Sprawozdanie

z

izolacji białek

Pod względem właściwości elektrostatycznych białka są bardziej złożone niż kwasy nukleinowe, jako że wypadkowy ładunek białka może być dodatni, ujemny lub wynosić zero, natomiast kwasy nukleinowe mają zawsze ładunek ujemny.

Elektroforezę białek można prowadzić w trzech odmianach:

-elektroforezy natywnej

- elektroforezy denaturującej(w obecności detergentu- SDS)

-ogniskowania izoelektrycznego

I. Elektroforeza SDS-PAGE i jej zastosowanie

Jest to metoda powszechnie stosowana w biologii molekularnej do rozdziału białek. Pozwala na określenie masy cząsteczkowej białek(z dokładnością do 5-10%) ich budowy podjednostkowej oraz wielkości i typu poszczególnych podjednostek. Metoda ta cechuje się wysoka rozdzielczościa, ponieważ umożliwia rozdział białek różniących się masą cząsteczkowa zaledwie o 2%(np. 40 i 41 kDa, co odpowiada różnicy o ok. 10 aminokwasów)

Zasada działania

• SDS jest detergentem jonowym( anionowym) który zrywa wiązania niekowalencyjne w białkach prowadząc do ich rozfałdowania

• Aniony SDS łączą się z łańcuchami głównymi białek maskując ich wewnętrzny ładunek i nadając powstałemu kompleksowi (SDS/denaturowane białko) duży wypadkowy ładunek ujemny

• SDS łączy się z białkiem w stałym stosunku masowym (1 anion SDS na 2 reszty aminokwasowe) co zmienia gęstość ładunku rozdzielanych białek(wartość ładunku powstałego kompleksu jest wprost proporcjonalna do masy cząsteczkowej białka)

Cechy kompleksu SDS/białko

• Jednakowy kształt- wszystkie białka po działaniu SDS ulegają rozfałdowaniu, z tego względu ruchliwość elektroforetyczna nie zależy od konformacji rozdzielonych białek

• Taki sam ładunek - ujemny, dzięki czemu wszystkie białka przemieszczają się w kierunku elektrody dodatniej

• Taka sama gęstość ładunku- nie wpływa ona na ruchliwość elektroforetyczna białek

• Jedyna różnica między kompleksami poszczególnych białek z SDS dotyczy ich wielkości, która jest wprost proporcjonalna do masy cząsteczkowej białka

Zastosowanie elektroforezy SDS-PAGE

Elektroforeza SDS posiada kilka cech które sprawiają, że jest obecnie najczęściej stosowana.

Min. wykorzystuje się ją do badania budowy podjednostek białek. Dzieje się tak dzięki takim związkom jak β-merkaptoetanol(β-Me) lub ditiotreitol(DTT), które powodują zerwanie wiązań disiarczkowych stabilizujących IV- rzędową strukturę białek i ich rozpad na podjednostki.

Jeżeli podjednostki te różnią się masą cząsteczkową to na elektroforo gramie widoczne są w postaci odrębnych prążków (zlokalizowanych niżej niż całe białko, nie poddane działaniu β- Me czy DDT)

Elektroforezę SDS- PAGE przeprowadza się pionowo w układzie dwóch żeli:

- Żel rozdzielający- na dole, procentowość zależy od wielkości rozdzielonych białek

- Żel zagęszczający- u góry, procentowość niższa niż żelu rozdzielającego (większe pory)

* W żelach tych nośnikiem służącym do rozdziału białek jest spolimeryzowana mieszanina akryloamidu i metylenobisakrylamidu. Polimeryzacja zachodzi pod wpływem katalizatorów (TEMED i nadsiarczan amonu) bez dostępu tlenu, który jest inhibitorem reakcji. Wielkość oczek żelu zależy od proporcji między substratami polimeryzacjiakryloamidem i metylenobisakrylamidem. Aby uzyskać optymalny rozdział należy zastosować żel o odpowiedniej wielkości porów dla białek o określonej masie cząsteczkowej.

Główne składniki żeli:

1. Substraty polimeryzacji(akryloamid, metylenobisakryloamid),

2. Związki zapewniające odpowiednie środowisko elektroforezy(Tris, SDS)

3. Nadsiarczan amonu

4. TRMED

*Błękit brylantowy wiążę się do białek zlokalizowanych w żelu, ale nie do samego żelu poliakryloamidowego, niebieska barwa pojawia się tylko tam gdzie znajdują się białka.

II. Stężenie białka w wyizolowanej próbie i nazwa gatunku, z którego przeprowadzano izolacją

Gatunek: kukurydza

Stężenie białka: 0,1 mg/ml

III. Sposób przygotowania próby białkowej do naniesienia na żel

Elektroforezę SDS- PAGE przeprowadzaliśmy używając prób z 20 µg (do Western Blottingu) i 50 µg białka. Dlatego należy obliczyć odpowiednie objętości:

dla 20 µg białka: 1000 µg- 1000 µl
20 µg - x
x= 20 µl

dla 50 µl białka: 1000 µg - 1000µl
50 µg - x
x= 50 µl

Dodatkowo w elektroforezie do określonej ilości/objętości białka należy doliczyć jeszcze objętość NaCl(dokładnie ¼ilości białka)

Czyli

dla 20 µg białka x= 20 µl 20:4= 5 µl NaCl

dla 50 µl białka x= 50 µl 50:4= 12,5 µl NaCl

IV. Obraz Western Blot

Ruchliwość elektroforetyczna jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z masy cząsteczkowej białka. Masę cząsteczkową białek można określić z ich względnej ruchliwości wyznaczonej równocześnie z ruchliwością białek standardowych:

R_m=

R_m -współczynnik ruchliwości względnej

a- odległość przebyta przez białko [mm]

b- odległość przebyta przez ładunek (czoło elektroforezy) [mm]

Masy cząsteczkowe dla białek wzorcowych:

1. Miozyna - 205kDa czyli log10 = 2,31

Rm= 0,173

2. B-galaktozydaza - 116kDa czyli log10 = 2,06

Rm= 0,213

3. Fosforylaza - 97,4 kDa czyli log10 = 1,99

Rm=0,253

4. Surowicza albumina wolowa 66kDa czyli log10 = 1,82

Rm= 0,306

5. Owoalbumina 45kDa czyli log10 = 1,65

Rm=0,4

6. Anhydraza węglanowa - 29kDa czyli log10 = 1,46

Rm= 0,493

* Współczynnik ruchliwości względnej dla białka wyizolowanego z kukurydzy Rm=0,24

V. Masa cząsteczkowa białka

Masę cząsteczkową białek można określić z ich względnej ruchliwości wyznaczanej równocześnie z ruchliwością białek standardowych( o znanej masie)

Masę cząsteczkową obliczamy z Rm( wartość którą uzyskaliśmy przekształcamy na wartość logarytmiczną)

Rm= 0,24 log10= 2

10²= 100 kDa

VI. Białko wykrywane przez nas na zajęciach laboratoryjnych z biologii molekularnej

Wykrywaliśmy: fitochrom

FITOCHROM- jest fotoreceptorem, barwnikiem używanym przez rośliny w reakcjach na światło lub jego brak. Maksimum absorpcji barwnika przypada na długości fal odpowiadające światłu czerwonemu i dalekiej czerwieni. Wiele roślin wykorzystuje fotochrom do określenia czasu odpowiedniego do kwitnięcie poprzez określenie dnia i nocy. Zmiany w zawartości poszczególnych form fotochromu pozwalają regulować reakcje związane z cyklem dobowym. Fotochrom reguluje również kiełkowanie nasion, wzrost wydłużeniowy siewek, wielkość i kształt liści, syntezę chlorofilu oraz prostowanie się hipokotyli lub epikotyli siewek roślin dwuliściennych. Cząsteczka fitochromu jest chromoproteiną, składa się z części białkowej połączonej z barwnikiem.

Podstawową formą fitochromu jest forma absorbująca światło w zakresie czerwieni. Maksimum absorpcji przypada na długości fal: 650-670 nm. Ta forma fitochromu dla ludzkiego oka posiada barwę turkusowo niebieską. Pochłaniając kwanty światła czerwonego forma PR przekształca się w formę PFR, która wykazuje maksimum absorpcji w tzw. dalekiej czerwieni (długości fal 705-740 nm). Ta forma fitochromu dla oka ludzkiego posiada kolor zielonkawy. Pochłanianie kwantów energii przez formę PFR powoduje jej przekształcenie do formy PR. Fotochrom pochłaniając odpowiedniej długości fale elektromagnetyczne przekształca się w jedną z form, a reakcja jest odwracana przez inną długość fali.

---