Sprawozdanie

Temat: Izolacja DNA z komórek eukariotycznych

Sekcja VIII:

Łukasz Mitusiński
Wojciech Różański

I. Wstęp teoretyczny

W celu izolacji DNA z komórek eukariotycznych należy usunąć z nich wszystkie pozostałe związki. Pierwszym etapem jest liza komórki, do czego używa się wysokich stężeń soli i detergentów. Następnie, w roztworze komórek z którego chcemy uzyskać DNA przeprowadzamy trawienie białek, przy użyciu enzymów proteolitycznych, w odpowiednim środowisku zatrzymującym aktywność nukleaz. Proteazy nie trawią białek do pojedynczych aminokwasów, dlatego musi być przeprowadzony kolejny etap, tak zwanego odbiałczania. Niestrawione białka i peptydy powstałe w wyniku działań enzymów proteolitycznych muszą zostać usunięte przy pomocy substancji denaturujących, doprowadzających do wytrącenia białek. W tym celu używa się organicznych rozpuszczalników, a następnie oddziela się część płynną od zawiesiny białek. Czynność powtarza się do uzyskaniu roztworu o małym zanieczyszczeniu niepożądanymi substancjami. W kolejnym etapie wytrącamy DNA z roztworu przy użyciu etanolu, który usuwa z DNA płaszcz wodny. Roztwór wytrąconego DNA należy odwirować i rozpuścić w roztworze buforze TE.

Bufor do ekstrakcji, roztwór 3M NaCl, 0,4M Tris:HCl pH 7.8, 20mM EDTA, 2%SDS.
-EDTA - kwas etylenodiaminotetraoctowy, posiada właściwości chelatujące - tworzy kompleksy z jonami metali, które są kofaktorami nukleaz, dzięki czemu zatrzymuje ich działanie.
-SDS – dodecylosiarczan sodu, detergent o charakterze jonowym, używany w celu niszczenia wiązań peptydowych w komórce.
-NaCl – chlorek sodu, wpływa na rozpad wiązań jonowych
-Tris*HCl - bufor zapewniający odpowiednie pH, wraz z NaCl i EDTA tworzy bufor odpowiedzialny za rozpad wiązań jonowych

Proteaza używana do trawienia białek, to proteinaza K. Enzym atakuje wiązania peptydowe sąsiadujące z grupą karboksylową. Służy do trawienia i usuwania zanieczyszczeń białkowych podczas izolacji kwasów nukleinowych. Deaktywuje też nukleazy, które mogłyby zdegradować DNA lub RNA podczas procesów ich oczyszczania. Posiada zdolność do działania w obecności związków chelatujących, takich jak SDS, który pomaga neutralizować nukleazy. Ponadto proteinaza K jest aktywna w szerokim spektrum pH.

Na końcu dodaliśmy bufor TE – jest to roztwór 10mM Tris:HCl pH 7.8, 1mM EDTA, służy do przechowywania wyizolowanego DNA, zmniejszając jego depurynację.

II. Przebieg doświadczenia

1. Niszczenie błony komórkowej, trawienie białek

Proces izolacji DNA z cebuli rozpoczęto od dokładnego jej rozdrobnienia. Dokładne rozdrobnienie miało na celu zwiększenie szybkości i wydajności działania odczynników na jej komórki. Następnie po 5ml rozdrobnionej cebuli zostało umieszczone w probówkach o pojemności 50ml i wymieszane z 10ml buforu do ekstrakcji (którego skład to roztwór: 3M NaCl, 0,4M Tris:HCl pH 7.8, 20mM EDTA, 2%SDS). Jego składniki umożliwiły lizę komórki. Kolejnym etapem było inkubowanie probówek w temperaturze 56C przez 10 minut, podczas czego ich zawartość była mieszana. Zapewniło to odpowiednie warunki do działania buforu. Po zakończeniu inkubacji cebula w probówkach była ugniatana bagietkami, a następnie roztwór został odwirowany, aby oddzielić fragmenty cebuli od roztworu zawierającego jej wstępnie przetrawione komórki.

2. Odbiałczanie

Pobrano po 1ml supernatantu przez każdą sekcję i umieszczono go w eppendorfkach, po czym pobrany roztwór został schłodzony na lodzie. Do każdej z probówek prowadzący dodał po 2ul proteinazy K, która odpowiada za trawienie białek. Po wymieszaniu zawartości probówki zostały umieszczone w termobloku ustawionym na temperaturę 55C na 30min. Takie warunki sprzyjają procesowi rozkładania białek przez proteinazę K.

3. Wytrącanie DNA

Po 30 minutach probówki zostały ponownie schłodzone na lodzie i dodano do nich zmrożony alkohol etylowy 96%, a następnie umieszczono je na 5 minut na suchym lodzie, gdzie inkubowały się w temperaturze -80C. Etanol usuwa z DNA płaszcz wodny, dzięki czemu ułatwia jego wytrącanie się w roztworze. Dodatkowo zamiast schłodzenia etanolu do -20C użyto suchego lodu o temperaturze -80C, ponieważ niska temperatura sprzyja uwalnianiu DNA do roztworu. Kolejnym etapem było odwirowywanie probówek przez 20 minut w wirówce przy maksymalnych obrotach (14 000 obr/min). Po zakończeniu wirowania można było zaobserwować niewielką ilość osadu zebraną na jednej ze ścianek probówki. Delikatnie zebrano supernatant znad osadu pobierając go powoli po ściance eppendorfki. Pozostawiono ją otwartą w statywie do wyschnięcia, do momentu aż odparuje alkohol etylowy i na dnie pozostanie sam osad. Po wysuszeniu osadu, kiedy probówki straciły zapach etanolu, dodano do nich 40ul buforu TE (o składzie: 10mM Tris:HCl pH 7.8, 1mM EDTA), który zapewnia trwałość wyizolowanego DNA i umieszczono je w szafie chłodniczej.

4. Analiza spektrofotometryczna próbki

Do próbki DNA została dodana nieznana ilość wody, tak, że jej całkowita objętość wynosiła 105ul – pomiar został wykonany przy użyciu pipety automatycznej. Następnie po wymieszaniu z próbki pobrano 2ul roztworu DNA i dodano 98ul wody. Do uprzednio skonfigurowanego spektrofotometru została włożona kuweta ze ślepą próbą, którą stanowiło 100ul wody, a następnie dokonano pomiaru na przygotowanej 100ul próbce DNA.

Wyniki pomiaru:

Stężenie [ug/ul]	260/280	260/230	A230	A260	A280	A320
0,1646	2.49	1.84	0,036	0,066	0,026	0,007

Zestawienie wyników z wynikami innych sekcji:

Sekcja	Stężenie [ug/ul]	260/280	260/230	A230	A260	A280	A320
2	0,2911	1,20	0,92	0,246	0,236	0,216	0,119
3	0,1630	2,13	1,64	0,039	0,064	0,030	-0,001
4	0,1071	3,31	4,30	0,010	0,043	0,013	-0,009
8	0,1646	2.49	1.84	0,036	0,066	0,026	0,007
9	0,1425	2,19	1,50	0,046	0,065	0,034	0,008
10	0,1899	1,66	0,80	0,095	0,076	0,046	0,029
11	0,3989	1,42	0,86	0,186	0,160	0,113	0,052
12	0,2465	1,66	0,90	0,110	0,100	0,600	0,001

Analiza wyników:

Obliczanie stężenia:
C[ug/ul] = (A260-A320) x rozcieńczenie x 0,5
C = (0,066-0,007) x 50 x 0,05 = 0,1475
C = 0,1475 ug/ul
(Różnica między stężeniem zmierzonym, a wyliczonym wynosi 0,171)

Ilość wyizolowanego DNA:
CxV = 0,1646ug/ul x 105ul = 15,4875 ug

Wydajność:
1ml wstępnie przetrawionego roztworu cebuli i buforu zawiera 1/3 ml cebuli (wynika to ze stosunku cebuli do buforu 1:2)
15,4875ug z 1/3ml
Wydajność wyniosła więc:
46,4625ug z 1000ul = 4,65%

Porównanie wydajności z wynikami pozostałych sekcji:

Sekcja	Stężenie [ug/ul]	Objętość [ul]	Ilość DNA [ug]	Wydajność [ug/ml]	Wydajność [%]
2	0,2911	107	31,1477	93,4431	9,34
3	0,1630	110	17,9300	53,7900	5,38
4	0,1071	15	1,6065	4,8195	0,48
8	0,1646	105	17,2830	51,8490	5,18
9	0,1425	99	14,1075	42,3225	4,23
10	0,1899	100	18,9900	56,9700	5,70
11	0,3989	106	42,2834	126,8502	12,69
12	0,2465	92	22,6780	68,0340	6,80

III. Wnioski

• Izolacja DNA jest długim i skomplikowanym procesem, błąd na którymkolwiek z jego etapów może uszkodzić materiał genetyczny i spowodować konieczność rozpoczęcia wszystkiego od początku.

• Ilość wyizolowanego DNA w stosunku do objętości próbki cebuli przed rozpoczęciem całego procesu jest znikoma – po odrzuceniu wyników sekcji 2,4 i 11, których wyniki znacznie odbiegają od normy (ze względu na błędy w obliczeniach lub z powodu zanieczyszczenia próbki), możemy stwierdzić, że wydajność reakcji wyniosła od 4,24% do 6,80%

• Analiza wyników:
  Stężenie DNA: 0,1646
  Wyrażone w mikrogramach na mikrolitr, uwzględnia rozcieńczenie próbki użytej do analizy, więc dotyczy ono roztworu DNA przed dodaniem wody.
  Wydajność: 5,18%
  Określa stosunek masy wyizolowanego DNA do objętości użytej cebuli
  Wyniki pomiaru absorpcji dla różnych długości fali:
  A230: 0,036 – zanieczyszczenia białkowe
  A260: 0,066 - DNA
  A280: 0,026 – Białka, aminokwasy, fenole
  A320: 0,007 – Wytrącenia w roztworze
  Stosunek 260/280: 2,49
  Powinien znajdować się w przedziale 1,50-1,80.
  Stosunek 260/230: 1,84
  Wartość tego współczynnika powinna być większa od 2,00; jego niższa wartość również wynika prawdopodobnie z wysokiej ilości zanieczyszczeń białkowych.

• Użyte odczynniki to:
  -NaCl, Tris:HCl, SDS, EDTA
  -Proteinaza K
  -Alkohol Etylowy 96%
  -Bufor TE