Biochemia ćwiczenia

Należy pracować w rękawiczkach:

możliwość zakażenia i zatrucia substancjami badanymi lub używanymi odczynnikami (toksyny, bakterie, substancje radioaktywne)

możliwość zakażenia badanych materiałów przez osoby pracujące w laboratorium

Preparaty biochemiczne są nietrwałe możliwość namnażania bakterii

roztwory należy sterylizować

materiał biologiczny i roztwory przechowujemy w chłodni lub mrozimy 

naczynia powinny być jednorazowe lub sterylizowane

Analiza chemiczna

• Jakościowa - określenie składu badanej substancji

• Reakcje charakterystyczne dla danego związku

• Ilościowa - określenie ilości badanej substancji

Stężenia

• mol/litr - M

• mikromol/litr - uM

• gram/litr - g/l

• miligram/mililitr - mg/ml

• C % = (masa substancji rozpuszczonej/masa roztworu) * 100%

Dysocjacja elektrolityczna

• NaCl → Na+ + Cl-

• H2O + H2O → H3O+ + OH-

Moc jonowa

gdzie: ci, zi - stężenie i ładunek jonu i,

Metody analityczne

Pierwszym etapem jest rozdział

• Badaną substancje można wydzielić przez:

• Zmiana mocy jonowej

• Wysolenie siarczanem amonu (dodatek rzędu 10-100% nasycenia ((NH4)2SO4

• Denaturacja - ogrzewanie lub dodanie czynnika denaturującego

• Filtracja lub wirowanie

• Chromatografia

• Elektroforeza

Chromatografia

• Polega na przepuszczaniu przez kolumnę roztworu białek. Kolumna jest to rura wypełniona złożem mającym taką właściwość że substancje w trakcie przepływu przez nią cieczy migrują z różną szybkością. Zbierając frakcje o określonej objętości dokonujemy rozdziału. Najpierw zbieramy substancje szybko migrujące przez kolumnę na na końcu te najwolniej migrujące

Kolumna chromatograficzna

Elektroforeza

Analiza ilościowa i jakościowa

• Metody ilościowe 

• Analiza wagowa

• Miareczkowanie

• Spektrofotometria

• Metody elektrochemiczne, np. elektrody jonoselektywne

• Metody Jakościowe

• Reakcje charakterystyczne

•  

• Obecnie podstawowe metody analityczne związane są ze spektrofotometria

• Spektrofotometria polega na pomiarze pochłaniania światła przez rozpuszczoną substancje.

• Światło ma charakter korpuskularno falowy co oznacza ze zachowuje się jak fale ale zarazem jak cząstki energii.

• Cząsteczki chemiczne maja ściśle określone poziomy energetyczne i mogą pochłaniać kwanty światła ściśle odpowiadające różnicom między tymi poziomami energetycznymi. Wynika z tego że dana substancja pochłania światło w bardzo specyficzny sposób,

• Jeśli naświetlimy barwny roztwór białym światłem zawierającym wszystkie kolory, to zaobserwujemy ze część światła została pochłonięta co powoduje zmianę barwy światła po przejściu przez badany roztwór.

• Roztwory miedzi maja kolor niebieski kobaltu różowy a niklu zielony.

• Różne substancje pochłaniają światło przy różnych długościach fali,

• alkohol etylowy pochłania fale świetlne w zakresie podczerwieni, na tej zasadzie działają profesjonalne mierniki stężenia alkoholu

• Białka i nukleotydy (ATP, kwasy nukleinowe) pochłaniają fale świetlne w zakresie UV nadfioletu

Spektrofotometria

• Są różne metody spektrofotometryczne, różniące się metodą pomiaru jak i długością fali przy której dokonujemy pomiarów.

• Można mierzyć bezpośrednio badaną substancje na przykład roztwory białek przy długości fali 280 nm lub też kompleksy barwne na przykład oznaczenia fosforanów metodą fiske subarowa lub białek przeprowadzając reakcje barwną z biuretem a nastepnie oznaczając stężenie tworzącego się barwnego kompleksu

• Można zbudować przyrząd , spektrofotometr wytwarzający światło monochromatyczne o jednej barwie , jednej długości fali a następnie zmieniać długość fali wytwarzanego światła.

• Jeśli takie światło przepuścimy przez badaną substancje i będziemy rejestrować zmiany pochłaniania tego światła w zależności od długości fali to otrzymamy widmo absorpcyjne danej substancji.

• Ponieważ wiadomo co jak absorbuje światło to z takiego widma można zorientować się co zawiera badana próbka. I tak białka absorbują w nadfiolecie przy długości fali ok. 280 nm (UV) a kwasy nukleinowe przy 260 nm (UV). Takie widma pozwalają określić skład i stężenie zawartych w roztworze substancji.

Spektrofotometr

Widmo absorpcyjne

Widmo jest to graficzny zapis zmian wartości absorbancji w zależności od długości fali przechodzącej przez badany roztwór. Głównymi parametrami widma są:

a - położenie pasm (wartość długości fali przy których na widmie można wyróżnić maksima; lmax)
b - molowy (lub właściwy) współczynnik absorpcji związany z danym maksimum.

Transmitancja i absorbancja

Jeśli badany roztwór pochłonie 90% promieniowania o danej długości fali, to powiemy, że jego transmitancja wynosi 10%, zaś absorbancja będzie wynosić lg(100/10)=1

Prawo Lamberta Beera

A = e·c·l

c =A/(e*l)

Ponieważ l = 1cm można zapisać c =A/e

e - molowy współczynnik absorpcji, równy liczbowo absorbancji, która wystąpiłaby, gdybyśmy mierzyli w danych warunkach roztwór o stężeniu 1 mol/dm3  przy grubości warstwy równej 1 cm;

c - stężenie mierzonego roztworu w mol/dm3;

l - grubość warstwy roztworu w cm.

Prawo Lamberta Beera

A = e·c·l

c =A/(e*l)

Ponieważ l = 1cm można zapisać c =A/e

e - molowy współczynnik absorpcji, równy liczbowo absorbancji, która wystąpiłaby, gdybyśmy mierzyli w danych warunkach roztwór o stężeniu 1 mol/dm3  przy grubości warstwy równej 1 cm;

c - stężenie mierzonego roztworu w mol/dm3;

l - grubość warstwy roztworu w cm.

• Najczęściej używa się wspólczynnika absorpcji wyrażonego w jednostkach w jakich wyrażamy stężenia badanych substancji. Dla białek są to mg/ml a nie mole

Prawo addytywności absorpcji

• Absorpcja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:

• 
  A = A1 + A2 + … An

• Gdzie: A1, A2, …, An są to absorbancje poszczególnych składników.

Pomiary spektrofotometryczne

• Najczęściej pomiary prowadzi się w kuwetach pomiarowych o długości drogi optycznej 1 cm, często kuwety nie są symetryczne i należy wkładać je do spektrofotometru we właściwy sposób

• Kuwety muszą być wykonane z materiału nie pochłaniającego promieniowania w zakresie długości fali przy których dokonujemy pomiaru.

• Dla nadfioletu (UV) używamy tylko kuwet kwarcowych oznaczonych literą Q, kuwety plastikowe lub szklane pochłaniają promieniowanie co uniemożliwiłoby pomiary

• Najprościej byłoby zmierzyć absorpcje podzielić przez współczynnik absorpcji i odczytać stężenie. W praktyce jest to niemożliwe bo roztwory pochłaniają światło w niespecyficzny sposób na skutek zmętnienia co więcej zawierają zanieczyszczenia np. ATP związek chemiczny bardzo mocno pochłaniający promieniowanie w zakresie nadfioletu (UV)

• Posługujemy się zmodyfikowanym wzorem do oznaczania stężenia

Abs(specyficzna) -Abs (niespecyficzna)

• C= ---------------------------------------

• współczynnik absorbcji

• Najprościej byłoby zmierzyć absorpcje podzielić przez współczynnik absorpcji i odczytać stężenie. W praktyce jest to niemożliwe bo roztwory pochłaniają światło w niespecyficzny sposób na skutek zmętnienia co więcej zawierają zanieczyszczenia np. ATP związek chemiczny bardzo mocno pochłaniający promieniowanie w zakresie nadfioletu (UV)

• Często oznaczamy nie bezpośrednio daną substancje a powstający w reakcji z nią barwny związek w takich wypadkach należy zastosować krzywą wzorcową gdyż reakcja barwna może zachodzić w różnym stopniu (odczynniki się starzeją)

• Przygotowujemy roztwór jak najbardziej zbliżony do roztworu badanego a następnie przygotowujemy kilka próbek zawierających mierzoną substancje o wzrastających stężeniach. dodajemy mierzoną substancje po zmierzeniu absorpcji rysujemy zależność absorpcji od stężenia i otrzymujemy krzywą wzorcową.

• Krzywe wzorcowe

• Roztwory wzorcowe powinny mieć podobny skład do próbki

• Krzywa wzorcowa powinna składać się co najmniej z czterech punktów

• Stężenia roztworów wzorcowych powinny być zbliżone do stężenia badanej próbki

• 1. Struktura pierwszorzędowa - czyli najniższy poziom organizacji strukturalnej cząsteczki jest wyznaczona przez sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Jest ona uwarunkowana jeszcze zanim zostanie zsyntetyzowany łańcuch polipeptydowy, gdyż informacja o kolejności aminokwasów w cząsteczce białka jest zakodowana w DNA, w postaci sekwencji nukleotydowej. Dzięki procesom transkrypcji, a później translacji sekwencja nukleotydowa zostaje odczytana w trakcie syntezy odpowiedniego polipeptydu.

• Czy mutacje są potrzebne?

• 2. Struktura drugorzędowa - są to typy regularnego ułożenia głównego łańcucha polipeptydowego stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Odkryto dwa podstawowe, regularne układy drugorzędowe występujące powszechnie w strukturze białek. Są to struktury a -helisy i b -harmonijki.

a -helisa

Struktura a -helisy ma kształt cylindra. Ciasno spleciony łańcuch główny polipeptydu tworzy centralną część cylindra, natomiast boczne łańcuchy reszt aminokwasowych wystają na zewnątrz w ułożeniu helikalnym.
Struktura a -helisy jest stabilizowana wiązaniami wodorowym grup NH i CO głównego łańcucha. Grupa CO każdego aminokwasu wiąże się wiązaniem wodorowym z grupą NH, aminokwasu odległego do przodu o cztery reszty aminokwasowe i leżącego bezpośrednio nad nią. Rezultatem tego jest fakt, że wszystkie grupy CO i NH łańcucha głównego są połączone wiązaniem wodorowym.

Budowa a-helisy

Struktura b -harmonijki (b -kartki)

Struktura b -harmonijki (b -kartki) - W odróżnieniu od cylindrycznej struktury a -helisy, cząsteczka polipeptydu przyjmuje kształt, prawie całkowicie rozciągnięty.

• W uformowaniu struktury b -harmonijki, może brać udział więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy.

Struktura trzeciorzędowa

Czynniki stabilizujące strukturę trzeciorzędową białek

Wiązania wodorowe

Oddziaływania hydrofobowe

Wiązania jonowe

Kowalencyjne mostki dwusiarczkowe

Oddziaływania międzycząsteczkowe

Struktura czwartorzędowa

• Struktura czwartorzędowa powstaje po przez łączenie się kilku podjednostek białkowych.

• Stabilizują ją te same siły co strukturę trzeciorzędową

Krwinki czerwone
Najbardziej znane elementy morfotyczne krwi to krwinki czerwone, czyli erytrocyty. W jednym milimetrze sześciennym znajduje się średnio 5,4 miliona erytrocytów u mężczyzn i 4,8 miliona u kobiet.
Ich główną rolą jest przenoszenie tlenu z płuc do tkanek. Te funkcje zapewnia obecność hemoglobiny - czerwonego barwnika krwi. Hemoglobina składa się z białka - globiny - oraz z czterech cząsteczek hemu. W hemie ważny jest atom żelaza, który wiąże się z jedną cząsteczką tlenu, tworząc oksyhemoglobinę. Żelazo posiada tę zdolność jedynie na drugim stopniu utlenienia; karboksyhemoglobina, tworząca się z połączenia hemu z tlenkiem węgla. Ten ostatni związek wypiera tlen z oksyhemoglobiny, czyniąc hemoglobinę bezużyteczną.

Krwinka

Budowa hemoglobiny

Hem

• Cztery wiązania koordynacyjne atomu żelaza wiążą się z 4 azotami grup pierścieni pirolowych piąte z tlenem a szóste z białkiem przez pierścień imidazolowy histydyny

• Regulacja allosteryczna polega na wiązaniu aktywatora lub inhibitora enzymu w innym miejscu niż następuje wiązanie substratu

Mioglobina i hemoglobina

Mioglobina jest białkiem wiążącym i magazynującym tlen. Największe jej stężenie znajduje się w mięśniach szkieletowych odpowiedzialnych za ruch oraz w sercu.
Mioglobina jest niewielkim białkiem globularnym o masie około 18 kDa. Nie ma budowy podjednostkowej,

Hemoglobina jest białkiem allosterycznym

Wiązanie tlenu z jedną z podjednostek, wpływa na oddziaływanie pozostałych podjednostek z tlenem. Po związaniu pierwszej cząsteczki tlenu do pierwszej kolejne cząsteczki tlenu przyłączają się coraz łatwiej

Wiązanie tlenu przez mioglobinę i hemoglobinę

• Mioglobina najmocniej wiąże tlen przy niskim wysyceniu tlenem

• Hemoglobina wiąże tlen słabo przy niskim wysyceniu tlenem a przy większym wysyceniu tlenem wiąże tlen mocno

Efekt Bohra

W zależności od pH zmienia się powinowactwo tlenu do hemoglobiny.

W pracujących mięśniach pH się obniża (środowisko ulega zakwaszeniu) co ułatwia dysocjację tlenu.

Siła wiązania tlenu w środowisku kwaśnym jest mniejsza niż w zasadowym.

Hemoliza krwi

• Krwinka czerwona zawiera 280mln cząsteczek hemoglobiny

• Umieszczenie krwinek w czystej wodzie prowadzi do pękania błony krwinek czerwonych i uwolnienia cząsteczek hemoglobiny

• W roztworze izotonicznym błonę można usunąć rozpuszczając ją w rozpuszczalnikach organicznych (eter aceton)

Wpływ tlenu na absorpcje światła przez hemoglobinę

• Hemoglobina pochłania światło w zależności od stopnia utlenowania

• Po związaniu tlenu absorbuje światło przy 578 nm i 540 nm (żółta i zielona barwa)

• Po uwolnieniu tlenu (warunki redukujące roztworu np.. Dodatek dwutionianu sodu) ma barwę czerwono fioletową 565 nm

• Hemoglobina wiąże 300 razy mocniej tlenek węgla i absorbuje światło przy 572 nm i 535 nm

Ilościowe oznaczanie hemoglobiny

Odczynniki

• 0,04% NH3

• Na2S2O4 (dwutionian sodu - reduktor))w stanie stałym

•  

• Krew z opuszka palca 0,1 ml wprowadzić do 9,9 ml 0,04% roztworu NH3, Następnie dodać kilka kryształków Na2S2O4. Powstaje fioletowe zabarwienie.

• Oznaczać względem wody przy 570 nm spektrofotometrycznie.

• Równolegle zmierzyć absorpcje wzorcowego roztworu hemoglobiny. Stężenie hemoglobiny liczyć według wzoru

• Apróby

• Chemoglobiny= Chwzorca *---------------

• A wzorca

• Amoniak dodany by przeciwdziałać wytrącaniu się białek

Oznaczanie hemoglobiny na podstawie zawartości żelaza

Odczynniki

Cząsteczka hemoglobiny zawiera 0,34% Żelaza. Z ilości żelaza można obliczyć zawartość hemoglobiny

• Odczynniki

• 72% roztwór HClO4

• Perhydrol

• 25% roztwór amoniaku

• 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego

• Roztwór wzorcowy żelaza10 μg/ml. Rozpuścić 86,3 mg

12 hydratu siarczanu żelazowo-amonowego w wodzie z dodatkiem 10 ml stężonego H2SO4 i uzupełnić wodą do1000 ml.

Wykonanie

• Do probówki wprowadzić 0,05 ml krwi następnie dodać0,2 ml HClO4 i 0,2 ml perhydrolu. Ogrzewać na wrzącej łażni wodnej do całkowitego odbarwienia roztworu. Po mineralizacji dodać 0,5 ml 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego i 1 ml roztworu NH3 uzupełnić wodą do 5 ml i oznaczać absorbancje przy 420 nm wobec próby kontrolnej (skład ten sam ale bez krwi)

• Oznaczenia w roztworach wzorcowych żelaza analogicznie jak w badanej próbie

• Apróby

• μg Fe w próbie=------------------μg Fe w roztworze wzorcowym

• Awzorca 

• Obliczenie stężenia hemoglobiny we krwi 

Apróby

• Hb [%] =------------------ * (μg Fe w roztworze wzorcowym)* 0,59

• Awzorca

Trawienie białek

• Żołądek

Sok żołądkowy (kwas solny)

Denaturacja białek

Pepsyna A ( dno żołądka)

Pepsyna B (część odźwiernikowa)

Rozkładają zdenaturowane białko do dużych

polipeptydów, hydrolizują wiązania peptydowe

utworzone przez aminokwasy aromatyczne, dikarboksylowe

Trzustka

• Trypsyna

działa swoiście na wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy zasadowe

• Chymotrypsyna

działa swoiście na wiązania peptydowe utworzone przez aminokwasy pozbawione ładunku elektrycznego(np. a. aromatyczne)

• Elastaza

działa na wiązania peptydowe utworzone przez małe aminokwasy (glicynę, alaninę, serynę)

• Karbosypeptydaza

działa na C-końcowe wiązania peptydowe

• Jelito cienkie

• Aminopeptydaza

działa na N-końcowe wiązania peptydowe

• Dipeptydazy

rozkladają dipeptydy do wolnych aminokwsów

Wchłanianie aminokwasów

• Wchłanianie odbywa się poprzez transport aktywny

• Transportowane są naturalne izomery aminokwasów

• W transporcie uczestniczy witamina B6 (fosforan pirydoksalu)

• Aminokwasy transportowane są przez rąbek szczoteczkowy (miejsce wchłaniania: jelitoczcze)

Aminokwasy egzogenne

• Aminokwasy egzogenne (nazywane też aminokwasami niezbędnymi - jest to grupa aminokwasów, które nie mogą być syntetyzowane w organizmie zwierzęcym i muszą być dostarczane w pożywieniu, w przeciwieństwie do aminokwasów endogennych. Żywienie pokarmami ubogimi w aminokwasy niezbędne może doprowadzić do zaburzeń chorobowych. Do aminokwasów niezbędnych dla człowieka zalicza się 10 aminokwasów egzogennych

Aminokwasy niezbędne
egzogenne

• Histydyna (His)

• Arginina (Arg)

• Izoleucyna (Ile)

• Leucyna (Leu)

• Lizyna (Lys)

• Metionina (Met)

• Fenyloalanina (Phe)

• Treonina (Thr)

• Tryptofan (Trp)

• Walina (Val

Aminokwasy endogenne

• Aminokwasy endogenne - to aminokwasy, które organizm zwierzęcy może syntetyzować samodzielnie, w przeciwieństwie do aminokwasów egzogennych, które musi przyjmować systematycznie wraz z pożywieniem.

• Aminokwasy nie niezbędne
  endogenne

• Alanina (Ala)

• Asparagina (Asn)

• Kw. asparaginowy (Asp)

• Cysteina (Cys)

• Glutamina (Gln)

• Kw. glutaminowy (Glu)

• Glicyna (Gly)

• Prolina (Pro)

• Seryna (ser)

• Tyrozyna (Tyr)

• aminokwasy nie mogą być magazynowane,

• nadmiar aminokwasów jest na bieżąco przerabiany, wykorzystywany na potrzeby energetyczne

• grupa aminowa jest odłączana

• szkielet węglowy jest przekształcany w acetylokoenzymA (acetylo-CoA) pirogronian lub jeden z intermediatów cyklu Krebsa

• Z aminokwasów mogą powstawać kwasy tłuszczowe, ciała ketonowe lub glukoza

• Wydalanie jest procesem fizjologicznym polegającym na usuwaniu z organizmu szkodliwych produktów przemian związków azotowych (amoniak,mocznik,kwas moczowy),dwutlenku węgla oraz wody i nadmiaru soli mineralnych i innych związków zbędnych dla organizmu.

• Nadmiar azotu może być wydalany przez zwierzęta jednym z trzech sposobów:

• W postaci amoniaku (zwierzęta wodne)

• W postaci kwasu moczowego (ptaki)

• W postaci mocznika - dotyczy ludzi

• Wśród aminokwasów wyróżnić można zasadniczo na trzy grupy.

• (1) Te, które w procesie spalania dochodzą do acetylo-CoA,

• (2) te, które w procesie spalania dochodzą do pirogronianu

• (3) te, które przekształcają się do któregoś ze związków pośrednich cyklu Krebsa

• Taki podział aminokwasów wynika z odmiennych losów, jakie mogą te aminokwasy spotkać.

• Aminokwasy metabolizujące się bezpośrednio do acetylo-CoA mogą ulec tylko i wyłącznie spaleniu.

• Aminokwasy metabolizujące się do pirogronianu lub związków cyklu Krebsa mogą zamieniać się na glukozę i  po wejściu w cykl pentozowy dostarczać wodoru do syntezy kwasów tłuszczowych i cholesterolu.

• Wydajność energetyczna aminokwasów

• Zakładając, że proporcje pomiędzy poszczególnymi aminokwasami są takie, jak to przedstawiono w tabeli, ze 100g białka można uzyskać łącznie 22.5 mola ATP. Jest to wartość porównywalna z węglowodanami, gdzie, ze 100g glukozy uzyskuje się 21 moli ATP.

• Zakładając maksymalną sprawność zamiany białka na glukozę. Ze 100g białka uzyskać można 69g glukozy. (Wartość ta zależy oczywiście od proporcji aminokwasów w danym białku.)

Transaminacja

Wyjątki

Oksydacyjna deaminacja glutaminianu

NAD -Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy

• Jedna cząsteczka NADH pozwala wyprodukować 2,5 cząsteczki ATP

NAD i
NADP

CYKL MOCZNIKOWY


Rozpoczyna się od połączenia wolnych jonów NH4+ i HCO3 - w wyniku czego powstaje karbamoilofosforan.
Reakcja katalizowana jest przez syntetazę karbamoilofosforanową, jest praktycznie nieodwracalna bo zużyciu ulegają dwie cząsteczki ATP

Grupa karbamoilowa karbamoilofosforanu, ze względu na obecność wiązania bezwodnikowego, charakteryzuje się wysokim potencjałem przenoszenia. W reakcji katalizowanej przez
karbamoilotransferazę ornitynową jest ona przenoszona na ornitynę (atom azotu), co prowadzi do powstania cytruliny.

Cytrulina ulega kondensacji z asparaginianem, kosztem energii hydrolizy ATP do AMP i PPi (pirofosforanu), który jest donorem drugiej grupy aminowej włączanej do mocznika.

Liaza argininobursztynianowa rozszczepia cząsteczkę argininobursztynianu do argininy i fumaranu.
W ten sposób łańcuch węglowy asparaginianu zostaje zachowany w postaci fumaranu.

Ostatecznie argininę hydrolizuje arginaza, powstaje mocznik i ornityna. Ornityna jest transportowana z powrotem do mitochondrium gdzie rozpoczyna się kolejny cykl. Mocznik powstały w wyniku cyklu mocznikowego jest wydalany. Człowiek w ciągu roku wydala około 10 kg mocznika.

Sumaryczny zapis reakcji cyklu mocznikowego

• CO2 + NH4+ + 3 ATP + asparaginian + 2 H2O

• mocznik + 2 ADP + 2 Pi + AMP + PPi + fumaran

Schemat cyklu mocznikowego

• MOCZNIK Jest to główny końcowy metabolit przemiany białkowej. Stężenie mocznika we krwi jest wypadkową produkcji która zachodzi wyłącznie w wątrobie i nerkowego wydalania, zwiększa się ona wraz z wiekiem.

• ZAKRES WARTOŚCI PRAWIDŁOWYCH
  Norma dla mocznika 2,5-6,4 mmol/l lub 15 - 39 mg/100ml
  WARTOŚCI PODWYŻSZONE
  Zwiększenie stężenia mocznika jest prawie zawsze dowodem upośledzonej czynności wydalniczej nerek.
  - dieta bogata w białka
  - nadmierny katabolizm białek w ustroju (gorączka, posocznica)
  - krwawienie do przewodu pokarmowego
  - niewydolność nerek
  - niewydolność pozanerkowa np. zwężenie moczowodów.

Oznaczanie mocznika metodą ureazową

• Surowicę lub krew pełną zadaje się ureazą która rozkłada mocznik na amoniak. Po strąceniu białek wprowadza się odczynnik Nesslera dający z amoniakiem żółte zabarwienie w wyniku tworzenia się jodku amidortęciowego(II)

•  

• 2K2HgI4 + 3NaOH + NH4OH რ O(Hg2)NH2I +4KI +3NaI +3H2O

odczynniki

• preparat ureazy

• 3% roztwór Na2SO4

• 10% roztwór ZnSO4

• 0,5 M roztwór NaOH

• wzorcowy roztwór NH4Cl zawierający 0,01 mg N w 1 ml ( 25 ml roztworu NH4Cl o stężeniu 1,53 mg/ml + 10 ml 1 M H2SO4 dopełnić do 1 l)

• odczynnik Neslera

• w kolbie rozpuścić 30 g KI dodać 22g jodu + 30 g metalicznej rtęci.

• Mieszaninę wstrząsać . zdekantować roztwór znad metalicznej rtęci. I uzupełnić wodą do 400 ml.

• Roboczy odczynnik Neslera: do75 ml roztworu macierzystego dodać 75 ml wody i 350 ml 10% NaOH. Powstały po kilku dniach osad odwirować. Klarowny roztwór używać do oznaczeń. Przechowywać w ciemnej butelce.

• Fenyloketonuria

• Fenyloketonuria jest chorobą genetyczną spowodowana mutacją genu kodującego enzym hydroksylaze fenyloalaninową

• Chorobę rozpoznaje się u ok. 1 na 15000 dzieci, ale częstość jej występowania jest różna w różnych populacjach

• .

• Mutacja powoduje upośledzenie aktywności enzymatycznej PAH, który katalizuje przekształcanie w organizmie aminokwasu fenyloalaniny w inny aminokwas tyrozynę. We krwi dziecka chorego na fenyloketonurię zaczyna gromadzić się fenyloalanina i produkty jej metabolizmu, przy względnym niedoborze tyrozyny. Na skutek tego po pewnym czasie i przy braku odpowiedniego leczenia dochodzi do uszkodzenia mózgu. Szkodliwe produkty są szczególnie niebezpieczne dla układu nerwowego podczas jego rozwoju. Dlatego wśród dzieci robi się testy na fenyloketonurie. Obecnie sądzi się że również dla dorosłych te metabolity są niezdrowe.

• Mechanizm fentloketonurii

Dziedziczenie fenyloketonurii

• Choroba dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny - oznacza to, że dziecko musi odziedziczyć wadliwy allel od obojga rodziców, żeby rozwinęła się choroba. Chorobę rozpoznaje się u ok. 1 na 15000 dzieci, ale częstość jej występowania jest różna w różnych populacjach.

Glukoza

• Naszym źródłem energii jest pokarm. Energię kumulują wszystkie podstawowe składniki pożywienia - białka, tłuszcze i węglowodany.

• Głównym paliwem organizmu pozostaje tylko jeden z nich - glukoza - cukier pochodzący z przemian niemal wszystkich strawnych węglowodanów.

• Po poziomie glukozy organizm rozpoznaje dostatek lub deficyt energetyczny.

• Glukoza jest głównym źródłem energii dla naszego mózgu. Mózg zawsze potrzebuje glukozy.

Homeostaza glukozy

• Homeostaza glukozy jest wypadkową dopływu glukozy do krwi oraz jej zużycia w komórkach, ważną rolę w jej utrzymaniu odgrywają procesy metaboliczne w mięśniach szkieletowych i wątrobie.

• Wpływ na przebieg procesów metabolicznych w tkance mięśniowej wywiera wiele czynników, wśród nich są czynniki genetyczne, regulacja hormonalna a także stężenie substratów. Wśród hormonów biorących udział w tej regulacji najważniejszymi są insulina i glukagon.

Glukoneogeneza  

Glukoneogeneza to enzymatyczny proces tworzenia przez organizm glukozy z metabolitów nie będących węglowodanami, np. aminokwasów, glicerolu czy mleczanu. Głównym substratem jest pirogronian.

Glikogenoliza

• Glikogenoliza - rozkład glikogenu do glukozo-6-fosforanu (w mięśniach) lub do glukozy (w wątrobie) powodujący uzupełnienie chwilowego niedoboru glukozy w różnych tkankach organizmu m.in. we krwi. Proces pobudzany przez adrenalinę i glukagon.

Insulina

• Insulina to hormon peptydowy o działaniu ogólnoustrojowym, odgrywający zasadniczą rolę w metabolizmie węglowodanów, lecz także białek i tłuszczów.
  Nazwa insulina z łac. insula - wyspa, pochodzi od wysepek Langerhansa trzustki, gdzie insulina jest produkowana.

• Insulina produkowana jest przez komórki β (komórki B) wysp trzustki. Najważniejszym bodźcem do produkcji insuliny jest poposiłkowe zwiększenie stężenia glukozy we krwi. Insulina sygnalizuje stan nasycenia substratami energetycznymi i stymuluje ich magazynowanie oraz syntezę białek

• Stymuluje syntezę glikogenu w mięśniach i wątrobie

• Przyspiesza w wątrobie glikolizę co zwiększa syntezę kwasów tłuszczowych.

• Powoduje wnikanie glukozy do mięśni i tkanki tłuszczowej

Glukagon

• to hormon produkowany w trzustce przez komórki alfa o działaniu przeciwstawnym do insuliny, podwyższający poziom glukozy we krwi. Działa głównie na wątrobę

• Stymuluje rozkład glikogenu i glukoneogenezę

Inhibuje syntezę kwasów tłuszczowych , glikolizę

• W czasie wysiłku fizycznego dochodzi do zwiększonego wykorzystywania substratów energetycznych, zwiększone zostaje ich uwalnianie z magazynów tkankowych i udostępnianie do przemian.

• Głównym substratem energetycznym, zwłaszcza w pierwszym etapie pracy mięśniowej, jest glukoza pochodząca z glikogenu, krążąca we krwi oraz syntetyzowana w wątrobie. Jednakże zapasy glukozy zmagazynowane w formie glikogenu w mięśniach i wątrobie nie są zbyt duże i przy dłużej trwającym wysiłku fizycznym szybko ulegają całkowitemu wyczerpaniu.

• Po zakończeniu pracy następuje resynteza glikogenu, który to proces jest stymulowany przez insulinę

Regulacja poziomu glukozy w organizmie

• Regulacja poziomu glukozy we krwi związana jest z pracą trzustki, która wytwarza insulinę (pobudzającą przetwarzanie glukozy w glikogen i ułatwiającą transport glukozy z krwi do komórek) oraz glukagon (wytwarzany przez wysepki Langerhansa i pobudzający rozkład glikogenu do glukozy), a także z wątrobą i mięśniami tak jak wątroba magazynującymi nadmiar glukozy w postaci glikogenu: w przypadku niedoboru glukozy zmagazynowany w wątrobie i mięśniach glikogen zostaje szybko rozłożony do glukozy.

• Nadmiar węglowodanów jest przekształcany w organizmie człowieka w tłuszcze i magazynowany w tkance podskórnej.

Poziom glukozy we krwi

• Tkanką, która zawsze potrzebuje glukozy jest mózg, dlatego zachowanie homeostazy tego cukru jest ważne dla prawidłowej pracy organizmu.

• We krwi stężenie glukozy wynosi ok. 90mg na 100cm3. W czasie intensywnego wysiłku fizycznego jej stan może spaść nawet do 70mg/100cm3, jednak dopiero spadek poziomu tego cukru poniżej 60mg jest określany, jako hipoglikemia i staje się niebezpieczny.

• Gdy stan obniżonego poziomu glukozy utrzymuje się dłużej następuje hiperglikemia (odbicie organizmu na skutek niskiego poziomu glukozy, mechanizmy kompensujące, głównie hormon wzrostu powoduje wzrost poziomu cukru we krwi), której objawami są drgawki, utrata przytomności, a często również odwodnienie organizmu i groźne w skutkach zaburzenie ciśnienia krwi.

hipoglikemia

• Organizm w czasie hipoglikemii jest zmobilizowany, aby dostarczyć do mózgu jak najwięcej glukozy, gdyż nie gromadzi on zapasów glukozy jak np. wątroba lub mięśnie, by korzystać z nich w trakcie hipoglikemii. Hormonami podnoszącymi stężenie glukozy we krwi są:

• adrenalina

• glukagon

• kortyzol

• hormon wzrostu

•    Adrenalina i glukagon podnoszą stężenie glukozy we krwi przez 2-4 godziny po hipoglikemii. Kortyzol i hormon wzrostu zaczynają działać po ok. 3-4 godzinach i efekt podniesienia stężenia glukozy we krwi utrzymuje się od 5 do 12 godzin po hipoglikemii.

Homeostaza glukozy - schemat

Oznaczanie glukozy

• Wszystkie badania dotyczące stężenia glukozy we krwi wykonuje się na czczo.

• Po posiłkach stężenie glukozy wzrasta.

• Krew ma właściwości glikolityczne, wskutek czego zawartość zawartość cukru we krwi wyrażnie maleje z czasem. Zapobiegamy dodając fluorek sodu 3mg/ml

• Krew odbiałcza się koloidalną zawiesiną ZnOH. Przesącz gotuje się z roztworem zawierającym Cu(ii) i Cu(I) wypada z roztworu w postaci Cu2O. Tlenek miedzi rozpuszcza się w odczynniku arsenomolibdenowym, dając niebieskie zabarwienie.

Odczynniki

• 1) 0,45% ZnSO4

• 2) 0,1 M NaOH

• 3) Odczynnik miedziowy I. W 600 ml wrzącej wody rozpuścić 200g bezwodnego Na2SO4. Oddzielnie w 100 ml wody rozpuścić 25 g soli Seignetta (winianu sodowopotasowego). Obydwa roztwory zmieszać dodać 20 g wodorowęglanu sodu i 25 g węglanu sodu i dopełnić do 1 l.

• Przesączyć. Przechowywać w 37oC. ( może się wytrącać).

• 4) Odczynnik miedziowy II 15% roztwór CuSO4 *5H2O + 2 krople H2SO4

• 5) mieszaninę roztworów miedziowych (I i II) w stosunku 1: 25 sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

• 6) Odczynnik arseno molibdenowy. Rozpuścić 25 g molibdenianu (VI) amonowego w 450 ml wody. Dodać 31 ml stęzonego H2SO4. Rozpuścić 3 g arsenianu(V) sodowego (Na2HAsO4*7H2O) w 25 ml wody. Oba roztwory zmieszać. Inkubować w temp 37oC przez 48 h. Przechwywać w ciemnej butelce.

• 7) Roztwór wzorcowy glukozy o stężeniu 200 mg/100 ml.

Wykonanie

• Przygotować mieszaninę ZnSO4 i 0,1 M NaOH w stosumku 5:1. Do 2,9 ml mieszaniny dodać 0,1 ml krwi z opuszki palca. Próbkę grzać we wrzącej łażni wodnej 5 min.

• Po ostudzeniu przesączyć.

• Do 1 ml przesączu dodać 1 ml odczynnika 5 (miedziowego) i gotować na łażni 20 min. Po ostudzeniu dodać 1ml odczynnika arseno-molibdenowego i wstrząsać aż rozpuści się tlenek miedzi. Dodać 7 ml wody i oznaczać spektrofotometrycznie przy długości fali 660 nm.

• Analogicznie postępować ze wzorcem. Pobrać 0,1 ml roztworu wzorcowego z przyrządzonych roztworów w zakresie 10 do 200 mg/100ml.

Obliczenia

• W tym zakresie krzywa ma charakter liniowy

• Stężenie wynosi

• •mg glukozy /100ml=(Ap/Aw) * Cw*

• •Cw= stężenie glukozy we wzorcu

• Zadaniem cyklu Krebsa jest utlenić związek o nazwie: acetylokoenzym A (acetylo-CoA) do 2 cząsteczek dwutlenku węgla (CO2), pozyskaną w tym procesie energię ulokować w chemicznych nośnikach energii: GTP, NADH i FADH2.
  
  Sumaryczny wzór cyklu Krebsa to:
  
  acetylo-CoA + GDP + Pi + 3NAD+ + FAD + 2H20 →

CoA + GTP + 3NADH + 3H+ + FADH2 + 2CO2

Powstają wysokoenergetyczne związki wymagające tlenu

Jeśli zabraknie substratów to reakcja nie będzie zachodziła 3NAD+ + FAD

• Zadaniem cyklu Krebsa jest utlenić związek o nazwie: acetylokoenzym A (acetylo-CoA) do 2 cząsteczek dwutlenku węgla (CO2), pozyskaną w tym procesie energię ulokować w chemicznych nośnikach energii: GTP, NADH i FADH2.
  
  Sumaryczny wzór cyklu Krebsa to:
  
  acetylo-CoA + GDP + Pi + 3NAD+ + FAD + 2H20 →

CoA + GTP + 3NADH + 3H+ + FADH2 + 2CO2

Powstają wysokoenergetyczne związki wymagające tlenu

Jeśli zabraknie substratów to reakcja nie będzie zachodziła 3NAD+ + FAD

• Sumaryczna reakcja glikolizy przekształcenia glukozy w pirogronian jest następująca:

glukoza + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ →

• → 2 cząsteczki pirogronianu + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O.

• Jeśli zabraknie substratów to reakcja nie będzie zachodziła

przy braku tlenu, podczas intensywnego wysiłku, ilość wytwarzanego NADH przekracza zdolność łańcucha oddechowego do utleniania NADH z powrotem do NAD +.

W warunkach tlenowych pirogronian zostaje przekształcony w acetylo-CoA (dehydrogenaza pirogronianowa)

pirogronian + NAD+ + CoA → acetylo-CoA + CO2 + NADH.

przy braku tlenu, podczas intensywnego wysiłku, ilość wytwarzanego NADH przekracza zdolność łańcucha oddechowego do utleniania NADH z powrotem do NAD +.

Brak NAD + powoduje że pirogronian syntetyzowany w mięśniu szkieletowym podczas glikolizy zostaje przekształcony w mleczan przez dehydrogenazę mleczanową w reakcji generującej NAD+, dzięki czemu glikoliza w dalszym ciągu wytwarza ATP.

Próg mleczanowy

• Próg Mleczanowy zwany, progiem przemian beztlenowych, progiem anaerobowym jest obciążeniem treningowym, po którego przekroczeniu stężenie kwasu mlekowego we krwi wzrasta

• Po przekroczeniu tego poziomu energia dostarczana jest w wyniku procesów beztlenowych. Po przekroczeniu progu mleczanowego zmniejszeniu ulega udział wolnych kwasów tłuszczowych w procesie dostarczania energii.

• W czasie wysiłku powstaje mleczan, jako produkt uboczny przemian metabolicznych. Krąży we krwi i jest neutralizowany. Stężenie mleczanu we krwi wzrasta wraz z intensywnością wysiłku, gdy powstaje go więcej niż organizm może neutralizować - to ten moment nazywamy progiem mleczanowym.

• Przyjmuje się, że mniej niż 2 mmol/l (milimole na litr) jest typowe dla spoczynku,

• 2 - 4 mmol/l to wartość optymalnego treningu,

• 4 - 8 mmol/l zakwaszenie mięśni jest już znaczne,

• powyżej 8 mmol/l organizm włącza mechanizmy obronne - ATP nie może być dalej resyntezowane, komórki mięśniowe przestają pracować i wysiłek musi zostać przerwany.

• Badanie stężenia mleczanu we krwi, zarówno spoczynkowe jak i wysiłkowe,jest bardzo precyzyjnym testem diagnozującym wydolność i zdolność regeneracji człowieka. Przyjmuje się, że próg mleczanowy osiągany jest przy wartości tętna 85% HRmax,

• Żeby kolejne testy były ze sobą porównywalne należy je przeprowadzać o podobnych godzinach. Najlepszą porą na przeprowadzenie testu jest poranek. Związane jest to z cyklem okołodobowym, podczas którego wiele wskaźników ulega wahaniom. W dniu badań należy ograniczyć picie kawy a na 3 godziny przed testem spożywania posiłków. Jeżeli podczas badań będzie oznaczana morfologia krwi, należy przyjść na czczo

Hrmax (HEART RATE)

• Formuła Sally Edwards - dosyć dokładna metoda obliczania HRmax, bo uwzględnia wagę i płeć.
  Mężczyźni HRmax = 210 - 1/2 wieku - 1% masy ciała w funtach + 4
  Kobiety HRmax = 210 - 1/2 wieku - 1% masy ciała w funtach + 0
  kiedyś liczono: Hrmax= 220 - wiek, bo błąd tutaj zwykle nie przekracza 5%

• 220 bo takie tempo bicia serca noworodka

Trening podprogowy

• ćwicząc w tej strefie (tzw. trening podprogowy) stopniowo podnosimy LT (lactate threshold -próg mleczanowy), w efekcie przy większej intensywności dłużej zostajemy w strefie tlenowej, co jest dla organizmu bardzo korzystne.

• Częsty trening ponadprogowy (anaerobowy) obniża nasz LT, w konsekwencji wydolność stopniowo spada, czas regeneracji się wydłuża, nękają nas różne dolegliwości, gdyż stały ,wysoki poziom mleczanu we krwi obniża odporność.

• Ważne jest przemyślane i kontrolowane przekraczanie progu mleczanowego.

Strefy HR

Strefa 0 (do 50% HRmax) - przebywanie w tej strefie nie przynosi korzyści ze sportowego punktu widzenia

Strefa 1 (50 - 60% HRmax) - obserwuje się korzyści dla kondycji i zdrowia. Dla początkujących lub osób po długiej przerwie w ćwiczeniach. W strefie tej zachodzi już wykorzystanie tłuszczu jako źródła energii, polecana więc jest także dla osób pragnących schudnąć.

Strefa 2 (60 - 70% HRmax) - Jest to pierwsza strefa w której serce zaczyna odnosić korzyści z treningu. Następuje poprawa wydolności serca a komórki mięśniowe zaczynają lepiej wykorzystywać tlen. W tej strefie tłuszcz jest podstawowym źródłem energii jest więc to idealny przedział dla osób pragnących schudnąć.

Strefa 3 (70 - 80% HRmax) - Najlepsza strefa dla poprawiania wydajności sercowo-naczyniowej. Rekomendowana dla poprawy wydolności oddechowej, poprawy transportu utlenionej krwi do komórek mięśniowych i odprowadzania z nich dwutlenku węgla. Organizm spala mniej glukozy niż tłuszczu, poprawia się ogólna siła mięśniowa.

Strefa 4 (80 - 90% HRmax)(85-90%= próg beztlenowy) - w tej strefie przechodzi się od treningu aerobowego (tlenowego) do anaerobowego(beztlenowego). Organizm nie jest już w stanie efektywnie usuwać kwasu mlekowego z pracujących mięśni. Kwas mlekowy jest produktem rozkładu glikogenu, udział tłuszczu jako źródła energii staje się znikomy. Jest to strefa dla osób pragnących poprawic wyniki sportowe. Podczas treningu w tej strefie mięśnie męczą się znacznie. Organizm w tej strefie uczy radzić sobie lepiej z kwasem mlekowym i tolerować go przez dłuższy czas.

• Strefa 5 (90 - 100% HRmax)(VO2 Max) - W tej strefie można trenować przez krótki czas. Nie należy trenować bez bardzo dobrej kondycji. Kwas mlekowy powstaje bardzo szybko gdyż dług tlenowy jest bardzo wysoki. Następuje poprawa szybkości
  
  powyższe metody obliczeń oraz opisy stref odnoszą się do ćwiczeń opartych w głównej mierze na pracy dolnej połowy ciała, ze szczególnym naciskiem na marsz i biegi.

• Aby wyliczać progi i korzystać ze stref w przypadku ćwiczeń angażujących górną połowę ciała trzeba obniżyć progi - średnio o 13 uderzeń serca na minutę.

Dług tlenowy

• dług tlenowy, stan fizjologiczny organizmu lub jego narządu związany z czasowym (zwykle krótkotrwałym) przestawieniem procesów oddychania komórkowego z tlenowego na beztlenowy); po przywróceniu warunków tlenowych część energii zużywana jest na zmetabolizowanie nagromadzonych produktów oddychania beztlenowego i odbudowanie rezerw substratów oddechowych wykorzystywanych w warunkach beztlenowych

---