Do badania transformantów Tc^r stosuje się tzw. metodę replik (wysiewa się klony Tc^r równolegle na 2dwa rodzaje podłoży: 1) z ampicyliną i 2) z tetracykliną , poszukując klonów Tc^rAp^s.

Wektory nowszej generacji

Mają wiele różnych udogodnień, w tym możliwość bezpośredniego rozróżniania na szalce kolonii niosących wektor zrekombinowany. Kolonie niosące wektor bez wstawki mają kolor niebieski, zaś kolonie zawierające wektor zrekombinowany są białe (selekcja „białe-niebieskie”).

Wykorzystuje się insercyjną inaktywację genu lacZ, który koduje -galaktozydazę, hydrolizującą wiązanie glikozydowe w cząsteczce laktozy. Jeżeli zaindukujemy ekspresję genu lacZ, dodając do podłoża IPTG (izopropylo--D-tiogalaktopiranozyd), a jako substrat zastosujemy syntetyczny, bezbarwny substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo--D-tiogalaktopiranozyd), to powstanie galaktoza i niebieski barwnik, który wybarwi kolonie na niebiesko. Jeżeli miejsce klonowania znajduje się w obrębie genu lacZ, to wstawienie kawałka DNA prowadzi do insercyjnej inaktywacji genu. Taki plazmid nie będzie wytwarzał enzymu zdolnego do rozłożenia X-gal, więc niosące go komórki będą białe. Komórki niosące odtworzony plazmid bez wstawki będą niebieskie.

pBluescript

1) ma gen selekcyjny (gen oporności na ampicylinę);

2) ma możliwość selekcji „białe-niebieskie” (ma skróconą wersję genu lacZ, a mianowicie    lacZ', kodującą promotor i N-końcowy -peptyd -galaktozydazy, dzięki czemu gen    zajmuje mało miejsca na plazmidzie. C-końcowa część -galaktozydazy kodowana jest    przez chromosom gospodarza i może ulec komplementacji -peptydem, dzięki czemu    powstaje aktywny enzym);

3) ma MCS (ang. multiple-cloning site, miejsce wielokrotnego klonowania), sztucznie    zsyntetyzowany odcinek, zawierający 21 unikatowych miejsc restrykcyjnych,    umiejscowiony w genie lacZ';

4) jest wyposażony w promotory fagów T3 i T7, co ułatwia analizę mRNA i białek,    kodowanych przez sklonowany DNA;

5) można uzyskać jednoniciową formę plazmidu (potrzebną do sekwencjonowania);

6) jest niewielki, więc łatwo go izolować i wprowadzać do różnych bakterii;

7) ma dużą liczbę kopii, dzięki czemu łatwo go otrzymać w wystarczającej ilości.

Odnalezienie właściwego plazmidu zrekombinowanego

Nawet jeśli odnaleźliśmy kolonie transformantów zawierające jakąś wstawkę DNA, wcale nie mamy pewności, czy jest to właściwa wstawka. Istnieją różne możliwości sprawdzenia:

1. jeżeli interesujący nas gen ulega ekspresji w komórkach gospodarza, tworząc funkcjonalny produkt, można go odnaleźć w wyniku komplementacji, wykorzystując gospodarza niezdolnego do syntezy danego białka;

2. można zastosować swoiste przeciwciała (jeśli jesteśmy w stanie je uzyskać);

3. można zastosować hybrydyzację z sondą molekularną\ (jeżeli znamy sekwencje genu).

Rodzaje wektorów

1. Wektory ekspresyjne (ang. expression vector) to wektory, które zawierają silny promotor, umożliwiający wydajną transkrypcję genu wstawionego do wektora; stosuje się je, gdy celem klonowania jest otrzymanie dużej ilości produktu danego genu. można wykorzystać do wytwarzania obcych białek w bakteriach.

2. Wektory wahadłowe (czułenkowe; ang. shuttle vectors) to wektory, które mają dwa różne systemy replikacyjne i mogą replikować się w 2 różnych gospodarzach. Zwykle jednym z gospodarzy jest E. coli, więc wszelkie manipulacje genetyczne i izolowanie plazmidu można zrobić w E. coli, a potem przenieść go do właściwego gospodarza i tam badać.

3. Wektory o szerokim zakresie gospodarza (ang. broad host range vectors) mogą replikować się w wielu różnych typach bakterii.

PRAKTYCZNE WYKORZYSTANIE INŻYNIERII GENETYCZNEJ

Gospodarzem sklonowanych genów jest bardzo często E. coli, chociaż nie zawsze musi ona być w znaczący sposób łatwiejsza do hodowania niż bakteria, z której gen pochodzi. Natomiast klonowanie w E. coli:

1. umożliwia łatwe manipulowanie poziomem ekspresji;

2. umożliwia stosowanie takich samych urządzeń i takich samych warunków hodowli do wytwarzania różnych produktów, co czyni produkcję tańszą.

Klonowanie genów eukariotycznych

Zanim nie opracowano metody klonowania genów i wytwarzania białek metodą rekombinacji DNA, trzeba było uzyskiwać różne białka o znaczeniu leczniczym, np. insulinę, somatotropinę, interferony, czynnik VIII krzepnięcia krwi (hemofilia) z tkanek zwierzęcych lub pobierać od ludzkich dawców. Wiązało się to z różnymi niedogodnościami:

1. było bardzo kosztowne i nie zaspokajało popytu;

2. występowały różnice funkcjonalne między białkami człowieka i zwierzęcia;

3. niektórzy ludzie są uczuleni na białka zwierzęce, którymi preparaty były zanieczyszczone;

4. istniała możliwość zakażenia preparatów wirusami.

Insulina

1. hormon produkowany w trzustce,

2. małe białko złożone z 2 polipeptydów: A o długości 21 aminokwasów i B o długości 30 aminokwasów, połączonych mostkami dwusiarczkowymi.

Uzyskiwanie insuliny wytworzonej dzięki inżynierii genetycznej

1) synteza chemiczna 2 oddzielnych genów, kodujących polipeptyd A i polipeptyd B

2) uzyskanie 2 zrekombinowanych wektorów, które zawierają:

1. jeden z genów insuliny;

2. połączony z genem β-galaktozydazy;

3. oba geny są rozdzielone trypletem metioninowym.

3) przeniesienie każdego ze zrekombinowanych plazmidów do E. coli;

4) wytworzenie białka fuzyjnego A i białka fuzyjnego B;

5) rozcięcie każdego z białek fuzyjnych bromocyjanem, który działa w miejscu występowania metioniny;

6) połączenie odciętych łańcuchów A i B w wyniku manipulacji chemicznych.

Somatotropina

Niedobór tego hormonu wzrostu prowadzi do karłowatości. Uprzednio był izolowany z przysadek ze zwłok ludzkich. Hormony zwierzęce nieskuteczne. Obecnie otrzymywane z E. coli.

Szczepionki

Nagminne zapalenie wątroby typu B - wirus HBV (hepatitis B-type virus); zakażenie w sposób podobny do HIV. U pewnej liczby osób infekcja prowadzi do raka wątroby. HBV nie można hodować w laboratorium, można go otrzymywać jedynie z krwi ludzi lub innych naczelnych zakażonych tym wirusem. We krwi osób z chroniczną infekcją HBV występuje białko HbsAg, które po wstrzyknięciu stymuluje odporność przeciwko HBV.

Dzięki inżynierii genetycznej w 1982 r. sklonowano gen HbsAg w drożdżach, a już w roku 1986 zaczęto produkować pierwszą szczepionkę wytworzona z zastosowaniem inżynierii genetycznej.

Trwają badania nad szczepionką przeciw AIDS. Białko gp160 wirusa jest cięte i powstają z niego 2 białka powierzchniowe wirusa. W bakulowirusie (atakuje owady) klonuje się gen kodujący gp160 i rekombinowanym bakulowirusem infekuje się hodowle tkanek owadzich. Uzyskiwane białka są wykorzystywane do produkcji szczepionek.

Problemy związane z klonowaniem genów eukariotycznych w komórce prokariotycznej

1. sklonowany DNA może nie ulegać ekspresji, a więc że nie będzie powstawał produkt sklonowanego genu;

2. nie wszystkie białka przyjmują w komórkach prokariotycznych właściwą konformację, więc mogą się wytrącać, tworząc ciała inkluzyjne; białka wymagają potem renaturacji, co nie jest łatwe w przypadku dużych białek;

3. E. coli rozpoznaje niektóre białka jako obce i niszczy je za pomocą proteaz;

4. E. coli nie potrafi modyfikować białek, a niektóre komórki eukariotyczne modyfikują swoje białka (np. glikozylacja).

Jeśli krytycznym etapem jest potranslacyjna modyfikacja, to gen można poddać ekspresji w komórkach eukariotycznych. Dzięki hodowlom tkankowym można uniknąć wymienionych kłopotów, ale one też mają swoje wady: 1) rosną wolniej; 2) wymagają droższych pożywek.

Wykorzystuje się:

1. tkanki owadów, np. do wytworzenia szczepionki przeciw AIDS;

2. drożdże;

3. komórki ssaków, np. komórki jajnika chomika są wykorzystywane do produkcji aktywatora plazminogenu, niezbędnego do leczenia zawałów serca.

Przykłady produktów inżynierii genetycznej uzyskiwanych z wykorzystaniem E. coli

Produkt	Pochodzenie genu	Wykorzystanie produktu
Enzymy restrykcyjne	bakterie, archeony	badania naukowe; sądownictwo
Polimeraza DNA      Taq      Pfu	Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus	badania naukowe; sądownictwo
rennina	Alcaligenes, grzyby	produkcja serów
poli-β-hydroksymaślan	Ralstonia metallidurans*	biodegradowalne tworzywa termoplastyczne
insulina	człowiek	leczenie cukrzycy
hormon wzrostu	człowiek	leczenie karłowatości

*pierwotnie Alcaligenes eutrophus, potem Ralstonia eutropha.

Przykłady produktów inżynierii genetycznej uzyskiwanych z wykorzystaniem gospodarzy innych niż E. coli

Produkt	Pochodzenie genu	Gospodarz genu	Wykorzystanie produktu
białko HbsAg (antygen powierzchniowy wirusa HBV)	wirus nagminnego zapalenia wątroby typu B	drożdże	szczepionka przeciw nagminnemu zapaleniu wątroby typu B
białko gp160 (antygen powierzchniowy wirusa HIV)	wirus HIV	tkanki owadów	szczepionka przeciw AIDS (w przygotowaniu)
czynnik VIII	człowiek	komórki jajnika chomika	leczenie hemofilii
aktywator plazminogenu	człowiek	komórki jajnika chomika	leczenie zawałów serca (rozpuszczanie skrzepów)

1

9

---